1 引言
基于点击化学的生物正交反应荧光探针因其高灵敏度、良好的选择性、优越的生物相容性和实时可视化检测等优势吸引了广泛的关注[1-2]. 生物正交的概念最早由Carolyn R. Bertozzi教授于2004年提出, 其中“正交”表示互不干扰, 意味着这些反应在活细胞或活体中不会产生任何代谢影响, 同时生物体系微环境中的其他物质也不会影响化学反应的进行[3]. 目前, 生物正交反应主要分为以下几类: (1) 铜催化的偶极环加成反应(Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition, CuAAC), 该反应是在铜催化剂存在下, 叠氮和炔基进行快速的环加成反应[4-6]. 该反应具有选择性高、反应速率快、反应条件温和等优点, 但是铜离子的细胞毒性在一定程度上限制了该反应的应用. (2) 应变促进叠氮-炔烃的环化加成反应(Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition, SPAAC), 该反应是叠氮-炔基环加成的无铜版本[7-9]. 它依赖于使用应变环辛烷或双环辛烷衍生物, 该反应具有CuAAC的优点同时又避免使用具有生物毒性的铜催化剂. (3) 逆电子需求的Diels-Alder 反应(Inverse Electron Demand Diels-Alder, IEDDA), 在这个反应中二烯和亲二烯体通过快速的IEDDA反应形成环加成化合物, 通常是反式环辛烯(TCO)或环炔作为亲二烯体和四氮嗪作为二烯体[10-14]. 该反应同样具有高特异性、反应速率快、无需催化剂和生物正交特性. (4) 施陶丁格缩合反应(Staudinger Ligation), 该反应利用叔胺和膦的缩合反应形成酰胺[15-17]. 这种反应是生物正交的, 因为它同样具有选择性的, 并且可以在温和的生理条件下发生. 这些生物正交反应在生物标记和成像等研究领域展现了广泛的应用前景.
相比于传统生物正交反应, 光介导/光催化的生物正交反应可通过外源光方便地进行控制, 在时间分辨等方面表现出色[18-19]. 近年来, 光催化的生物正交反应引起了广泛关注, 其中一些反应在生物大分子的偶联修饰等方面展现了潜在应用价值. 例如, 陈以昀课题组[20-21]通过在柚皮苷上修饰N-酰氧基邻苯二甲酰亚胺, 通过可见光诱导产生烷基自由基, 实现了C(sp3)—C(sp)的自由基偶联反应. 他们验证了这一光催化的生物正交偶联反应在生命体系中具有良好的特异性与生物相容性. 此外, 张艳课题组[22]报道了无需催化剂参与的菲醌和富电子烯烃的[4＋2]环加成光化学反应, 该反应在生命体系中快速发生且不与体系中的其他亲核物种发生副反应. 这一可见光诱导的偶联反应为在活细胞内的应用提供了更多安全有效的策略. 此外, 1,3-偶极环加成反应也在生物正交化学中得到深入研究, 余志鹏课题组[23]通过构建二芳基取代的悉尼酮, 利用紫外光照射加速1,3-偶极中间体的生成, 大大提高了中间体的活性, 并成功地应用于活细胞中不同多肽以及蛋白质的偶联标记, 为生物正交偶联反应的研究提供了有力工具. 陈鹏、樊新元课题组[24]通过740 nm近红外光(NIR)激活苯酚保护基团并释放生物活性分子(如荧光探针、前药及蛋白质)实现活体动物内生物过程的精准时空操控, 为衰老研究、肿瘤治疗等领域的活体分子动态调控提供了高时空分辨率的新范式.
与亲二烯体通过IEDDA反应实现荧光激活的1,2,4,5-四氮嗪(Tetrazine)作为生物正交“手柄”的研究取得了实质性进展[25-27]. 1,2,4,5-四氮嗪以其小分子体积和较高的反应速率而在生物标记和成像领域备受青睐. 据我们所知, 目前尚未有关于无需催化剂参与的基于四氮嗪的光介导生物正交探针的研究报道[28-32]. 在本研究中, 我们引入了1,8-萘酰亚胺到具有生物正交反应活性的四氮嗪基团上, 设计并合成了一种无需催化剂参与的光介导生物正交荧光探针, 通过理论计算阐释了该探针的猝灭机制和荧光激活机制. 最为关键的是, 365 nm紫外光显著提高了该探针与trans-cyclooctene (TCO)的反应速率. 通过高分辨质谱和反应路径计算, 我们揭示了光对生物正交反应的促进是通过克服探针与TCO之间的环加成反应能垒实现的. 在此基础上, 该探针成功地在细胞和多细胞生物(秀丽隐杆线虫)水平上实现了光介导生物成像. 最后, 通过引入吗啉基团设计并合成了溶酶体靶向的光介导生物正交荧光探针, 并成功实现了对溶酶体的靶向光介导生物正交成像. 这些研究成果为开发具有生物正交性质的荧光探针提供了新的设计思路, 并在生物成像领域展现了潜在的应用前景.
2 结果与讨论
2.1 结构与合成
为了制备基于生物正交反应的开启型荧光探针, 选取了1,8-萘酰亚胺作为荧光团, 四氮嗪作为生物正交手柄设计了生物正交荧光探针NATz. 首先, 1,8-萘酰亚胺母核因为其具荧光量子产率高、生物相容性好等特点被广泛应用于荧光探针的开发. 其次, 四氮嗪具有快速反应和不干扰生命过程的特点已经被作为广泛使用的生物正交基团. 同时四氮嗪的强烈淬灭效果可以将萘酰亚胺的荧光完全淬灭, 在与环辛烯发生快速的逆电子需求Diels-Alder反应(IEDDA)后实现荧光的开启. NATz的合成如Scheme 1所示, 先用水合肼将对溴苯腈转化为对溴苯四氮嗪(Tz-1), 然后通过Suzuki偶联反应将溴转变为苯硼酸频哪醇酯(Tz-2). Tz-2最后通过Suzuki偶联反应与4-溴-1,8-萘酰亚胺衍生物(NA-1)生成基于生物正交反应的荧光探针NATz. 合成的中间体通过核磁共振氢谱(见支持信息图S1~S3)确认了结构, 新的化合物则通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、高分辨质谱进行了表征(见支持信息图S4~S9).
2.2 NATz的基本光物理性质
紫外可见吸收光谱显示探针NATz的最大吸收峰在356 nm处(图1a), 使用含时密度泛函理论(Time- Dependent Density Functional Theory, TD-DFT)对其进行激发态计算后获得的模拟吸收光谱最大吸收为374 nm(图1a), 考虑到理论计算的理想模型与实测环境的差距, 可以认为模拟光谱与实测光谱相符合[33-34]. 通过对各个激发态信息分析发现第四激发态(S4)的振子强度 (f=0.7345)为计算的所有激发态中最高的(见支持信息表S1), 因此其最大吸收主要归属为基态(S0)到第四激发态(S4)的吸收跃迁. 对S4进行空穴电荷分析[35]发现其空穴和电荷主要分布在萘酰亚胺母体和四氮嗪上, 呈现局域电荷转移的特征(图1b). 综上可以将NATz的最大吸收归属于局域的电荷转移吸收. 实验结果表明NATz与TCO反应1 h后最大吸收红移至363 nm处(图1c), 与文献报道的四氮嗪发生生物正交反应后的紫外吸收变化一致[36-40]. 同时以四氮嗪与TCO发生IEDDA反应产物(NATz-TCO)为模型的理论计算光谱与实测的NATz与TCO作用后吸收光谱几乎保持一致(图1c). 对其激发态进行分析后发现其第一激发态(S1)为振子强度(f=0.6142)最大的激发态(见支持信息表S2), 这表明NATz与TCO反应后最大吸收主要归因于反应产物S0到S1的跃迁吸收. 对S1进行空穴电荷分析表明发生IEDDA反应后的四氮嗪部分不再参与电荷跃迁的贡献. 因此通过对理论计算以及实测吸收光谱的分析证实了NATz能够与TCO发生反应使得其激发态跃迁改变最终导致其紫外可见吸收光谱发生小幅度红移.
图1 (a)、(c)实测(实线)和模拟的(虚线)紫外光谱; NATz (b)和NATz-TCO (d)激发态的空穴电荷分布和前沿轨道贡献, 其中蓝色等值面代表空穴, 绿色等值面代表电荷. (e)与TCO反应后的NATz荧光光谱(实线)和激发光谱(虚线). (f)不同溶剂中与TCO反应后的NATz荧光强度(H->L表示HOMO能级至LUMO能级的跃迁)Figure 1 (a), (c) The measured (solid line) and calculated (dashed line) UV spectra; The hole charge distribution and frontier orbital contributions for the fourth excited state of NATz (b) and NATz-TCO (d) with blue isosurfaces representing holes and green isosurfaces representing charges. (e) The fluorescence spectrum (solid line) and excitation spectrum (dashed line) of NATz after the reaction with TCO. (f) The fluorescence intensity of NATz after reacting with TCO in different solvents (H->L represents the transition from the highest occupied molecular orbital (HOMO) to the lowest unoccupied molecular orbital (LUMO)) |
对比NATz与TCO反应前后荧光发射光谱发现, 反应1 h后NATz在450 nm (λEx=356 nm, 图1e)处的荧光有了明显的增强(见支持信息图S10a), 这一结果表明NATz通过生物正交反应激活实现荧光的开启. 在不同溶液中的荧光光谱测试发现, 在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的荧光增强倍数最大, 为对照组的17倍, 其余溶剂体系的荧光增强效果不明显(图1f、支持信息图S10). 同时还观察到其最大发射波长从二氧六环(1,4-Dioxane)中的432 nm红移至了磷酸盐缓冲液(PBS)中的450 nm. 最大发射波长随着溶剂极性的增大而发生显著红移, 是分子内电荷转移跃迁(Intramolecular Charge Transfer, ICT)的重要特点. 结合TD-DFT对激发态的计算和分析(图1d), 认为NATz与TCO反应产物的荧光发射归属于分子内电荷转移跃迁. 最重要的是NATz在水溶液中与TCO的生物正交反应的荧光开启率高于有机溶剂中, 这有利于NATz在以水为主要液体环境的细胞和生物体内的成像应用.
2.3 NATz的荧光淬灭与开启机理
NATz系列荧光探针由1,2,4,5-四氮嗪和萘酰亚胺荧光团组成, 四氮嗪为高度缺电子基团对大部分荧光团具有强烈的淬灭效应. 目前关于四氮嗪猝灭机理主要有荧光共振能量转移(FRET)[41-42]、跨键能量转移(TBET)[43]、光诱导电子转移(PET)[44]等. 此前, 刘小刚等[45]提出了通过前线分子轨道(Frontier Molecular Orbital, FMO)能量差预测分子是否发生PET过程的方法. 该方法认为当LUMO与LUMO＋1或者HOMO与HOMO－1的能级差小于约0.6 eV时, 分子会发生PET过程(图2a). 因此, 为了探究NATz的淬灭机制我们使用DFT对NATz进行了FMO计算. 结果如图2b, NATz的LUMO与LUMO＋1能级差为0.27 eV, 同时其HOMO与HOMO－1的能级差为0.23 eV, 两者的能级差均小于0.6 eV. 因此根据此前的理论可以认为NATz主要通过PET过程实现荧光的淬灭.
图2 (a)通过前沿轨道能级差预测PET过程的概念图解; (b) NATz轨道能级差和电子分布示意图; (c) NATz激发态信息和前线轨道电子的相应分布; (d) NATz-TCO的激发态信息以及相应的前线轨道电子分布Figure 2 (a) Conceptual illustration predicting the PET process through the energy level difference of frontier orbitals; (b) Schematic diagram depicting the orbital energy level difference and electron distribution of NATz; (c) Depiction of NATz's excited state information and corresponding distributions of frontier orbital electrons; (d) Excited state information of NATz-TCO along with corresponding distributions of frontier orbital electrons |
同时通过TD-DFT进行激发态计算和分析有利于更加深入地理解NATz的淬灭和发光机理. 如图2c所示, 分子吸收光子后, 电子主要从S0跃迁至振子强度最高的S4, 跟据卡沙规程S4的电子会通过迅速的内转化过程跃迁至能量较低的S1(电子云集中分布于四嗪基团上), 如图2c所示. 同时S1的振子强度(f)小于0.01, 表明了NATz的S1为非辐射弛豫的暗态. 因此NATz通过PET过程将电子转移至四氮嗪基团实现了荧光的淬灭. 在发生IEDDA的生物正交反应后四氮嗪基团被破坏, 反应产物的S1为高振子强度(ƒ=0.68)的荧光发射态(图2d), 此时激发态的电子通过辐射弛豫回到基态使得分子恢复了荧光. 综上, NATz通过PET机制实现了荧光的淬灭, 在与TCO发生生物正交反应后生成荧光发射产物从而实现了基于生物正交反应的开启型荧光发射.
2.4 光介导生物正交反应发生
文献报道了一些四氮嗪与荧光团偶联化合物在光照下四氮嗪会转变为氰基从而导致荧光开启的案例[46]. 为了探究NATz与TCO的反应是否会被光照干扰, 我们进行了避光和光照组的实验对比. 首先在避光条件下将TCO加入NATz的水溶液(PBS)中反应不同时间后进行荧光光谱测试, 结果如图3a所示, 随着作用时间(0 h、1 h、24 h、48 h、72 h)的增加, 荧光强度持续增强. 避光反应1 h后在450 nm处的荧光增强倍数仅为3.6倍, 与正常暴露于室内光线下的结果(≈17倍)相比荧光增长率有了明显的降低(图1f、支持信息图S10a), 由此可见, 光照能够影响到NATz与TCO的反应. 在避光的条件下需要经过约72 h, 其荧光强度才能增加约42倍.
图3 (a)~(c)不同条件下NATz荧光光谱; (d) 不同条件下450 nm处NATz的荧光强度. 1: NATz; 2: NATz＋TCO (1 h); 3: NATz＋TCO (24 h); 4: NATz＋TCO (48 h); 5: NATz＋TCO (72 h); 6: NATz＋TCO (1 h)＋UV (10 min); 7: NATz＋UV (10 min)Figure 3 (a)~(c) Fluorescence spectra of NATz under diverse conditions; (d) Fluorescence intensity at 450 nm under diverse conditions. 1: NATz, 2: NATz＋TCO (1 h), 3: NATz＋TCO (24 h), 4: NATz＋TCO (48 h), 5: NATz＋TCO (72 h), 6: NATz＋TCO (1 h)＋UV (10 min), 7: NATz＋UV (10 min) |
值得注意的是在TCO与NATz反应1 h后将反应整个暴露于365 nm紫外灯(23.6 mW/cm2)下持续照射10 min后进行测试, 结果发现其荧光增强倍数高达约132倍(图3b). 仅从当前的结果分析, 似乎光照才是引起NATz荧光增强的主要原因. 为了验证这一点, 我们进行了NATz的光激活测试, 结果如图3c所示, 在365 nm光照10 min其荧光增强效果与TCO避光反应1 h相当, 而相比同时加入TCO和施加紫外光照的实验组而言, 其荧光增强效果几乎可以忽略不计(图3c). 光激活测试和TCO的生物正交反应测试结果(图3d)表明单独的紫外光照或者TCO的IEDDA生物正交反应均不能导致其荧光显著增强, 而TCO的IEDDA生物正交反应加上紫外光照才是促使其荧光显著增强的主要原因. 根据上述现象我们推测紫外光(365 nm)可能是TCO与NATz发生IEDDA反应的“催化剂”(图4a).
图4 (a) TCO和四氮嗪衍生物之间光介导反应的概念图; (b) NATz的高分辨率质谱; (c)与TCO反应1 h后NATz的高分辨率质谱; (d) NATz与TCO反应1 h加紫外线照射10 min后的高分辨率质谱Figure 4 (a) Conceptual diagram depicting the photocatalytic reaction between TCO and tetrazine; (b) High-resolution mass spectrum of NATz; (c) High-resolution mass spectrum of NATz after one hour of reaction with TCO; (d) High-resolution mass spectrum of NATz after one hour of reaction with TCO followed by 10 min of UV light exposure |
2.5 光介导生物正交反应机理
为了验证光介导NATz与TCO的IEDDA反应机制, 我们对避光反应的体系和光照反应的体系分别进行了高分辨质谱测试. 结果如图4所示, 未加TCO的NATz高分辨质谱中仅能找到NATz的[M＋H]+分子离子峰(482.1817)和[M＋Na]+分子离子峰(504.1638)(图4b). 与TCO反应后的体系中检测到了NATz-TCO的[M＋H]+分子离子峰(578.2646)(图4c), 证实NATz与TCO发生了IEDDA反应生成了产物NATz-TCO. 最重要的是光照的实验组中NATz-TCO的[M＋H]+分子离子峰(578.2651)强度显著高于避光组的(图4c, 4d), 这一结果说明光照下生物正交反应的产物明显增加. 同时在光照后的高分辨质谱中并没有发现四氮嗪转化为氰基的产物(计算的[M＋H]+分子离子峰为413.4525, 见支持信息图S11), 结合光照下NATz与TCO体系的荧光增强倍数约是避光条件下的20倍(图3d), 我们认为是光照促进了NATz与TCO的生物正交反应, 即光介导了NATz与TCO的生物正交反应.
2.6 理论计算光介导生物正交机理
通常四氮嗪与TCO的发生生物正交反应机理如图5a所示[47-48], 首先四氮嗪衍生物(Tz)与TCO发生IEDDA环加成反应生成中间体2, 然后中间体2脱去一分子氮气生成中间体3, 之后中间体3发生电子重排生成中间体4, 最后中间体4发生氧化脱氢生成最终的反应产物. 值得注意的是类似D-A反应的IEDDA环加成同样会经历一个环加成的过渡态, 通过过渡态搜索我们获得了其过渡态结构TS(图5b). 反应路径计算表明从NATz与TCO的第一步环加成过程并不是自发进行的, 其需要克服0.09 eV的能垒. 直至脱氢氧化前每一步都有较大幅度的能量降低, 具体的从TS到中间体2能量降低1.47 eV, 中间体2脱氮气生成中间体3能量降低1.09 eV, 中间体3的异构化能量也降低了0.19 eV. 因此以上步骤理论上都是能自发进行的. 中间体4的脱氢氧化需要吸收0.51 eV的能量(图5c), 该过程可以通过吸收前面步骤释放的能量进行, 因此我们认为决定整个生物正交反应速度的是第一步环加成到达过渡态需要克服的能垒. 在避光条件下反应体系可以从环境中(37 ℃)获得热量以克服该能垒, 由于环境热量较低导致其反应速度缓慢. 光照条件下NATz吸收光子后能量升高变为激发态, 由于NATz的荧光被PET过程几乎完全淬灭, 其激发态的能量不会通过辐射弛豫消耗. 因此在存在TCO的体系中该能量被用于克服体系的能垒, 最终使得NATz与TCO的生物正交反应速率大大提升. 综上, NATz通过吸收365 nm的紫外光克服IEDDA第一步的反应能垒最终实现了光介导生物正交反应.
图5 (a)四嗪和TCO之间的IEDDA反应路径示意图; (b)四氮嗪衍生物与TCO环加成反应的过渡态和反应途径; (c)四氮嗪衍生物和TCO环加成过程中不同中间体的能量分布Figure 5 (a) Illustration of the IEDDA reaction pathway between tetrazine and TCO; (b) Transition states and reaction pathway for the cycloaddition reaction between tetrazine and TCO; (c) Energy profiles of different intermediates in the cycloaddition process of tetrazine and TCO |
2.7 光介导生物正交成像
得益于探针NATz在水(PBS)溶液中的光介导生物正交反应特性和其高效的荧光开启效率, 我们在细胞和多细胞模式生物秀丽隐杆线虫上使用NATz进行了光介导生物正交荧光成像. 为了避免NATz本身的毒性干扰细胞正常的生理活动从而影响荧光荧光成像结果, 我们进行了细胞毒性测试. 结果发现40 μmol/L的NATz对三种癌细胞(肺癌A549、肝癌HepG2、宫颈癌Hela)和两种正常细胞(正常肝细胞LO2、人正常肺上皮细胞BEAS-2B)的细胞生长抑制率均不超过30%(图6c). 这一结果表明NATz具有良好的生物相容性, 在成像工作浓度(10 μmol/L)下几乎不会干扰细胞正常的生理活动. 因此使用10 μmol/L探针孵育细胞后再加入TCO孵育相同时间, 然后在紫外光照射10 min后使用激光共聚焦系统进行荧光成像结果采集. 如图6a所示, 在加入TCO同时给予光照实验组的细胞内蓝色荧光强度显著高于对照组, 其平均荧光强度约为对照组的2.85倍(图6d). 这一结果说明NATz能够在细胞内实现光介导生物正交反应激活的荧光成像. 在细胞内成功的成像结果鼓励下, 我们进一步在多细胞模式生物秀丽隐杆线虫体内进行了生物正交荧光成像. 结果如图6b所示, 加入TCO同时给予光照实验组的线虫体内蓝色荧光显著增强, 其平均荧光强度约为对照组的1.88倍(图6e). 这一结果说明NATz在多细胞生物体内也能实现光介导的生物正交荧光成像. 综上所述, NATz是一个对生物系统几乎不产生毒性的良好的光介导生物正交成像荧光探针. 这为生物靶点标记、药物作用机制等研究提供了一个可靠便捷的可视化检测工具.
图6 (a) NATz在HepG2细胞内的光介导正交成像; (b)秀丽隐杆线虫体内NATz的光介导正交成像; (c) NATz (40 μmol/L)的细胞毒性评价; (d)图(a)中细胞内平均荧光强度; (e)图(d)中线虫体内的平均荧光强度. 比例尺: 10 μm或200 μm. **: P<0.01, ***: P<0.001Figure 6 (a) Photocatalytic orthogonal imaging of NATz within HepG2 cells; (b) Photocatalytic orthogonal imaging of NATz inside the body of elegant hidden worms (C. elegans); (c) Cellular toxicity assessment of NATz (40 μmol/L); (d) Average fluorescence intensity within cells as depicted in (a); (e) Average fluorescence intensity within worms as shown in (d). scale bar: 10 μm/200 μm. **: P<0.01, ***: P<0.001 |
2.8 溶酶体靶向光介导生物正交成像
溶酶体作为一个重要的功能性亚细胞器在细胞代谢、能量摄取、物质回收利用和程序性细胞死亡等过程中发挥着重要作用, 因此使用可视化工具对溶酶体进行原位观察有利于更好地理解和调控溶酶体参与的生物过程[49-50]. 因此我们在NATz的基础上进行了结构改造, 保持四氮嗪基团不变的前提下在萘酰亚胺母体上引入了具有溶酶体靶向能力的吗啉基团设计合成了荧光探针Lyso-NATz(图7a). Lyso-NATz的结构通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和高分辨质谱进行了表征确认了结构(图S7~S9). 在相同的测试条件下进行了光介导生物正交荧光测试, 结果如图7b所示在TCO和光照条件下Lyso-NATz的荧光强度增强了45倍, 表明Lyso-NATz同样具有光介导的生物正交荧光开启能力. 细胞毒性测试表明Lyso-NATz同样具有优良的生物相容性(图7c). 为了验证Lyso-NATz的亚细胞器靶向能力, 我们在细胞内进行了Lyso-NATz与商业化溶酶体定位剂LysoTracker Red的荧光共定位测试. 结果如图7d所示, 探针Lyso-NATz在蓝色通道和红色通道的荧光信号高度重合, 计算探针Lyso-NATz与商业溶酶体染料LysoTracker Red的皮尔逊系数为0.87, 这一结果证明了探针Lyso-NATz具有优秀的溶酶体定位能力. 综上所述, 基于生物正交反应的荧光探针Lyso-NATz在保持了生物正交荧光激活的前提下具有良好的溶酶体靶向能力, 可作为溶酶体可视化跟踪检测的重要工具, 对于涉及溶酶体功能的生理过程的检测具有重要意义.
图7 (a) Lyso-NATz的合成路线; (b) Lyso-NATz光介导催化激活荧光光谱; (c) Lyso-NATz细胞毒性评价; (d) Lyso-NATz与溶酶体标记物的共定位成像(LysoTracker Red). 比例尺: 10 μmFigure 7 (a) Synthesis pathway of Lyso-NATz; (b) Photocatalytic orthogonal fluorescence spectra of Lyso-NATz; (c) Evaluation of cellular toxicity for Lyso-NATz; (d) Co-localization imaging of Lyso-NATz with lysosomal markers (LysoTracker Red). scale bar: 10 μm |
3 结论
本工作首先设计合成了基于1,2,4,5-四氮嗪的生物正交荧光探针NATz分子, 使用DFT和TD-DFT计算清晰阐述了其PET的荧光淬灭机制, 当四氮嗪基团发生生物正交反应后, PET过程被破环导致荧光恢复, 实现了基于生物正交反应的荧光开启. 光谱测试发现365 nm的紫外光对NATz与TCO反应的荧光开启具有明显的增强效果, 通过高分辨质谱和反应路径计算确认了其光介导机理是: NATz吸收光子获得克服IEDDA环加成步骤的能垒, 从而大幅度促进了整个生物正交反应的速率. 细胞毒性测试和光介导生物正交荧光成像成功证明了NATz是一个具良好生物相容性的生物正交荧光探针. 最后通过结构修饰设计合成了具有溶酶体靶向的生物正交荧光探针Lyso-NATz, 实验证明该探针不仅保持了光介导生物正交荧光开启的特征, 同时还具备了溶酶体的特异性靶向能力. 综上所述, 光介导的生物正交荧光探针具有高效的荧光开启效率、优良的生物相容性和可修饰调控的多功能原位荧光成像能力. 预计在药物作用机理、靶点标记、细胞代谢过程分析等领域有着广泛的应用前景.
4 实验部分
4.1 仪器与试剂
对溴苯腈(4-Bromobenzonitrile, 纯度98%)、3-巯基丙酸(3-Mercaptopropionic Acid, 纯度99%)、乙腈(纯度99.9%)、联硼酸频那醇酯(纯度98%)、盐酸(HCl, 纯度95%)、无水醋酸钾(AcOK, 纯度99%)、三乙胺(TEA, 纯度99.5%)、四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4, 纯度99%)、[1-双(二苯基磷)二茂铁]二氯化钯(PdCl2(dppf), 纯度99.9%)、1,4-二氧六环(Dioxane, 纯度99%)、 4-溴-1,8-萘二甲酸酐(纯度98%)、二氯甲烷(DCM, 99.9%)、5-氨基戊酸乙酯盐酸盐(纯度97%)和N-(2-氨乙基)吗啉(纯度99%)购于上海阿达玛斯试剂公司. 水合肼(98%)购于赛默飞世尔化学试剂公司Sigma-Aldrich; 无水乙醇(EtOH, 纯度99.8%)、二甲基亚砜(DMSO, 纯度99.5%)和甲醇(纯度99.8%)购于上海Greagent试剂公司. AVANCE NEO 400M型核磁共振波谱仪(400-NMR), 瑞士Bruker公司; 高分辨质谱(Agilent-1100), 美国安捷伦公司; EYELAN-1100型旋转蒸发仪, 日本东京理化; 荧光分光光度计(F97XP), 上海棱光科技; 紫外可见分光光度计(T9), 北京普析通用仪器公司; 荧光显微镜(BX5), 日本奥林巴斯公司; 激光共聚焦(FV10i), 日本奥林巴斯公司.
4.2 化合物合成
4.2.1 NATz的合成
将化合物NA-1 (544.6 mg, 1.4 mmol)、Tz-2 (459 mg, 1.5 mmol)、Pd(PPh3)4 (30 mg, 0.042 mmol)、K2CO3 (386 mg, 2.8 mmol)加入到双口烧瓶中, 加入1,4-二氧六环和水. 在氩气保护下回流6 h, 反应结束后减压蒸馏除去反应溶剂. DCM溶剂萃取, 合并有机相, 无水硫酸钠干燥有机相, 经过硅胶柱(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=8:1)纯化, 最后得到红色固体223 mg, 即化合物NATz, 收率为35.0%. 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ: 8.79 (d, J=8.0 Hz, 2H), 8.72~8.62 (m, 2H), 8.29 (s, 1H), 7.82~7.72 (m, 4H), 4.30 (t, J=7.1 Hz, 2H), 4.12 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.16 (s, 3H), 2.47 (t, J=7.5 Hz, 2H), 2.13 (p, J=7.3 Hz, 2H), 1.25 (t, J=7.1 Hz, 3H). 13C NMR (100 MHz, Chloroform-d) δ: 172.93, 167.57, 164.22, 145.60, 143.02, 132.26, 131.98, 131.45, 130.84, 129.83, 128.73, 128.20, 127.88, 122.94, 59.69, 38.50, 31.19, 22.67, 21.27, 14.24. HRMS (ESI) m/z: [M＋H]+ calcd for C27H24N5O4 482.1823, found 482.1817.
4.2.2 Lyso-NATz的合成
化合物NA-2 (136 mg, 0.35 mmol)、Tz-2 (125 mg, 0.41 mmol)、 PdCl2(dppf) (25 mg, 0.035 mmol)、Cs2CO3 (266 mg, 0.82 mmol)依次加入至反应烧瓶. 后续步骤与NA1类似, 硅胶柱(V(二氯甲烷):V(甲醇)=300:1~120:1)纯化, 最后得红色固体120 mg, 即化合物Lyso-NATz, 收率为25%. 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ: 8.79 (d, J=8.0 Hz, 2H), 8.67 (dd, J=12.1, 7.4 Hz, 2H), 8.30 (d, J=8.5 Hz, 1H), 7.79 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.76 (dd, J=8.0, 4.0 Hz, 3H), 4.40 (t, J=6.9 Hz, 2H), 3.71 (t, J=4.6 Hz, 4H), 3.16 (s, 3H), 2.76 (t, J=6.9 Hz, 2H), 2.64 (s, 4H). 13C NMR (100 MHz, Chloroform-d) δ: 169.22, 167.28, 165.03, 153.61, 144.06, 142.90, 136.23, 135.57, 134.63, 131.90, 131.08, 129.64, 128.50, 128.21, 127.73, 126.11, 113.48, 43.01, 39.23, 32.09, 29.74, 21.24. HRMS (ESI) m/z: [M＋H]+: calcd for C27H25N6O3 481.1988, found 481.1982.
4.3 理论计算方法
4.4 光谱测试方法
4.4.1 基础光谱测试
准确称取一定质量的NATz和Lyso-NATz溶解在DMSO中制备为2 mmol/L的储备液待用. 取适量储备液稀释至磷酸盐缓冲溶液中(PBS)使得探针终浓度为10 μmol/L, 对照组不加TCO, 实验组加入100 μmol/L TCO, 37 ℃水浴条件下室内(不避光)反应1 h后使用双光路方法进行紫外光谱测试并收集数据. 然后同样的实验组设置进行荧光光谱测试并收集数据. 不同溶剂中与TCO反应测试: 取适量储备液分别稀释至不同溶剂使得探针终浓度为10 μmol/L, 加入相同量的TCO (100 μmol/L)后放置于37 ℃水浴条件下孵育1 h, 然后分别进行荧光光谱测试.
4.4.2 光介导生物正交光谱测试
取适量储备液稀释至PBS溶液中使得探针终浓度为10 μmol/L, 然后加入100 μmol/L TCO. 放置于37 ℃水浴条件下避光反应1 h、12 h、48 h、72 h后分别测试荧光光谱. 光介导的实验组在相同温度条件下孵育, 只是孵育完后使用365 nm的紫外灯(光功率密度为23.6 mW/cm2)照射10 min, 之后测试荧光光谱. 作为对照在10 μmol/L探针溶液中不加TCO进行相同时间的紫外灯照射后进行荧光光谱测试.
4.5 细胞和线虫成像方法
4.5.1 细胞荧光成像方法
取贴壁生长的HepG2细胞共两皿, 移除培养基后加入PBS缓冲液. 一组为对照组, 另一组为实验组. 在实验组中加入适量NATz储备液使得其终浓度为10 μmol/L, 放入二氧化碳细胞培养箱中孵育1 h, 孵育完成后再加入终浓度为100 μmol/L的TCO, 对照组只加入NATz, 不加入TCO. 将两组细胞放入二氧化碳培养箱孵育1 h, 孵育完成, 手持365 nm紫外灯对实验组光照20 min后进行激光共聚焦荧光成像.
4.5.2 Lyso-NATz细胞共定位荧光成像
取贴壁生长的HepG2细胞, 移除培养基后加入PBS缓冲液. 加入适量NATz储备液使得其终浓度为10 μmol/L, 放入二氧化碳细胞培养箱中孵育1 h, 孵育完成后再加入终浓度为100 μmol/L的TCO, 放入二氧化碳培养箱孵育1 h, 移除带有探针的PBS溶液后, 加入1 mL PBS缓冲溶液和1 μL 的浓度为2 mmol/L的商用溶酶体定位剂孵育约20 min后进行共聚焦显微荧光成像.
4.5.3 线虫荧光成像方法
测试涉及的线虫为野生N2型秀丽隐杆线虫(C. elegans)的L4阶段. 将清洗处理好的线虫分装到1.5 mL的离心管中, 加入1 mL M9缓冲溶液待用. 实验组中加入终浓度为10 μmol/L的NATz后, 避光孵育1 h, 然后加入终浓度为100 μmol/L的TCO试剂, 避光孵育1 h. 对照组加入终浓度为10 μmol/L的NATz后, 避光孵育2 h. 两组线虫同时置于365 nm紫外下20 min. 最后, 为了避免线虫活动导致无法采集荧光照片, 加入0.4%甲醛溶液固定30 min. 移取少量线虫于载玻片制样后于荧光显微镜采集荧光成像照片.
(Cheng, B.)