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Acta Chimica Sinica >

2025 , Vol. 83 >Issue 9: 1000 - 1005

DOI: https://doi.org/10.6023/A25040126

Article

Study on the Producing of Tumor Neoantigen Peptide Vaccines

  • Qiang Liu a, b ,
  • Xinyao Liu b ,
  • Yuan Zu c ,
  • Hongguo Hu , b, * ,
  • Wenbing Yao , a, c, *
Expand
  • a School of International Pharmaceutical Business, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China
  • b Chongqing Yaopharma Co., Ltd., Chongqing 401121, China
  • c School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China
* E-mail: ;

Received date: 2025-04-20

  Online published: 2025-06-13

Supported by

National Natural Science Foundation of China(82073754)

Natural Science Foundation of Chongqing, China(CSTB2023NSCQ-BSX0012)

Fold

Abstract

Tumor neoantigen peptides, characterized by tumor-specific mutations and aberrant gene expression profiles, demonstrate superior immunogenicity and minimal off-target effects. Neoantigen peptide vaccines are able to activate the immune system, break immune tolerance, and induce tumor cell cytotoxicity through enhanced antigen-specific T-cell responses, thereby emerging as promising candidates for personalized cancer immunotherapy. However, due to their personalized characteristics, the current commercial production of tumor neoantigen peptide vaccines face challenges in difficult synthesis, long preparation cycles and complex purification processes, which limit their widespread clinical applications. To address these issues, this study proposes a novel method utilizing fragmented peptide resin storage, in which the shared Link-NitraTh peptide sequence is first synthesized, and then it is used as the starting material for the subsequent preparation of full-length neoantigen peptides. This approach reduces the overall synthesis cycle from two months to one month, significantly shortening the production time for synthetic peptides and increasing the accessibility of neoantigen peptide vaccines for clinical patients. Additionally, optimization of the shared Link-NitraTh synthesis method greatly improves the purity of crude neoantigen peptides and simplifies the purification process, enabling robust production of neoantigen peptide vaccines with stringent quality control and acceptable manufacturing time. Using this method, twelve tumor neoantigen peptides, each comprising thirty-eight amino acids, can be efficiently produced within twenty-three working days to meet clinical demands. The quality specifications for neoantigen peptides include: purity>95% by high-performance liquid chromatography (HPLC), conversion to the acetate salt form and trifluoroacetate residue<1%, mass exceeding 20 mg, and endotoxin level below 10 EU/mg. This work has achieved significant progress in the design and optimization of the tumor neoantigen peptide preparation process, and established a standardized operational framework including parameter optimization for peptide solid-phase synthesis and liquid-phase purification protocols. Our optimized methodologies not only improve the synthesis efficiency and enhance batch-to-batch consistency of tumor neoantigen peptides, but also reduce production timelines. These advancements represent a pivotal step toward realizing the therapeutic potential of patient-specific neoantigen peptide vaccine platforms and accelerating their clinical translation within precision medicine frameworks for oncological and immunological indications.

Key words： tumor vaccine; neoantigen; peptide synthesis; peptide purification; process optimization

Cite this article

Qiang Liu , Xinyao Liu , Yuan Zu , Hongguo Hu , Wenbing Yao . Study on the Producing of Tumor Neoantigen Peptide Vaccines[J]. Acta Chimica Sinica, 2025 , 83(9) : 1000 -1005 . DOI: 10.6023/A25040126

1 引言

肿瘤新生抗原(tumor neoantigen)是一类来源于肿瘤特异性突变的多肽, 具有高度的特异性和免疫原性, 并可以突破宿主的免疫耐受[1-3]. 肿瘤新生抗原疫苗可以有效激活和训练患者的免疫系统, 诱导产生针对这些抗原的特异性免疫反应, 从而促进对表达此类抗原的肿瘤细胞的特异性杀伤, 因此成为肿瘤免疫治疗中的理想抗原靶点[4-5]. 2017年, 丹娜法伯癌症研究中心的Catherine Wu团队和缅因兹大学的Ugur Sahin团队分别在Nature上发表了新生抗原疫苗的临床研究, 展示了其在激活特异性抗肿瘤免疫应答和抑制肿瘤进展上的显著疗效, 引起了广泛关注[6-7]. 目前, 国内外多项基础及临床研究已证实了肿瘤新生抗原疫苗在肿瘤治疗上的安全性和有效性[8-11], 能真正为患者的健康提供新的解决方案, 展现出广阔的应用前景[12-15]. Ugur Sahin预测, 肿瘤新生抗原治疗性疫苗有望在2030年实现商业化上市.
肿瘤新生抗原源自患者个体的非同义突变, 具有高度个性化的特点. 因此, 开发肿瘤新生抗原疫苗需要为每位患者量身定制个性化药物, 属于“一人一药”的范畴. 与传统药物研发不同, 新生抗原疫苗研发流程包括: 首先对患者进行基因测序以识别突变位点, 随后结合计算机算法和实验方法筛选出患者的新生抗原, 最后根据筛选获得的序列合成多肽抗原库, 或者设计编码这些抗原肽段的核酸疫苗等来制备特定疫苗[16-17]. 尽管随着基因测序技术和抗原预测算法的进步, 新生抗原序列的获取变得相对简单[18], 但是新生抗原疫苗的制备仍然面临巨大挑战. 在早期的研究中, 为患者定制新生抗原多肽疫苗的时间大约需要18周时间[19]. 目前, 为临床肿瘤患者定制新生抗原疫苗的挑战在于: 合成难度大, 制备周期长, 且并非所有患者能够承受如此高的时间成本. 因此, 优化肿瘤新生抗原多肽的制备过程, 最大限度地缩短制备周期, 对于提高患者治疗的及时性至关重要. 此外, 肿瘤新生抗原疫苗的制备尚无明确的法规标准, 优化制备流程、规范操作步骤并建立稳定的工艺规范, 形成可靠的操作手册, 对于促进新生抗原疫苗产业的健康发展具有重要意义.
此前, 我们设计了一种通用的辅助T细胞表位(AKFVAAWTLK{L-4NO2-Phe}AA, 以下简称NitraTh), 该表位可以增强抗原的免疫反应. 当在肿瘤多肽抗原配方中共价连接NitraTh表位, NitraTh表位可以有效地提高T淋巴细胞反应, 促进对肿瘤的杀伤[20-21]. 基于此, 本研究将NitraTh表位作为通用肽段, 通过一个八肽连接子(SLVRLRMK, 以下简称Link), 与筛选出的个性化新生抗原肽段相连接, 构建肿瘤新生抗原多肽疫苗, 以增强新生抗原的T淋巴细胞免疫反应, 实现肿瘤的精准治疗. 进一步地, 我们提出了一种Link-NitraTh多肽片段预先储存的策略, 该策略能够提高肿瘤新生抗原多肽的生产效率. 通过优化合成方法, 提高了多肽粗品的纯度, 降低了纯化难度, 实现了质量和生产周期可控的肿瘤新生抗原多肽疫苗的生产(图1a). 实验结果表明, 利用该模式, 可以在23个工作日内生产12条38个氨基酸长度的多肽(图1b). 我们预期, 使用该模式制备肿瘤新生抗原多肽疫苗将大幅缩短合成时间, 解决肿瘤新生抗原多肽疫苗的制备问题, 为临床应用奠定基础.
图1 (a)肿瘤新生抗原多肽制备流程图; (b)肿瘤新生抗原多肽生产周期示意图

Figure 1 (a) Flow chart of the tumor neoantigen peptide preparation; (b) The production cycle diagram of the tumor neoantigen peptides

2 结果与讨论

2.1 多肽制备流程

我们根据肿瘤新生抗原多肽疫苗共有Link-NitraTh肽段的特点, 优化了Link-NitraTh肽段的合成, 提前生产Link-NitraTh肽树脂作为合成新生抗原多肽的“起始物料”, 将时间前置从而缩短了整体生产周期. 在获得筛选出的新生抗原多肽序列后, 即可进行生产. 采用与新生抗原多肽疫苗产能相匹配的实验条件, 可在7天完成12条多肽的合成; 在合成后1天内完成4条多肽的裂解; 12天完成对12条多肽的纯化及冻干; 随后完成12条多肽的转盐、冻干及相关质量检测(图1b). 研究表明, Link-NitraTh肽段的合成难度大, 常规多肽固相合成方法制备的Link-NitraTh纯度较低, 难以作为合格的“起始物料”用于新生抗原多肽的合成. 因此, 我们对Link-NitraTh合成方法进行了优化, 在最大程度保证多肽纯度的同时, 降低了人力和物力成本. 后续的新生抗原多肽序列的连接采用多肽合成仪进行, 保证了生产的高效性和时效性.

2.2 通用肽段Link-NitraTh的合成方法优化

Link-NitraTh是新生抗原共有的序列, 储备Link-NitraTh将缩短多肽疫苗的整体制备周期(图2a). 我们对Link-NitraTh进行了深入研究, 最终得到了粗肽纯度约33%的储备肽树脂(表1), 从而减少了后续纯化的难度. 首先, 我们采用常规的多肽合成条件(氨基酸3 equiv., 25 ℃)制备了Link-NitraTh肽树脂, 随后对其裂解后的粗品进行高效液相色谱(HPLC)分析. 结果显示, 采用常规方法合成的Link-NitraTh多肽主峰纯度仅9.12%(表1), 存在大量杂质峰(支持信息图S1.4). 以这种低纯度Link-NitraTh为“起始物料”, 合成的肿瘤新生抗原多肽粗品纯度将更低, 难以纯化得到纯度>95%的合格多肽. 已有文献表明, Ile、Val和Thr偶合效率低, 而在末端含有Ala、Met和Lys等氨基酸的多肽表现出强烈的聚集趋势, 这将不利于后续合成[22]. 我们将Link-NitraTh分段为: N6 (TLK{L-4NO2-Phe}AA), N10 (VAAWTLK{L-4NO2-Phe}AA), N16 (RMKAKFVAAW- TLK{L-4NO2-Phe}AA), 通过研究Link-NitraTh的合成难点并优化反应条件, 以提高Link-NitraTh粗肽纯度. 实验结果表明, 当氨基酸3 equiv.合成时, 随着多肽链延长, 粗肽主峰纯度逐渐降低, 杂质峰明显(表1, 支持信息图S1.1~图S1.4). 我们提高氨基酸至5 equiv., N6和N10粗肽的主峰纯度均可达到90%左右, N16多肽主峰为54.04%(表1, 支持信息图S1.5~图S1.7). 对主要杂质峰进行质谱分析, 发现在第16位的Arg未完全缩合, 产生了缺失杂质[M－Arg]+(图2b). 接下来, 为了优化16位Arg的缩合反应, 我们采取了提高反应温度和两次缩合等方法, 结果表明N16粗肽的主峰纯度均有所提升. 将加热和两次缩合结合后, N16主峰纯度可以达到73.19%, 杂质峰明显降低(图2c, 支持信息图S1.13). 将优化后的条件应用于Link-NitraTh多肽的合成, 主峰纯度为33.54%, 较优化前提高了约3.6倍(图2d, 支持信息图S1.14). 经过条件优化后, Link-NitraTh多肽主峰周围的杂质峰显著减少, 基于此方法制备的Link-NitraTh多肽树脂可以作为“起始物料储备”, 用于后续合成完整的新生抗原肽, 为新生抗原多肽的制备及纯化工作提供便利.
图2 (a) Link-NitraTh多肽树脂示意图; (b)氨基酸5 equiv.合成N16的HPLC及主要杂质分析图; (c)不同条件下制备得到的N16多肽HPLC分析图; (d)不同条件下制备得到的Link-NitraTh多肽HPLC分析图

Figure 2 (a) Schematic diagram of Link-NitraTh peptide resin; (b) HPLC diagram and main impurity analysis diagram of N16 with 5 equiv. amino acid; (c) HPLC diagram of N16 peptides prepared under different conditions; and (d) HPLC diagram of Link-NitraTh peptides prepared under different conditions

表1 不同条件下Link-NitraTh片段的制备结果

Table 1 Results of the Link-NitraTh fragment production under different conditions

多肽片段 n(氨基酸)∶
n(树脂)		 50 ℃(Arg) 双缩(Arg) 纯度/%
N6 3 — — 79.86
N6 5 — — 90.61
N10 3 — — 49.61
N10 5 — — 90.54
N16 3 否 否 28.31
N16 5 否 否 54.04
N16 5 是 否 67.63
N16 5 否 是 65.52
N16 5 是 是 73.19
Link-NitraTh 3 否 否 9.12
Link-NitraTh 5 否 否 21.50
Link-NitraTh 5 是 否 23.03
Link-NitraTh 5 否 是 23.09
Link-NitraTh 5 是 是 33.54

2.3 新生抗原多肽制备实例

完成对Link-NitraTh多肽树脂的合成方法优化后, 我们以Link-NitraTh作为“起始物料”, 成功合成了长度为38个氨基酸的新生抗原多肽, 随后对其进行裂解、纯化、转醋酸盐(三氟乙酸根残留<1%)以及冻干处理, 最终获得了目标新生抗原多肽.
首先, 我们对所优化的方法进行了验证. 如图3a所示, 优化前合成的MGP-NitraTh纯度低, 粗品主峰包裹很多杂质, 导致在纯化过程中杂质与产物无法分离. 经过两次纯化, 最终得到MGP-NitraTh的纯度为71.36%(图3b). 而优化后合成MGP-NitraTh(图3c), 粗品纯度高, 主峰旁的杂峰明显减少, 经过一次纯化即可得到纯度达到98.13%的MGP-NitraTh样品(图3d), 显著提高了多肽制备的成功率, 缩短了生产时间. 然后, 我们利用新生抗原多肽NJ81-01组及NJ81-02组的多肽序列来评估新生抗原多肽疫苗生产能力. 结果证明, 该方法在实际制备中表现出良好的成品率和时效性(支持信息图S2.1~图S2.14及图S3.1~图S3.10). 如表2所示, 按照我们设计的工艺流程进行生产, 合成0.3 mmol新生抗原多肽可以纯化得到20~60 mg的合格样品, 95%以上纯度的NJ81-01多肽合格率为85%, 供应商制备的合格率为60%. 此外, 利用优化前方法合成NJ81-01组多肽的理论时间约2个月, 使用优化后方法实际生产NJ81-01组多肽仅16个工作日, 极大地缩短了生产周期, 为实际生产中按时按需制备新生抗原多肽疫苗提供了有力保障.
图3 (a)优化前合成MGP-NitraTh的粗品HPLC分析图; (b)优化前合成MGP-NitraTh的精品HPLC分析图; (c)优化后合成MGP-NitraTh的粗品HPLC分析图; (d)优化后合成MGP-NitraTh的精品HPLC分析图.

Figure 3 (a) The HPLC chromatogram of crude MGP-NitraTh before optimization; (b) The HPLC chromatogram of purified MGP-NitraTh before optimization; (c) The HPLC chromatogram of crude MGP-NitraTh after optimization; (d) The HPLC chromatogram of purified MGP-NitraTh after optimization

表2 新生抗原多肽制备实例

Table 2 Neoantigen peptide preparation examples

序列组 样品名 序列(38AA) 外购纯度/% 自制纯度/%
NJ81-01 SLC38A4-NitraTh SVGIILPLPLLKNLGYLSLVRLRMKAKFVAAWTLK{L-4-NO2-Phe}AA 94.98 97.60
CTNNB1-NitraTh SGATTTAPPLSGKGNPESLVRLRMKAKFVAAWTLK{L-4-NO2-Phe}AA 99.86 96.15
VIL1-NitraTh KLYHVSDSKGNLVVREVSLVRLRMKAKFVAAWTLK{L-4-NO2-Phe}AA 93.40 98.23
PSME4-NitraTh LQQSKNPSVNQILLSPESLVRLRMKAKFVAAWTLK{L-4-NO2-Phe}AA 100 97.02
POC1B-NitraTh NVLTQTVSVLEQRLTLTSLVRLRMKAKFVAAWTLK{L-4-NO2-Phe}AA —a —a
CDYL2-NitraTh CGRKLTAQVACSRGLVSSLVRLRMKAKFVAAWTLK{L-4-NO2-Phe}AA —a —a
TRMT6-NitraTh YDTLAQMLMLGNIRAGNSLVRLRMKAKFVAAWTLK{L-4-NO2-Phe}AA 93.76 98.77
IFNAR2-NitraTh PEVDVELPMMPKDSPQQSLVRLRMKAKFVAAWTLK{L-4-NO2-Phe}AA —b 94.75
KDR-NitraTh SLVEATVGKRVRIPAKYSLVRLRMKAKFVAAWTLK{L-4-NO2-Phe}AA —b 99.19
NJ81-02 NRCAM-NitraTh NLSDTEFYVAKSSRERPSLVRLRMKAKFVAAWTLK{L-4-NO2-Phe}AA —b 98.34
MFSD5-NitraTh PYLYKLYQRYYFLEGQISLVRLRMKAKFVAAWTLK{L-4-NO2-Phe}AA —b 95.70
TMEM127-NitraTh FAVSFYLVEGAGGASILSLVRLRMKAKFVAAWTLK{L-4-NO2-Phe}AA —b —a
BSDC1-NitraTh NACWPHRRPRAQASSQSSLVRLRMKAKFVAAWTLK{L-4-NO2-Phe}AA —b 97.53
ARHGAP25-NitraTh EVLFPKSKNIPLSPPAQSLVRLRMKAKFVAAWTLK{L-4-NO2-Phe}AA —b 95.03
PCNX1-NitraTh HLTRSLQHILCGDLLLGSLVRLRMKAKFVAAWTLK{L-4-NO2-Phe}AA —b 95.54
CDC42BPB-NitraTh FLSQQSFDACAVELESSLVRLRMKAKFVAAWTLK{L-4-NO2-Phe}AA —b —a

a The peptide was obtained because of poor solubility; b peptide was not prepared.

3 结论

在本工作中, 我们提出了一种创新的策略——通过储存Link-NitraTh多肽树脂来生产肿瘤新生抗原多肽, 并对Link-NitraTh合成方法进行了优化, 极大地提升了多肽粗品纯度. 这一策略有效降低了纯化的难度, 缩短了制备周期, 使生产目标新生抗原多肽质量可控、周期可控. 按照该策略, 能够在23个工作日内高效实现12条38个氨基酸长度的多肽的合成生产, 为个性化肿瘤新生抗原多肽疫苗的按时按需生产提供了可靠保障. 尽管肿瘤新生抗原疫苗作为高度个性化的前沿治疗手段, 但受限于小批量定制化生产特点, 导致其在研发模式与标准化路径上尚存体系性短板, 同时其作为肿瘤精准医疗潜力支撑, 也面临构建跨越个体差异的质量控制要求. 本研究通过解构新生抗原疫苗制备全流程, 系统建立了涵盖固相合成参数优化、液相纯化的标准化操作规程, 以及基于多肽纯度和其他安全性指标的放行标准体系. 这种将个体化治疗需求与工业化质量体系深度融合的探索, 为临床转化构建了可复制的质量保障架构, 有望成为连接精准医疗愿景与现实落地的枢纽节点.

4 实验部分

4.1 Link-NitraTh多肽树脂的合成

首先, 将0.5 mmol Fmoc-Ala-Wang树脂分别加入4个通道反应器中, 并加入20 mL二氯甲烷(DCM)溶胀1 h. 在溶胀后, 抽干DCM, 接着加入12 mL的20%哌啶/ N,N-二甲基甲酰胺(pip/DMF)溶液进行脱保护, 振荡7 min后抽干. 重复脱保护一次, 抽干脱保护试剂, 之后, 使用DMF对树脂洗涤四次, 每次鼓泡振荡50 s, 并抽干. 加入9 mL配好的0.278 mol/L氨基酸/DMF溶液后, 加入3 mL的0.833 mol/L 2-肟氰乙酸乙酯(Oxyma)/DMF振荡1 min, 再加入3 mL的0.833 mol/L N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)/DMF溶液振荡1 min, 25 ℃振荡反应30 min. 反应结束后, 抽干反应液, 用DMF洗涤四次, 每次鼓泡振荡50 s, 并抽干. 重复上述操作依次缩合序列氨基酸, 其中第16位Arg氨基酸的连接采用50 ℃加热, 并进行两次缩合. 最后一个氨基酸缩合结束后, 使用DCM对树脂洗涤三次, 并在真空下抽干过夜. 最后, 将合成的树脂置于4 ℃储存以备用.

4.2 新生抗原多肽的合成

称取0.3 mmol Link-NitraTh-树脂于40 mL反应器中, 加入DCM溶胀1 h. 抽干DCM后, 使用DMF洗涤两次, 每次振荡鼓泡50 s, 随后再抽干. 接着, 加入9 mL的0.167 mol/L氨基酸/DMF溶液, 再加入1 equiv.的Oxyma和DIC, 振荡鼓泡30 min后抽干. 随后, 使用DMF洗涤四次, 每次振荡鼓泡50 s, 并抽干. 最后, 加入12 mL 20% pip/DMF溶液, 振荡鼓泡7 min后抽干; 重复该过程一次. 再用DMF洗涤四次, 每次振荡鼓泡50 s并抽干. 重复上述操作, 按照氨基酸的序列逐个进行缩合反应. 反应结束后, 使用DCM对树脂进行洗涤四次, 并在真空下将树脂抽干1 h.

4.3 新生抗原多肽的裂解

根据所得到树脂的质量, 按照0.1 g树脂加入1 mL裂解试剂(三氟乙酸(TFA)/水/苯甲硫醚/1,2-乙二硫醇(EDT)/苯酚=82.5%/5.0%/5.0%/5.0%/2.5%, 物质的量浓度), 在25 ℃下进行搅拌裂解3 h; 裂解完成后, 将裂解液过滤至预冷的甲基叔丁基醚(5倍体积)中沉淀, 摇匀后离心(4 ℃, 8000 r/min, 5 min), 去除上清液. 接着, 向沉淀物中加入预冷的甲基叔丁基醚(5倍体积)进行重悬洗涤, 再次摇匀后离心(4 ℃, 8000 r/min, 5 min), 去除上清液. 重复一次甲基叔丁基醚重悬洗涤操作, 抽干得到粗肽固体.

4.4 新生抗原多肽的高效液相分析方法

将粗肽固体用50%乙腈-水溶解至约1 mg/mL的浓度, 进行高效液相分析. 色谱柱为CAPCELL公司的C18反相硅胶柱C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm); 流动相A为0.06% TFA-水, 流动相B为0.06% TFA-乙腈; 洗脱程序: 0~20 min, 20%~60% B, 20~30 min, 90% B, 30~35 min, 20% B; 检测波长: 215 nm; 柱温: 40 ℃; 流速: 1.0 mL/min; 进样量: 2~10 μL; 洗针液: 50% MeOH/H2O.

4.5 新生抗原多肽的纯化方法

将粗肽固体用50%乙腈-水溶解至约10 mg/mL, 使用半制备高效液相进行纯化, 收集主峰. 色谱柱为CAPCELL公司C18反相硅胶柱C18 (20 mm×250 mm, 5 μm); 流动相A为0.06% TFA-水, 流动相B为0.06% TFA-乙腈; 检测波长: 215 nm; 柱温为25 ℃; 流速为10 mL/min; 进样量约2 mL; 洗脱程序为0~5 min, 20% B; 5~25 min, 20%~60% B; 25~35 min, 90% B; 35~40 min, 20% B.

4.6 新生抗原多肽的转盐方法

将纯化冻干后的多肽用50%乙腈-水溶解至约10 mg/mL, 用半制备高效液相色谱进行转盐, 收集主峰. 色谱柱为苏州纳微科技股份有限公司的Unisil 10-200 C18, SS: 21.2 mm×250 mm, 10 μm; 流动相A为1%乙酸-水, 流动相B为1%乙酸-乙腈; 检测波长: 215 nm; 流速为10 mL/min; 进样量为2 mL; 洗脱程序为0~25 min, 5% B; 25~65 min, 5%~45% B; 65~70 min, 45%~70% B; 70~80 min, 80% B; 80~90 min, 5% B.
(Cheng, B.)

感谢重庆药友制药有限责任公司多肽药物部门和分析测试平台的支持.

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