1 引言
顺铂(cisplatin, Cis)作为临床常用的化疗药物, 其肾毒性主要通过损伤肾小管上皮细胞, 诱发氧化应激、炎症反应和细胞凋亡, 进而导致急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)[1-2]. AKI是一种严重的临床综合征, 发病率高、死亡率高, 危害巨大, 主要表现为尿量的急剧减少以及血肌酐(serum creatinine, SCR)和尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)水平的显著升高[3]. 目前, 在临床上AKI的治疗主要包括对症支持治疗和肾脏替代治疗, 但这些方法并不能从根本上修复受损的肾脏, 只能改善肾功能[4]. 因此, 探索AKI的新型治疗策略具有重要的临床意义[5-6]. AKI的发病机制复杂, 包括一系列连续的病理级联反应, 其中氧化应激和炎症反应被认为是核心环节, 二者相互促进, 在AKI的病理过程中起着至关重要的作用[7]. 在AKI中, 缺血再灌注、药物毒性和脓毒症感染等因素均可诱导活性氧(reactive oxygen species, ROS)的过量生成[8-10]. 过量的ROS可破坏细胞结构和功能, 导致一氧化氮(nitric oxide, NO)失活和缺乏, 从而引发肾小管上皮细胞凋亡和坏死[11]. 此外, ROS还可激活多种炎症信号通路, 促进炎症因子的释放, 进一步加重肾脏损伤[12]. 在AKI过程中, 受损的肾小管上皮细胞和浸润的免疫细胞会释放大量炎症因子, 如肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白介素-6 (interleukin-6, IL-6)和单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)等, 不仅可直接损伤肾脏组织, 还可引发更多的免疫细胞浸润, 形成恶性循环, 加重AKI的病情[13]. 因此, 同时清除过量ROS和抑制炎症反应可能是治疗AKI的有效策略[14-15].
传统抗氧化剂和抗炎药物在AKI治疗中存在环境敏感性高、稳定性差和靶向性不足等问题[16]. 基于纳米技术的治疗方法通过提高药物的溶解性、稳定性和靶向性, 显著改善了AKI的治疗效果[16-19]. 例如, 二氧化铈纳米颗粒(cerium oxide nanoparticles, CeO₂ NPs)通过模拟超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)的功能, 有效清除ROS, 减轻肾脏损伤[20-21]. 此外, DNA折纸纳米结构也被证明能够通过其高比表面积和特定的形状, 靶向肾脏并清除ROS, 显著改善AKI的肾功能[22]. 这些纳米材料的应用为AKI的治疗提供了新的思路和工具. 其中, 硒纳米材料因其类谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)活性, 能够有效清除ROS和活性氮(reactive nitrogen species, RNS), 并通过调节核因子-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)通路抑制炎症反应, 展现出显著的抗炎和抗氧化作用[23]. 此外, 谷胱甘肽(GSH)是细胞内最重要的抗氧化剂之一, 其活性巯基(—SH)可直接清除ROS(如H₂O₂, •OH), 并作为谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的辅因子, 催化过氧化物的还原. 硒化铁中的硒是GPx活性中心的关键元素, 能增强酶活性, 协同GSH提升抗氧化能力. GSH还通过抑制NF-κB通路减少促炎因子(TNF-α、IL-6)释放, 而硒可下调炎症小体激活. 两者协同抑制NF-κB磷酸化, 阻断炎症信号传导[24-25]. 基于硒纳米材料和谷胱甘肽的协同效应, 谷胱甘肽修饰的硒化铁纳米材料(GSH-Fe3－XSe3 NPs)应运而生. GSH-Fe3－XSe3 NPs不仅延续了硒纳米材料的抗炎和抗氧化特性, 还通过谷胱甘肽的修饰进一步增强了其清除ROS的能力, 减轻氧化应激对肾脏的损伤; 同时显著降低了炎症水平下丙二醛(malondialdehyde, MDA), NO, TNF-α和IL-6的表达, 阻断炎症反应的恶性循环, 发挥双重治疗作用, 实现对AKI的治疗[26-27].
2 结果与讨论
2.1 表征结果
我们采用一锅法合成了GSH修饰的Fe3－XSe3纳米颗粒. 通过扫描电子显微镜(SEM)对GSH-Fe3－XSe3 NPs的形貌进行分析. 如图1(a)所示, GSH-Fe3－XSe3 NPs分散性优异, 表面光滑, 呈球形, 平均尺寸约为200 nm. 为了进一步探究GSH-Fe3－XSe3 NPs的稳定性, 利用动态光散射(DLS)(图1b)分析其水合粒径为220 nm, 并可以看出其在7天之内粒径大小呈稳定状态. 同时, 将GSH-Fe3－XSe3 NPs分别分散在(H2O, 磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS), 杜尔贝科改良伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle medium, DMEM), 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS), DMEM＋FBS)不同溶液中, 对材料分散性进行进一步测试(图1c), 静置7 d后溶液均未出现聚集, 这表明所制备的GSH-Fe3－XSe3 NPs在各种溶液中均具有良好的稳定性. 最后, 通过CCK-8检测了GSH-Fe3－XSe3 NPs对RAW264.7细胞活力的影响, 图1d, 在200 µg/mL浓度下细胞活力仍大于80%, 说明本实验所述的GSH-Fe3－XSe3 NPs具有良好的生物相容性.
图1 GSH-Fe3－XSe3 NPs的表征结果. (a) SEM图; (b) 200 μg/mL GSH-Fe3－XSe3 NPs 7 d之内的水合粒径变化; (c)在不同溶液中的分散性; (d)不同浓度GSH-Fe3－XSe3 NPs对RAW264.7细胞的细胞毒性Figure 1 Characterization of GSH-Fe3－XSe3 NPs. (a) SEM image; (b) the hydrated particle size changes of 200 μg/mL GSH-Fe3－XSe3 NPs within 7 d; (c) dispersion of different solutions; (d) cytotoxicity of GSH-Fe3－XSe3 NPs at different concentrations on RAW264.7 cells |
此外, 还进行了傅里叶变换红外(FT-IR)光谱分析, 以进一步研究GSH-Fe3－XSe3 NPs的表面组成(图2a) 2524 cm－1处的S—H伸缩振动带通过形成Fe—S配位键而消失, 这意味着GSH分子通过硫醇键与Fe和Se结合. 而1716 cm－1处的吸收带对应于GSH羧基的C=O伸缩模式, 表明GSH的成功修饰. 利用X射线光电子能谱技术(XPS)对制备得到的GSH-Fe3－XSe3 NPs进行了表征, 进一步验证了纳米粒子的结构(图2b~2d). 综上表明, 本课题通过一锅法成功将GSH负载到硒化铁纳米粒子中, 利用SEM、能量散射X射线光谱仪(EDX)、DLS、XPS、FT-IR等对材料进行多方面表征, 结果表明GSH成功负载到硒化铁纳米粒子中, 合成的纳米材料呈圆球状, 尺寸分布在200 nm左右.
2.2 体外抗炎抗氧化
活性氧ROS的异常蓄积可引发持续性氧化应激, 进而导致不可逆的炎症损伤. 基于此, 本研究从细胞层面系统探究了GSH-Fe3－XSe3 NPs的抗氧化及抗炎性能. 首先构建了脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型, 该模型目前被广泛应用于模拟巨噬细胞激活、炎症因子释放及氧化应激反应等[28]. 2',7'-二氯二氟荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为荧光探针, 检测细胞内ROS水平(图3a). 荧光显微成像显示, LPS刺激组细胞呈现高强度绿色荧光信号, 提示ROS的大量积累; 而经流式细胞术定量分析进一步证实, GSH-Fe3－XSe3 NPs处理组胞内近50%的ROS可以被有效地消除, 其清除效率明显优于单独GSH组(图3b, 3c).
图3 体外抗氧化实验. (a)荧光显微镜检测RAW264.7细胞内200 μg/mL GSH和GSH-Fe3－XSe3 NPs的ROS清除能力(比例尺, 100 μm); (b)流式细胞仪分析检测200 μg/mL GSH, GSH-Fe3－XSe3 NPs清除RAW264.7中ROS的能力; (c)流式细胞仪定量分析(n=3); (d) GSH和GSH-Fe3－XSe3 NPs处理后, LPS刺激的RAW264.7细胞中的MDA含量. ** P<0.01, *** P<0.001Figure 3 In vitro antioxidant experiments. (a) Fluorescence microscopy detection of ROS scavenging capacity in RAW264.7 cells treated with 200 μg/mL GSH and GSH-Fe3－XSe3 NPs (scale bar, 100 μm); (b) flow cytometry analysis of ROS clearance in RAW264.7 cells by 200 μg/mL GSH, GSH- Fe3－XSe3 NPs; (c) quantitative analysis of flow cytometry results (n=3); (d) MDA levels in LPS-stimulated RAW264.7 cells after treatment with 200 μg/mL GSH, GSH-Fe3－XSe3 NPs. ** P<0.01, *** P<0.001 |
基于上述发现, 本研究进一步通过检测脂质过氧化终产物MDA水平评估GSH-Fe3－XSe3 NPs处理的抗氧化性能. 如图3d所示, GSH-Fe3－XSe3 NPs能显著抑制LPS诱导的MDA升高, 表明其可通过阻断脂质过氧化反应减轻氧化损伤. 为了阐明材料的抗炎机制, 采用了LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型检测关键炎症因子水平. 如图4a~4c所示, 与LPS模型组相比, GSH-Fe3－XSe3 NPs处理组细胞内NO, TNF-α和IL-6水平均表现出显著下降, 且其对上述炎症因子的抑制率明显优于单独的GSH组. 此结果证实了GSH-Fe3－XSe3 NPs通过清除RNS及调节炎症介质分泌实现有效地阻断巨噬细胞的异常炎症反应. 进一步通过Western blot解析了其分子机制(图4d~4f). 实验结果显示, LPS刺激会激活NF-κB信号通路, 表现为磷酸化P65蛋白(P-P65)表达量升高, 而经GSH-Fe3－XSe3干预后, P-P65表达量却显著下调至接近基础水平, 但总P65蛋白表达基本没有变化. 进一步表明制备的纳米材料可能通过抑制NF-κB通路关键蛋白的磷酸化, 阻断炎症信号级联放大, 从而发挥抗氧化抗炎双重调控作用.
图4 200 μg/mL GSH和GSH-Fe3－XSe3 NPs处理后, LPS刺激的RAW264.7细胞中的(a) NO, (b)肿瘤转化因子α, (c)白介素6的含量; (d~f) Western blot检测RAW264.7细胞中P65、P-P65的蛋白表达水平及相对表达值. 针对内参基因进行归一化. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, ns表示无显著差异Figure 4 Effects of 200 μg/mL GSH and GSH-Fe3－XSe3 NPs on LPS-stimulated RAW264.7 cells about (a) NO levels, (b) tumor necrosis factor-α (TNF-α) levels, and (c) Interleukin-6 (IL-6) levels in cell culture supernatants. (d~f) Western blot analysis of P65 and phosphorylated P65 (P-P65) protein expression levels in RAW264.7 cells, with relative expression values normalized to housekeeping genes. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, ns indicates no significant difference |
2.3 体内治疗急性肾损伤
为系统评估GSH-Fe3－XSe3 NPs在体内抗炎抗氧化能力, 我们构建了顺铂诱导的AKI小鼠模型. 首先腹腔注射Cis (18 mg/kg), 建立小鼠AKI模型, 通过监测BUN, SCR, MDA, TNF-α和IL-6的变化用于评估全身炎症水平和肾损伤, 进一步验证GSH-Fe3－XSe3 NPs在体内对AKI小鼠的治疗潜力. 将30只雄性C57小鼠随机分为6组(n=5): (i) PBS组; (ii) Cis组; (iii) Cis＋GSH组; (iv) Cis＋200 mg/kg GSH-Fe3－XSe3组; (v) Cis＋400 mg/kg GSH-Fe3－XSe3组; (vi) Cis＋800 mg/kg GSH-Fe3－XSe3组. 在注射Cis造模前半小时按照上述分组将PBS、GSH及不同浓度的药物单次腹腔注射于小鼠体内, 并于注射72 h后处死小鼠取血清、肾脏. 其中血清用于血生化指标门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST), 丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT), BUN, SCR和MDA]、炎症指标(TNF-α, IL-6)检测, 肾脏用于H&E、Tunel切片染色. 治疗期间, 各组小鼠体重保持稳定(图5a), 表明材料具有良好的生物安全性. 如图5b~5f所示, 注射Cis后, 体内BUN, SCR, MDA, TNF-α和IL-6含量明显增加, 证实AKI模型的成功建立并伴随氧化应激及炎症反应. 在治疗组中, 所有指标水平均有所下降, 而GSH-Fe3－XSe3 NPs组下降最显著, 各指标恢复至接近正常水平. 值得注意的是, 不同剂量组间(200, 400, 800 mg•kg－1)未呈现显著剂量依赖性差异. 此外, 组织病理学分析结果显示(图6a), Cis组出现典型肾小管损伤特征: 明显的上皮细胞脱落、细胞间质肿胀及细胞核碎裂、肾小管管腔扩张伴蛋白样管型形成. 相较之下, 治疗组小鼠肾脏组织结构明显改善, 肾小球形态完整, 肾小管上皮细胞排列整齐且细胞核完整. 尽管GSH单药治疗组也可见一定保护效应, 但其病理改善程度明显弱于各剂量GSH-Fe3－XSe3 NPs治疗组, 且不同浓度组间未见显著差异. Tunel染色结果进一步验证上述发现: Cis组较PBS组肾组织有大量细胞凋亡, 200 mg/kg GSH-Fe3－XSe3 NPs组治疗效果比单独GSH更好, 而随着浓度的增大, 凋亡抑制未呈现显著增强的趋势. 这些结果表明, GSH-Fe3－XSe3 NPs可以有效缓解顺铂诱导的AKI: (1)清除ROS/RNS减轻氧化损伤; (2)下调促炎因子TNF-α和IL-6水平抑制炎症级联反应; (3)改善肾损伤指标物质(BUN, SCR)及脂质过氧化产物(MDA); (4)保护肾小管上皮细胞完整性并抑制病理性凋亡. 值得注意的是, 发现在100, 200, 400 mg/kg浓度治疗AKI小鼠中测定TNF-α, IL-6, H&E, Tunel结果时(支持信息, 图S1), 200 mg/kg GSH-Fe3－XSe3呈现最好的抗炎效果, 可以表明纳米颗粒在200 mg/kg剂量即显现出最大治疗效应, 表示其具有低剂量高效的特性, 这对降低潜在毒副作用及临床转化具有重要意义.
图5 体内实验. (a)治疗期间(15 d)小鼠的体重变化, n=3 ; GSH (800 mg/kg)和不同浓度GSH-Fe3－XSe3 NPs处理后, 不同组小鼠的(b)尿氮, (c)肌酐, (d)丙二醛, (e)肿瘤转化因子α, (f)白介素6水平. n=5. ** P<0.01, *** P<0.001, ns表示无显著差异Figure 5 In vivo experiment. (a) Body weight changes of mice during the treatment period (15 d), n=3; levels of (b) blood urea nitrogen (BUN), (c) creatinine, (d) malondialdehyde (MDA), (e) tumor necrosis factor-α (TNF-α), (f) interleukin-6 (IL-6) in different groups of mice after treatment with GSH (800 mg/kg) and GSH-Fe3－XSe3 NPs of different concentrations, n=5. ** P<0.01, *** P<0.001, ns indicates no significant difference |
图6 (a)不同剂量GSH-Fe3－XSe3 NPs、800 mg/kg GSH或PBS处理的AKI小鼠的肾脏进行H&E染色和Tunel染色; (b)不同浓度GSH-Fe3－XSe3 NPs对正常小鼠的血常规分析, n=3; (c) GSH-Fe3－XSe3 NPs的体外溶血实验Figure 6 (a) H&E staining and Tunel staining of kidneys from AKI mice treated with different doses of GSH-Fe3－XSe3 NPs, 800 mg/kg GSH or PBS; (b) complete blood count analysis of normal mice treated with different concentrations of GSH-Fe3－XSe3 NPs (n=3); (c) in vitro hemolysis assay of GSH-Fe3－XSe3 NPs |
2.4 生物相容性
为了全面评估GSH-Fe3－XSe3 NPs的体内安全性, 通过血常规检测和溶血实验系统考察其生物相容性. 如图6b所示, 小鼠主要血常规指标均处于正常生理范围内, 未观察到明显的毒副作用. 体外溶血实验显示(图6c), 当GSH-Fe3－XSe3 NPs的浓度达到 200 μg/mL, 溶血率仍不到5%, 并未造成溶血迹象; 而阳性对照组(超纯水)红细胞全部溶解, 表现为全溶血反应. 利用ICP-MS分别对control, Cis, 200 mg/kg GSH-Fe3－XSe3 NPs组别中肾和肝中的Se和Fe含量进行定量分析研究表明(支持信息, 图S2a~S2d), GSH-Fe3－XSe3 NPs治疗AKI后第一天的Se和Fe含量相较于control、Cis组有所增加, 但随着时间的增加, 到第7 d, Se和Fe含量逐渐减少, 并接近control组, 表明治疗后的AKI小鼠第7 d Se和Fe已逐渐代谢, 具有良好的生物安全性. 通过支持信息图S2e~S2h, 表明200 mg/kg GSH-Fe3－XSe3 NPs在治疗AKI小鼠第1 d的肝功能指标AST, ALT和肾功能指标(BUN, SCR)含量相较于造模组(Cis)有明显下降, 在第7 d已接近control组. 进一步表明GSH-Fe3－XSe3 NPs治疗后的小鼠具有良好的生物安全性. 上述结果证明该纳米材料具有良好生物相容性.
3 结论
本工作报道了一种具有良好生物相容性GSH修饰的硒化铁纳米粒子(GSH-Fe3－XSe3 NPs)可以通过抗炎抗氧化双重作用治疗顺铂诱导的急性肾损伤. 体外实验表明, GSH-Fe3－XSe3 NPs可显著清除ROS/RNS, 抑制脂质过氧化产物MDA生成, 并通过阻断NF-κB信号通路关键蛋白的磷酸化修饰(P-P65下调至基础水平)有效降低TNF-α和IL-6等促炎因子表达. 体内研究证实, GSH-Fe3－XSe3 NPs能显著改善AKI模型小鼠肾损伤指标(BUN和SCR恢复至正常水平), 修复肾小管病理损伤, 其治疗效果显著优于单独GSH. 值得注意的是, 该纳米体系在200 mg/kg低剂量即达到最佳疗效, 且表现出良好的血液相容性和生物安全性. 本研究为AKI的治疗提供了新型的药物研发思路, 其低剂量高效特性对推动临床转化具有重要价值.
4 实验部分
4.1 合成
GSH-Fe3－XSe3 NPs合成方法: 称取0.32 g GSH (1.04 mmol)溶解于40 mL二甲基亚砜中, 然后在磁力搅拌下加入0.066 g Fe(ClO4)2•xH2O (0.18 mmol). 当溶液变澄清后, 在氩气保护下加热至140 ℃, 剧烈搅拌10 min, 向其中加入0.045 g Na2SeO3 (0.26 mmol)并保持在同一温度下连续搅拌18 h后反应完成. 将反应混合体系自然冷却至室温, 得到棕黑色沉淀即为GSH-Fe3－XSe3 NPs, 经异丙醇15000 r/min离心20 min多次洗涤沉淀后, 将所得样品在冻干机24 h冻干以备后续使用.
4.2 纳米粒子的SEM测试
采用冷场发射扫描电镜(SEM)可以直观的观察纳米颗粒表面的细微结构、尺寸大小和形貌特征等. 测试时将样品涂敷在导电胶上, 喷金处理后, 固定在样品台上测试.
4.3 FT-IR测试
使用傅里叶变换红外吸收光谱仪(FT-IR)测定GSH-Fe3－XSe3 NPs的红外吸收光谱. 将20 mg冻干样品和干燥的溴化钾放入研钵中研磨粉碎后, 压片制样, 进行FT-IR测试.
4.4 XPS测试
使用X射线光电子能谱(XPS)对GSH-Fe3－XSe3 NPs的化学结构和元素价态进行表征. 将10 mg材料粉末夹于锡箔纸中间后, 固定于XPS检测台上后, 进行XPS检测.
4.5 DLS测试
使用动态光散射仪对GSH-Fe3－XSe3 NPs的粒径大小进行表征. 将100 μg/mL材料水溶液放入石英皿进行粒径测试.
4.6 材料分散性测试
将GSH-Fe3－XSe3 NPs分别分散在H2O、PBS、培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、DMEM＋FBS溶液中, 放置7天观察其分散状态.
4.7 细胞活力测定
在96孔板中以每孔5×10⁴个细胞的密度接种RAW264.7细胞, 37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱培养24 h. 分别加入含有不同浓度(0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 µg/mL) GSH-Fe3－XSe3 NPs的新鲜培养基, 每一浓度设置三组平行样, 将不含材料的培养基处理组设置为空白对照组, 结束后继续置于细胞培养箱中培养24 h. 孵育结束去除旧培养基, PBS洗涤一次后加入含CCK-8的新鲜培养基, 加药完毕后37 ℃避光静置20 min, 利用酶标仪检测在450 nm处的吸收值.
4.8 GSH-Fe3－XSe3 NPs消除细胞内的ROS
采用流式细胞仪与倒置荧光显微镜检测了RAW264.7细胞经过处理之后细胞内ROS荧光强度. 简而言之, 活化的RAW264.7细胞以1×10⁶密度种于6孔板, 并孵育24 h, 接着分别加入LPS (1 µg/mL)和相同浓度(200 µg/mL)的GSH、GSH-Fe3－XSe3 NPs, 同时设置空白对照组, 细胞与药物分别孵育24 h后, 以PBS洗涤细胞三次, 并以DCFH-DA染色30 min. 细胞样品以PBS再洗三遍, 并于倒置荧光显微镜下观察(激发和发射波长分别为488和525 nm). 并收集细胞于流式细胞仪中检测.
4.9 炎症相关因子检测
NO检测. 使用NO检测试剂盒测定NO的浓度. 将RAW264.7细胞(4×10⁴个/孔)接种于96孔板, 隔夜培养24 h, 随后分别加入含LPS (1 µg/mL)的相同浓度(200 µg/mL)的GSH和GSH-Fe3－XSe3 NPs, 孵育24 h后, 离心(12000 g, 5 min, 4 ℃)收集上清. 随后用NO试剂盒检测细胞内RNS水平. 记录光密度(Optical density, OD) OD540的吸收值. 促炎相关细胞炎症因子检测. 使用ELISA试剂盒检测促炎因子TNF-α和IL-6的表达. 将密度为4×10⁴个RAW264.7细胞接种于96孔板, 培养箱24 h, 随后加入含LPS的200 µg/mL 的GSH和GSH-Fe3－XSe3 NPs, 孵育24 h后, 收集上清, 然后按照试剂盒说明书, 记录OD450的吸收值.
4.10 纳米药物对炎症通路蛋白NF-κB/P65的影响
将活化的RAW264.7细胞以1×10⁶密度接种于6孔板, 并孵育24 h, 接着分别加入LPS (1 µg/mL)和200 µg/mL的GSH和GSH-Fe3－XSe3 NPs, 同时设置空白对照组, 细胞与药物分别孵育24 h后, 用放射免疫沉淀分析缓冲液(Radioimmunoprecipitation assay buffer, RIPA)裂解缓冲液裂解, 裂解缓冲液中按比例添加蛋白酶抑制剂和磷酸化蛋白酶抑制剂. 30 min后收集细胞总蛋白进行蛋白质免疫印迹(Western blot, WB)实验. 将蛋白样品与上样缓冲液按1∶4的体积比混合, 在95 ℃水浴中孵育5 min使蛋白充分变性. 将变性蛋白加入SDS-PAGE孔中, 使用凝胶电泳分离不同分子量蛋白并将电泳完成后蛋白转移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上. 随后使用快速封闭液室温下封闭1 h. 用含吐温-20的Tris缓冲盐溶液(tris-buffered saline with tween 20, TBST)洗涤三次后, 用第一抗体(1∶2000, V∶V)在4 ℃摇床上孵育过夜. 然后, 用第二抗体(1∶5000, V∶V)在室温摇床上孵育2 h. 最后用TBST洗涤三次后, 加入发光液, 在化学发光分析仪中显色.
4.11 体内治疗效果测试
实验结束后, 从小鼠(C57BL)眼球取血, 收集的血液样品用于后续血液中AST, ALT, BUN, SCR, MDA, TNF-α和IL-6的测定. 同时脱颈处死小鼠并收集肾, 使用4%多聚甲醛固定液固定器官组织用于后续组织学病理切片进行染色. 此外, 对不同处理组小鼠肾脏进行Tunnel染色, 观察肾脏淋巴细胞凋亡情况.
4.12 血液相容性测试
以超纯水溶解的红细胞为阳性对照, 以PBS溶解的红细胞为阴性对照以及使用对应浓度(12.5, 25, 50, 100, 200 µg/mL)的GSH-Fe3－XSe3 NPs为空白对照从而减少材料自身颜色造成的误差. 阳性对照组血细胞完全裂解, 阴性对照组血细胞未发生裂解. 通过以下公式计算纳米材料的溶血率:
$溶血率\text{%}＝\frac{(吸光{度}_{实验组}－吸光{度}_{空白组})－吸光{度}_{阴性组}}{吸光{度}_{阳性组}－吸光{度}_{阴性组}}\times 100\%$
4.13 血常规测试
健康小鼠腹腔注射GSH-Fe3－XSe3 NPs 15 d后, 取血做血常规.
4.14 肾脏和肝脏Se、Fe含量测试
利用浓硝酸消解肾脏与肝脏, 并用2%稀硝酸进行定容, 然后利用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定Se和Fe元素含量.
(Lu, Y.)