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2025 , Vol. 83 >Issue 10: 1119 - 1123

DOI: https://doi.org/10.6023/A25050155

Communication

Synthesis of 5-Arylidene Thiohydantoin Derivatives via DNA-Compatible Knoevenagel Condensation★

  • Xianfu Fang a, b ,
  • Yunzhu Ju b ,
  • Qigui Nie b ,
  • Xiaohong Fan a, b ,
  • Huihong Wang a, b ,
  • Yangfeng Li b ,
  • Gong Zhang , b, * ,
  • Yizhou Li , b, *
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  • a Pharmaceutical Department, Chongqing University Three Gorges Hospital, Chongqing University, Chongqing 404100, China
  • b Chongqing Key Laboratory of Natural Product Synthesis and Drug Research, Innovative Drug Research Center, School of Pharmaceutical Sciences, Chongqing University, Chongqing 401331, China
* E-mail: ;
E-mail:

† These authors contributed equally to this work.

★ For the VSI “Rising Stars in Chemistry”.

Received date: 2025-05-11

  Online published: 2025-07-03

Supported by

National Natural Science Foundation of China(22222702)

National Natural Science Foundation of China(22477011)

National Natural Science Foundation of China(22407019)

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Abstract

DNA-encoded library (DEL) technology has emerged as an important platform for drug development. It has attracted widespread attention from industry and academia due to its advantages such as short synthesis cycle, simple operation, high throughput and low cost. However, the advancement of DEL technology still faces challenges, such as the lack of DNA-compatible chemical reactions for constructing drug-like privileged scaffolds in DELs. Thiohydantoin is an important nitrogen-containing heterocycle widely present in natural products, bioactive molecules, and marketed drugs (e.g., enzalutamide and apalutamide). Among thiohydantoin compounds, the 5-arylidene thiohydantoin derivatives, which have demonstrated a wide range of biological effects, have attracted much attention. Additionally, aldehydes, as widely available building blocks, offer new synthetic approaches for expanding the chemical space of such thiohydantoin-focused DELs. Based on this, we aimed to develop a method for the efficient synthesis of 5-arylidene thiohydantoin DELs under DNA-compatible conditions. The method involves the Knoevenagel reaction between DNA-conjugated thiohydantoins and aldehydes. First, we optimized the reaction conditions and identified the optimal parameters: DNA-conjugated thiohydantoin (200 pmol, 100 µmol/L in water), aldehyde (2500 nmol, 500 mmol/L in dimethyl sulfoxide (DMSO)), pyrrolidine (400 nmol, 200 mmol/L in DMSO), total reaction volume of 20 μL, organic-to-aqueous phase volume ratio of 1∶1, reaction temperature of 60 ℃, and reaction time of 1 h. Subsequently, we evaluated the substrate scope using different aldehydes and DNA-conjugated thiohydantoins. The results demonstrated a broad substrate tolerance, with most reactions achieving moderate to excellent conversions (50%~98%). This study supports the practical construction of DELs focused on the drug-like 5-arylidene thiohydantoin scaffold and expands the accessible chemical space of DELs.

Key words： DNA-encoded library; DNA-compatible chemical reaction; thiohydantoin; Knoevenagel condensation; aldehydes

Cite this article

Xianfu Fang , Yunzhu Ju , Qigui Nie , Xiaohong Fan , Huihong Wang , Yangfeng Li , Gong Zhang , Yizhou Li . Synthesis of 5-Arylidene Thiohydantoin Derivatives via DNA-Compatible Knoevenagel Condensation★[J]. Acta Chimica Sinica, 2025 , 83(10) : 1119 -1123 . DOI: 10.6023/A25050155

1 引言

自1992年Lerner和Brenner[1]提出DNA编码分子库(DNA-encoded library, DEL)概念以来, DEL作为一种结合组合化学与遗传编码优势的药物筛选技术, 已成为药物化学和化学生物学中用于发现活性化合物及分子探针的关键技术之一[2]. DEL是一种小分子化合物库, 每个化合物通过独特的DNA条形码记录其结构信息, 因此可通过亲和筛选高效地对数百万至数十亿化合物进行混合筛选, 从而鉴定能够与靶标蛋白结合的配体[3]. 其设计与合成通常采用“拆分-混合”(split-and-pool)策略, 交替进行3至4轮酶促连接反应与DNA兼容化学反应(DNA-compatible chemical reaction), 将化学结构基元(building blocks, BBs)与DNA条形码高效组装, 依据组合化学原理构建相应的DEL[4]. 在靶标蛋白筛选后, 通过富集样本中的DNA条形码的PCR (Polymerase chain reaction)扩增和测序, 可实现高亲和力的苗头化合物的解码, 并通过不连接DNA (off-DNA)合成进一步确认其化学结构并测试其活性[5](图1a). DEL具有库容量大、化学空间广、成本低等显著优势[6]. 目前, 研究人员已利用DEL技术筛选出大量针对多种疾病靶标的先导化合物和化学探针, 其中部分候选药物已进入临床试验阶段[2b,7], DEL也已成为大型制药公司和学术实验室开展先导化合物发现的核心技术平台.
图1 (a) DNA编码分子库的工作流程. (b)含有5-亚芳基硫代乙内酰脲的代表性生物活性分子. (c)前期的工作. (d)通过Knoevenagel缩合反应on-DNA合成5-亚芳基硫代乙内酰脲

Figure 1 (a) Workflow of DNA-encoded library (DEL). (b) Representative bioactive molecules containing 5-arylidene thiohydantoins. (c) Previous work. (d) On-DNA synthesis of 5-arylidene thiohydantoins via Knoevenagel condensation

尽管DEL技术已取得显著进展, 其潜力仍受限于DNA兼容化学反应种类的匮乏[8]. DEL分子库成员在化学本质上为DNA偶联物, 反应需在含水溶液体系中进行, 并具备高度的化学选择性, 同时确保DNA条形码的稳定性和完整性, 从而保持编码信息的准确性. 这使得许多传统有机化学反应难以直接应用于DEL合成[4a,8a]. 针对DEL建库的特殊性, 研究人员已开发多种DNA兼容反应, 包括酰胺键形成[9]、叠氮点击反应[10]、叠氮转移反应[11]、交叉偶联反应[12]、C—H键活化[12d,13]、光催化反应[14]、环加成反应[15]以及官能团转化[16]等.
在各种DNA兼容反应中, 杂环合成反应因杂环结构在药物设计中的独特优势而受到广泛关注[17]. 杂环化合物不仅广泛存在于药物分子中, 且能与多种靶标蛋白结合, 表现出丰富的生物活性. 在药物研发早期, 通过构建含杂环结构的化合物库进行筛选, 有助于显著提高先导化合物的发现成功率[17]. 其中, 硫代乙内酰脲作为一种重要的优势结构, 具有多种生物活性, 许多衍生物已被开发为临床药物, 例如用于治疗去势抵抗性前列腺癌的恩杂鲁胺(enzalutamide)和阿帕鲁胺(apalutamide)[18]. 5-亚芳基取代的硫代乙内酰脲衍生物可通过抑制雄激素受体、突变型异柠檬酸脱氢酶、PI3K/AKT通路等机制展现抗癌活性, 同时还可激活芳烃受体调节免疫反应、抑制NADPH (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)氧化酶以减轻神经炎症, 并具备抗菌和抗病毒活性[19](图1b).
基于硫代乙内酰脲作为优势骨架的结构特性, 我们近期开发了一种新型DNA兼容合成策略. 该策略利用DNA偶联的氨基酸衍生物与异硫氰酸酯或氨基底物进行高效环化反应, 从而构建该类杂环骨架[20](图1c). 以硫代乙内酰脲为核心进行进一步结构衍生具有重要价值. 而醛类化合物反应活性高、来源广泛, 可作为构建多样化结构的重要基元, 为拓展该类骨架的化学空间提供了新思路. 基于上述考虑, 本工作将Knoevenagel缩合反应引入DEL合成体系, 成功实现了5-亚芳基硫代乙内酰脲衍生物的高效合成, 为开发更具结构多样性的DEL提供了新方法(图1d).

2 结果与讨论

2.1 条件筛选

根据我们课题组[21]前期Knoevenagel反应条件的优化研究, 我们以DNA偶联的硫代乙内酰脲(a1)和苯甲醛(b1)作为模型底物进行了初步尝试(表1). 首先, 考察了不同有机碱对反应的影响(表1, Entries 1~10). 结果表明, 在测试的10种有机碱中, 四氢吡咯(pyrrolidine)的加入使反应转化率达到80% (表1, Entry 10). 此外, 在不添加有机碱的情况下未观察到目标产物的生成(表1, Entry 11), 表明有机碱在该反应中具有关键的促进作用. 随后, 我们评估了有机共溶剂对反应的影响(表1, Entries 12~16). 共溶剂的主要作用是溶解化学结构基元, 从而促进DNA兼容反应的顺利进行. 结果显示, 当使用二甲基亚砜(DMSO)作为有机溶剂时, 反应转化率可达97%(表1, Entry 16). 综上, on-DNA高效合成5-亚芳基硫代乙内酰脲的最佳反应条件如下: DNA偶联的硫代乙内酰脲(200 pmol, 100 µmol/L溶于水), 醛类化合物(2500 nmol, 500 mmol/L溶于DMSO), 四氢吡咯(400 nmol, 200 mmol/L溶于DMSO), 总反应体积为20 μL, 有机相与水相体积比为1∶1, 反应温度为60 ℃, 反应时间为1 h.
表1 反应条件筛选a

Table 1 Optimization of reaction conditionsa

Entry Base Solvent Conversionb/%
1 Morpholine DMA 18
2 Et3N DMA 5
3 DBU DMA 0
4 PMP DMA 0
5 PMDETA DMA 10
6 DABCO DMA 5
7 HTMP DMA 8
8 Piperidine DMA 50
9 Me6TREN DMA 12
10 Pyrrolidine DMA 80
11 — DMA 0
12 Pyrrolidine EtOH 80
13 Pyrrolidine MeOH 85
14 Pyrrolidine ACN 76
15 Pyrrolidine DMF 90
16 Pyrrolidine DMSO 97

a Conditions: DNA conjugate a1 (2 μL, 100 μmol/L in H2O, 0.2 nmol), solvent (3 μL), H2O (8 μL), benzaldehyde b1 (5 μL, 500 mmol/L in solvent), base (2 μL, 200 mmol/L in H2O), 60 ℃, 1 h; b Conversions were determined by UHPLC-MS (Ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry). DMA: N,N-dimethylacetamide; DBU: 1,8-diazabicyclo[5.4.0]- undecane-7-ene; PMP: 1,2,2,6,6-pentamethyl-4-piperidinol; PMDETA: pentamethyldiethylenetriamine; DABCO: 1,4-diazobicyclo[2.2.2]octane; HTMP: 2,2,6,6-tetramethylpiperidine; Me6TREN: tris(2-dimethylaminoethyl)amine; ACN: acetonitrile; DMF: N,N-dimethylformamide.

2.2 底物普适性考察

在确定了最佳的on-DNA构建5-亚芳基硫代乙内酰脲偶联物的反应条件后, 我们系统评估了不同取代基醛类底物的适用性(图2). 实验结果表明, 绝大多数底物表现出中等至优异的转化率(50%~98%). 在单取代苯甲醛衍生物(c2~c13)中, 不同电子效应的取代基(如供电子基甲氧基和吸电子基三氟甲基)均能获得良好的转化率(50%~98%), 且反应表现出广泛的官能团耐受性, 能够兼容卤素、氨基、醛基及羟基等反应性基团. 双取代苯甲醛衍生物(c14~c18)的转化率均超过90%. 在多取代苯甲醛中, 3,5-二甲基-4-羟基苯甲醛(c19)仅实现了41%的转化率, 而由于空间位阻效应，2,6-二甲基-4-羟基苯甲醛(c20)未检测到目标产物的生成. 此外, 萘醛类底物如6-二甲氨基-2-萘醛(c21)可实现67%的中等转化率. 值得注意的是, 杂芳基醛类底物表现出优异的兼容性: 含吡啶(c22)、喹啉(c23)、吲哚(c24)、苯并二氢呋喃(c25)、咪唑(c26)、吡唑(c27)、噻吩(c28~c29)及噻唑(c30~c31)结构的化合物转化率均在66%以上. 此外，放大规模反应、酶促连接实验和定量PCR (qPCR)分析结果表明, 该条件适用于分子库构建, 且反应后的DNA条形码保持了良好的结构完整性与可复制性(见支持信息图S2、S3和S4). 这些结果充分表明, 该反应具有良好的底物适用性, 能够兼容结构多样的(杂)芳基醛类结构基元. 结合醛类化合物的商业易得性与结构多样性, 该方法为构建高质量、覆盖广泛化学空间的DEL奠定了坚实基础.
图2 醛类化合物范围

Figure 2 Scope of aldehydes

为进一步验证该合成方法的普适性, 我们系统考察了DNA偶联硫代乙内酰脲的适用范围(制备方法见前期工作[19]). 23种DNA偶联的硫代乙内酰脲(a2~a24)均能有效参与反应, 转化率在70%~98%之间(图3). 值得注意的是, 卤素、氰基及硝基等敏感基团在标准条件下可以很好地兼容, 这对于构建类药性特征的DEL至关重要. 此外, 我们将该策略进一步拓展至杂合药物(hybrid drugs)领域. 通过整合两种及以上独立的药效团, 杂合药物可实现多靶点协同作用, 从而突破传统单一疗法的局限性. 我们选用四种临床药物(来那度胺、普鲁卡因胺、磺胺嘧啶和氨鲁米特)构建相应的DNA偶联物, 它们均以>70%转化率成功转化为含药物分子的5-亚芳基硫代乙内酰脲衍生物, 这有望提升DEL在药物筛选中的命中率与成功率.
图3 DNA偶联的硫代乙内酰脲范围

Figure 3 Scope of DNA-conjugated thiohydantoins

3 结论

综上, 本工作开发了一种温和的DNA兼容方法, 用于合成5-亚芳基硫代乙内酰脲骨架. 该方法采用多种DNA偶联的硫代乙内酰脲和醛类化合物为底物, 反应表现出中等至优异的转化率, 具有良好的官能团耐受性和操作简便性, 同时保持了DNA结构的完整性与可复制性. 这些结果为5-亚芳基硫代乙内酰脲衍生物的on-DNA合成提供了可行策略, 拓展了用于构建化学多样性硫代乙内酰脲聚焦分子库的合成工具箱, 并有望进一步推动该类候选药物的筛选与发现.

4 实验部分

在Axygen离心管中加入DNA偶联的硫代乙内酰脲(2 µL, 200 pmol, 100 µmol/L溶于水), 随后依次加入水(8 µL)、DMSO (3 µL)、醛类(5 µL, 2500 nmol, 500 mmol/L溶于DMSO)、四氢吡咯(2 µL, 400 nmol, 200 mmol/L溶于DMSO), 震荡混匀并离心, 置于60 ℃恒温金属浴中加热1 h. 反应结束后进行乙醇沉淀纯化, 使用超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS)检测反应结果.
Cheng, B.

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