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Acta Chimica Sinica >

2025 , Vol. 83 >Issue 11: 1324 - 1334

DOI: https://doi.org/10.6023/A25050141

Article

Photoacoustic/Near-infrared Ⅱ Fluorescence Dual-mode Imaging and Photo/Chemodynamic Synergistic Therapy Effects of DPP-PEG/BSA-MnO2

  • Li Jiaqi a ,
  • Huang Yanqin , a, * ,
  • Ding Guice a ,
  • Zhang Rui , b, * ,
  • Liu Xingfen a ,
  • Fan Quli a ,
  • Huang Wei , a, c, *
Expand
  • a State Key Laboratory of Flexible Electronics (LoFE), Institute of Advanced Materials (IAM), Nanjing University of Posts & Telecommunications, Nanjing 210023, China
  • b Department of Ophthalmology, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China
  • c Frontiers Science Center for Flexible Electronics (FSCFE), MIIT Key Laboratory of Flexible Electronics (KLoFE), Northwestern Polytechnical University, Xi'an 710072, China
*E-mail: ;
;

Received date: 2025-05-05

  Online published: 2025-07-07

Supported by

Basic Research Program of Jiangsu(BK20243057)

Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions(YX03001)

Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University, Jiangsu Province High-Level Hospital Construction Funds(YKK24271)

Fold

Abstract

In this paper, a multifunctional nanotheranostic agent DPP-PEG/BSA-MnO2 was constructed for photoacoustic (PA)/near-infrared fluorescence (NIR Ⅱ FL) dual-mode imaging and photodynamic (PDT)/photothermal (PTT)/chemodynamic (CDT) synergistic therapy effects. A diketopyrrolopyrrole (DPP)-based amphiphilic conjugated polymer, DPP-PEG, was synthesized by direct (hetero) arylation polymerization (DHAP) of a DPP derivative monomer modified with polyethylene glycol (PEG) hydrophilic side chains and another DPP derivative monomer substituted with 2-ethylhexyl side chains. DPP-PEG nanoparticles (NPs) exhibited strong fluorescence emission in the NIR II region of 1000~1400 nm with a fluorescence quantum yield of 0.374%, which can quickly light up the mouse's systemic vascular network within 2 min, achieving clear fluorescence imaging of brain and leg blood vessels. DPP-PEG was complexed with bovine serum albumin (BSA)-manganese dioxide (MnO2) to construct a water-soluble composite nanomaterial DPP-PEG/BSA-MnO2 (abbreviated as DPP-PEG/B-M). Comparative studies with DPP-PEG/B and B-M showed that DPP-PEG/B-M exhibited evident PDT/PTT/CDT synergistic effect in the tumor microenvironment (TME). Both DPP-PEG/B and DPP-PEG/B-M can effect-tively inhibit the proliferation effect in the tumor microenvironment (TME). Both DPP-PEG/B and DPP-PEG/B-M can effectively inhibit the proliferation of 4T1 tumor cells under 808 nm laser irradiation, as DPP-PEG produced excellent PDT/PTT synergistic effects. Compared with DPP-PEG/B, DPP-PEG/B-M showed a significant increase in cytotoxicity under the same conditions. The overexpressed glutathione (GSH) and H2O2 in TME can effectively convert MnO2 into Mn2＋, which further underwent a Fenton-like reaction with H2O2 to generate •OH, thereby producing additional CDT therapeutic effects. Furthermore, MnO2 reacted with H2O2 to produce O2, promoting the generation of 1O2 and enhancing the PDT effect. The consumption of MnO2 weakened the scavenging effect of GSH on •OH and 1O2, further synergistically enhancing the PDT/CDT effect. Moreover, DPP-PEG/B-M was injected into 4T1 tumor-bearing mice via the tail vein. 24 h post-injection, the photoacoustic and NIR-II fluorescence signals at the tumor site reached their highest intensity, indicating that DPP-PEG/B-M can be enriched to the tumor site through the enhanced permeation and retention (EPR) effect. Therefore, DPP-PEG/B-M exhibited excellent tumor-targeting photoacoustic imaging and NIR-II fluorescence imaging performance in 4T1 tumor-bearing mice, and was expected to be applied in PDT/PTT/CDT synergistic therapy guided by photoacoustic/NIR-II fluorescence dual-mode imaging, playing a role in precise and efficient tumor therapy.

Key words： conjugated polymers; manganese dioxide; dual-mode imaging; photodynamic therapy; photothermal therapy; chemodynamic therapy; synergistic therapy

Cite this article

Li Jiaqi , Huang Yanqin , Ding Guice , Zhang Rui , Liu Xingfen , Fan Quli , Huang Wei . Photoacoustic/Near-infrared Ⅱ Fluorescence Dual-mode Imaging and Photo/Chemodynamic Synergistic Therapy Effects of DPP-PEG/BSA-MnO2[J]. Acta Chimica Sinica, 2025 , 83(11) : 1324 -1334 . DOI: 10.6023/A25050141

1 引言

为了克服传统癌症治疗方法的局限性, 人们迫切需要发展新的治疗策略, 并与先进诊断方式结合, 提高精准医疗的效率. 近红外荧光(NIR FL)成像在生物安全性和检测分辨率方面比辐射成像具有显著优势, 特别是近红外二区(NIR-II, 1000~1700nm)荧光成像, 由于其信噪比高、穿透深度大和空间分辨率高等优越特性, 在癌症诊疗领域极具发展潜力[1-3]. 光声(PA)成像作为一种新兴的非辐射、非侵入性成像技术, 将光学成像的高对比度和高分辨率与超声成像的高穿透性相结合, 能实现超深生物组织成像[4-5]. 因此, 荧光/光声双模成像有望大大提高癌症的诊断效果[6-7].
近年来, 作为传统癌症治疗的替代策略, 光热疗法(PTT)和光动力疗法(PDT)因其低侵袭性、低毒性和高特异性而备受关注. 然而, 单一模式治疗受到一些内在条件和不良反应的限制. 例如, PTT依赖于光热剂将近红外光能转化为热能, 但残留的肿瘤细胞可能会迅速产生耐热性, 导致肿瘤复发和转移[8-9]. PDT依靠光敏剂在近红外激光照射下产生高细胞毒性的活性氧, 但由于肿瘤微环境(TME)缺氧, 其氧依赖性极大地限制了疗效[10-12]. 因此, 人们研究了PTT/PDT[13]、光热/化学动力疗法(PTT/CDT)[14]、PDT/PTT/CDT[15-16]等组合疗法的协同作用, 以提高治疗效果并减少副作用.
共轭聚合物具有吸光能力强、光稳定性高和毒性低等突出优点, 并且易于通过结构裁剪调节光谱范围. 基于共轭聚合物的纳米诊疗剂在肿瘤荧光/光声成像和光疗领域已经显示出巨大的发展潜力[17-18], 但由于共轭骨架的疏水性质, 这类材料的水溶性仍需要提高, 而且吸收、发射主要集中在近红外一区(NIR-Ⅰ, 700~1000 nm), 这限制了其在深层组织中的应用. 因此, 迫切需要开发新型NIR-II荧光发射共轭聚合物及其纳米诊疗剂来推进其在生物医学领域的研究应用[19].
如图1所示, 本文以吡咯并吡咯二酮(DPP)分子为共轭骨架的重复单元, 设计合成了两亲性共轭聚合物DPP-PEG, 并与牛血清蛋白(BSA)-二氧化锰(MnO2)复合, 构建了一种水溶性良好的多功能纳米诊疗剂DPP- PEG/BSA-MnO2(即DPP-PEG/B-M). DPP是一种内酰胺结构的共轭分子, 具有高平面性和缺电子性, 可以通过结构设计和修饰得到具有NIR吸收和发射以及光疗性能的衍生物[20-22]. DPP-PEG由聚乙二醇(PEG)亲水侧链修饰的DPP衍生物单体与另一种2-乙基己基侧链取代的DPP衍生物单体经直接(杂)芳基化聚合反应(DHAP)反应合成[23-24]. DPP-PEG纳米粒子在1000~1400 nm的NIR Ⅱ区域有较强的荧光发射, 荧光量子产率为0.374%, 能在2 min内快速点亮小鼠的全身血管网络, 实现小鼠脑部和腿部血管的清晰荧光成像.
图1 DPP-PEG/B-M的制备和肿瘤诊疗应用示意图

Figure 1 Schematic illustration of preparation and applications of DPP-PEG/B-M in tumor diagnosis and therapy

另一方面, MnO2作为一种理想的TME响应型多功能纳米材料, 可以通过以下途径提升抗肿瘤效果[25-27]: 与TME中的过表达的H2O2反应, 原位生成O2, 缓解肿瘤内缺氧情况, 增强PDT效果; 被TME中过表达的谷胱甘肽(GSH)和H2O2还原成Mn2＋, Mn2＋与H2O2进一步发生类芬顿反应生成高细胞毒性的•OH, 产生CDT效应; 通过还原反应消耗GSH, 从而减少GSH对1O2、•OH等活性氧的清除, 同时增强PDT/CDT效果. 由此, 本文通过将DPP-PEG/B-M与DPP-PEG/B、B-M进行对比研究, 表明DPP-PEG/B-M在TME中具有CDT效应, 并能够有效协同增强PDT效应, 在4T1细胞毒性实验中具有明显的PDT/PTT/CDT协同治疗效果; 并且, DPP- PEG/B-M对4T1荷瘤小鼠的肿瘤呈现良好的靶向光声成像和NIR-II荧光成像性能, 有望应用于光声/NIR-II荧光双模成像指导的PDT/PTT/CDT协同治疗.

2 结果与讨论

2.1 DPP-PEG的合成与表征

采用了近年来发展的一种环境友好、简便的DHAP聚合反应进行DPP-PEG的合成[23-24]. 如支持信息图S1所示, 首先合成了2, 5位接枝PEG侧链的DPP衍生物M1[28], 作为具有活性碳氢键的简单芳烃单体(支持信息, 图S2~S4), 2, 5位接枝2-乙基己基侧链的DPP衍生物M2作为卤代芳烃单体, 通过DHAP反应生成两亲性共轭聚合物DPP-PEG, 其分子量、核磁共振氢谱和红外光谱见支持信息(支持信息,图S5, S6). 如图2a, DPP-PEG水溶液呈蓝绿色, 其在水中溶解度约为0.5 mg/mL, 吸收光谱峰值在812 nm处, 荧光发射范围在950~1400 nm, 发射峰值在1100 nm处, 因此在NIR Ⅱ区域有较强的发射. 随后制备了DPP-PEG纳米粒子(NPs), 其在水中溶解度约为1.6 mg/mL, 粒径约为40 nm(支持信息, 图S7), 并测量荧光量子产率(QY), 以IR-1061为参比(QY=1.7%)[29], 根据公式S1计算得到DPP-PFG的QY=0.374%(支持信息, 图S8).
图2 (a) DPP-PEG水溶液的UV-Vis-NIR吸收光谱和808 nm激光激发的荧光光谱(插图: DPP-PEG水溶液的照片); (b) B-M, (c) DPP-PEG/B-M和(d) DPP-PEG/B的流体动力学尺寸和TEM图像; (e) B-M、DPP-PEG/B和DPP-PEG/B-M的流体动力学尺寸对比图; (f) B-M、DPP-PEG/B和DPP-PEG/B-M的Zeta电位

Figure 2 (a) UV-Vis-NIR absorption and fluorescence (λexc: 808 nm) spectra of DPP-PEG aqueous solution (inset: photograph of DPP-PEG aqueous solution); hydrodynamic sizes and TEM images of (b) B-M, (c) DPP-PEG/B-M, and (d) DPP-PEG/B; (e) comparison of hydrodynamic sizes of B-M, DPP-PEG/B, and DPP-PEG/B-M; (f) Zeta potentials of B-M, DPP-PEG/B, and DPP-PEG/B-M

2.2 DPP-PEG/B-M的制备与表征

首先, 将BSA与KMnO4反应制备了B-M[30], 若随后继续加入DPP-PEG, 则进一步得到纳米材料DPP-PEG/B-M, B-M中BSA的疏水结构与DPP-PEG的疏水共轭主链通过疏水效应有效结合在一起[25]; 此外, 基于类似的相互作用也制备了DPP-PEG/B作为对照. 由于BSA的引入, DPP-PEG/B-M在水中溶解度可达18 mg/mL. 三种纳米材料均具有较高的水溶性, 可以在水溶液中稳定保持数周. 图2b, 2c的流体动力学尺寸和透射电镜(TEM)图像显示B-M和DPP-PEG/B-M粒径分别在12和85 nm左右, 呈现大小均匀的球形. DPP-PEG/B-M较小的粒径有利于其通过增强渗透和保留(EPR)效应富集到肿瘤部位[31]. 如图2d, 2e, DPP-PEG/B粒径大约在122 nm左右, 为大小均匀的椭球形, 其粒径比DPP-PEG/B-M和B-M大很多; 又由图2f可知DPP-PEG/B, DPP-PEG/B-M和B-M的Zeta电位分别为－3.35, －16.8和－18.9 mV, 均为负值, 但DPP-PEG/B的电位相对高很多. 这说明可能在形成DPP-PEG/B-M和B-M的过程中, 负电位的MnO2产生较大的静电吸附作用, 使它们的粒径变小.
图3a中DPP-PEG/B-M的元素分析结果显示, 纳米粒子中除了存在C, N, O和S等元素外, 还存在Mn元素, 证明了MnO2的成功负载. 如图3b所示, DPP-PEG/B-M、DPP-PEG/B、B-M三种固体分别呈现黄绿色、蓝色和土黄色. 由于BSA为白色, DPP-PEG为蓝色, 这说明纳米粒子负载了MnO2以后会显示出部分黄色. 图3c显示, 当它们溶于中性磷酸盐缓冲溶液(PBS) (pH 7.4)中时, 溶液的颜色与固体的颜色相同, 但溶于弱酸性PBS (pH 5.5, 100 μmol/L H2O2)中时, DPP-PEG/B-M由黄绿色变为蓝色, 与DPP-PEG/B颜色相似, 而且溶液中产生了气泡, B-M也由黄色转变为浅粉色, 即Mn2＋的颜色, 但是DPP-PEG/B的颜色没有发生变化. 这说明DPP-PEG/B-M和B-M中负载的MnO2在弱酸性环境中与H2O2反应产生了Mn2＋和O2[25-27], 但是DPP-PEG/B中没有负载MnO2, 所以颜色不变. 进一步采用便携式溶解氧检测仪探测三种纳米粒子产生O2的能力, DPP-PEG/B不能生成O2(图3d), 而相同浓度的DPP-PEG/B-M和B-M分别与H2O2反应产生O2的能力相近, 6 min左右时产生的O2达到最大浓度10 mg/L, 此后产氧量逐渐下降, 9 min左右时降至6.5 mg/L. 因此, DPP-PEG/B-M能够与弱酸性TME中过表达的内源性H2O2反应, 有效缓解缺氧情况, 从而促进1O2生成, 提高PDT疗效.
图3 (a) DPP-PEG/B-M的能量色散X射线光谱图; (b) DPP-PEG/B, B-M和DPP-PEG/B-M的固态照片; (c) DPP-PEG/B, B-M和DPP-PEG/B-M在中性PBS (pH 7.4)和弱酸性PBS (pH 5.5, 100 μmol/L H2O2)中的溶液照片; (d)在酸性PBS(pH 5.5, 100 μmol/L H2O2)中的溶解氧浓度随时间变化; DPP-PEG/B、B-M和DPP-PEG/B-M在中性PBS (pH 7.4)和酸性PBS (pH 5.5, 100 μmol/L H2O2)中的(e) UV-Vis-NIR吸收光谱; (f)荧光光谱(激发波长: 808 nm)

Figure 3 (a) Energy-dispersive X-ray spectroscopy spectrum of DPP-PEG/B-M; (b) photos of DPP-PEG/B, B-M, and DPP-PEG/B-M solid state; (c) DPP-PEG/B, B-M, and DPP-PEG/B-M in the solution of neutral PBS (pH 7.4) and weakly acidic PBS (pH 5.5, 100 μmol/L H2O2); (d) time-dependent dissolved oxygen concentration of DPP-PEG/B, B-M, and DPP-PEG/B-M in acidic PBS (pH 5.5, 100 μmol/L H2O2); (e) UV-Vis-NIR absorption spectra and (f) fluorescence spectra (λexc: 808 nm) of DPP-PEG/B, B-M, and DPP-PEG/B-M in neutral PBS (pH 7.4) and acidic PBS (pH 5.5, 100 μmol/L H2O2)

我们还测试了DPP-PEG/B-M、DPP-PFG/B和B-M在中性PBS (pH 7.4)和弱酸性PBS (pH 5.5, 100 μmol/L H2O2)中的紫外-可见-近红外吸收光谱(图3e)和荧光光谱(图3f). DPP-PEG/B在中性和弱酸性PBS中的吸收和荧光光谱与DPP-PEG水溶液(图2a)的相似, 说明DPP-PEG与BSA复合对其吸收和荧光发射没有太大影响. 在中性PBS中, DPP-PEG/B-M在700~1000 nm范围的吸收与DPP-PEG/B相似, 而在400~700 nm范围的吸收比DPP-PEG/B大很多, 这是因为MnO2具有从200到700 nm的宽吸收范围[25], 而B-M在400~700 nm范围也出现了类似的MnO2特征吸收.
在弱酸性PBS中, DPP-PEG/B-M和B-M在400~700 nm处的吸收峰消失, 并且此时DPP-PEG/B-M与DPP-PFG/B的吸收光谱很相似. 这些现象说明DPP- PEG/B-M和B-M中负载的MnO2在弱酸性环境中与H2O2发生反应, 从而特征峰也随之消失. 从以上吸收光谱图可以说明, DPP-PEG/B-M在模拟肿瘤环境中产生特异性响应行为的同时, 不会对其中DPP-PEG的吸收性质造成影响. 另一方面, 在808 nm激光激发下, DPP-PEG/B-M与DPP-PFG/B在中性和弱酸性PBS中的荧光光谱很相似, 都在1000~1400 nm的NIR-II区域显示出较强的荧光(图3f), 说明DPP-PEG与B-M复合对其荧光发射性质没有太大影响. B-M中不含发光物质, 因此在中性和弱酸性PBS中都没有荧光发射.

2.3 体外光动力、化学动力学和光热性能

首先, 分别在中性PBS (pH 7.4)和弱酸性PBS (pH 5.5, 100 μmol/L H2O2)中, 以1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)为单线态氧(1O2)指示剂比较研究了DPP-PEG/B-M和DPP-PEG/B的体外光动力效果, 它们的吸收光谱在500~1000 nm处为宽峰, 且吸收峰在812 nm, 所以采用808 nm激光进行测试. 在含有DPP-PEG/B-M或DPP-PEG/B的中性PBS (pH 7.4)中, 检测DPBF随溶液激光(808 nm, 1 W/cm2)照射时间的紫外-可见吸收光谱变化(支持信息, 图S9a, S9c), 以420 nm处的吸光度随时间的变化拟合线性关系, 分别得到图4a中的紫色或绿色线条. 可以明显看出, 紫色线条比绿色线条的斜率大很多, 说明在中性PBS中, DPP-PEG/B-M比DPP-PEG/B产生1O2的能力更强, 1O2与DPBF反应更迅速, 从而使DPBF的吸光度在相同时间内下降幅度更大,这与DPP-PEG/B-M中MnO2产生的作用密切相关. 在含有DPP-PEG/B-M或DPP-PEG/B的弱酸性PBS(pH 5.5, 100 μmol/L H2O2)中进行类似的实验, 得到DPBF的紫外-可见吸收光谱变化图(支持信息, 图S9b, S9d), 以及图4a中的蓝色或橙色线条. 与前面的结果相似, 蓝色线条比橙色线条的斜率大很多, 进一步证明DPP-PEG/B-M中的MnO2在提高1O2产率方面发挥了重要作用. 而且, 橙色线条与绿色线条的下降辐度很接近, 说明PBS溶液的pH值没有对DPP-PEG/B自身产生1O2的能力产生太大影响, 而蓝色线条比紫色线条的下降辐度更大, 说明DPP-PEG/B-M在弱酸性PBS中比在中性PBS中产生1O2的能力更强, 这是因为在酸性溶液中MnO2与H2O2反应产生O2, 有利于1O2的生成[25-27]. 另外, 在与DPP-PEG/B-M、DPP-PEG/B相同的条件下测试了DPP-PEG在PBS (pH 7.4)中的光动力效果(支持信息, 图S9e), 并对三者的光动力效果进行比较(支持信息, 图S9f). DPP-PEG/B比DPP-PEG光动力效果稍有降低, 而 DPP-PEG/B-M比DPP-PEG光动力效果明显提升, 也说明了MnO2对产生1O2的促进作用.
图4 (a) DPBF在含有DPP-PEG/B-M或DPP-PEG/B的中性PBS (pH 7.4)或弱酸性PBS (pH 5.5, 100 μmol/L H2O2)中的吸光度变化与辐照时间(808 nm, 1 W/cm2)的线性关系; (b)在与DPP-PEG/B-M和DPP-PEG/B分别孵育后的4T1细胞内检测1 O2, 采用DCFH-DA作为荧光探针; DPP-PEG/B-M, GSH, H2O2和MB在NaHCO3缓冲溶液(25 mmol/L)中(c)混合不同时间后, MB的吸收光谱变化; (d)混合0.5 h后, MB的吸收光谱随GSH浓度(0~50 mmol/L)的变化; (e)在不同功率的激光(808 nm)激发下, DPP-PEG/B-M (400 μg/mL)的升温曲线; (f) DPP-PEG/B-M在激光(808 nm, 1.2 W/cm2)照射下的光热响应, 重复照射和关闭, 循环五次; (g) f图中的单次光热循环; (h)从图g的降温过程得到的时间与－lnθ的线性关系

Figure 4 (a) Linear relationship between absorbance changes of DPBF and irradiation time (808 nm, 1 W/cm²) in neutral PBS (pH 7.4) or weakly acidic PBS (pH 5.5, 100 μmol/L H₂O₂) containing DPP-PEG/B-M or DPP-PEG/B; (b) intracellular detection of ¹O₂ in 4T1 cells incubated with DPP-PEG/B-M and DPP-PEG/B using DCFH-DA as a fluorescent probe; (c) absorption spectral changes of MB in NaHCO₃ buffer (25 mmol/L) after mixing DPP-PEG/B-M, GSH, H₂O₂, and MB for different durations; (d) absorption spectra of MB at varying GSH concentrations (0~50 mmol/L) after mixing DPP-PEG/B-M, GSH, H₂O₂, and MB for 0.5 h; (e) temperature elevation curves of DPP-PEG/B-M (400 μg/mL) under 808 nm laser irradiation at different power densities; (f) photothermal response of DPP-PEG/B-M during five on/off cycles under 808 nm laser irradiation (1.2 W/cm²); (g) single photothermal cycle from (f); (h) linear relationship between time and −lnθ derived from the cooling phase in (g)

随后, 以2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)为探针, 比较了两种纳米材料在4T1肿瘤细胞中生成1O2的能力. DCFH-DA本身不发荧光, 但与细胞中的1O2反应后会生成DCFH, 发出绿色荧光[9,13]. 如图4b所示, 随着光照时间的延长, 用DPP-PEG/B-M或DPP-PEG/B孵育的4T1细胞内绿色荧光都逐渐增强, 在相同时间和光照的条件下, 用DPP-PEG/B-M孵育的细胞内绿色荧光明显更亮, 说明其的1O2生成量比DPP-PEG/B要多. 这进一步证明在弱酸性TME中, DPP-PEG/B-M中的MnO2能与内源性H2O2反应产生O2, 促进了1O2的生成, 从而有助于提高PDT效果.
TME中过表达的还原性GSH和H2O2都可以有效地将MnO2转化为Mn2＋, Mn2＋进一步与H2O2发生类芬顿反应生成高毒性的•OH, 导致细胞氧化损伤, 从而产生CDT疗效; 此外, MnO2对GSH的消耗削弱了GSH对•OH和1O2的清除作用, 从而可能协同增强PDT/CDT效应[15,27,32]. 用MB作为检测•OH的指示剂, 因为它可以被•OH降解, 导致吸光度降低[15,27]. 如图4c所示, 将DPP-PEG/B-M, GSH, H2O2和MB在NaHCO3缓冲溶液中混合, 随着混合时间的延长, MB在660 nm处的吸光度逐渐下降, 24 h后下降至初始吸光度的40%左右, 而在仅含MB的NaHCO3缓冲溶液中其吸光度几乎不变, 说明在这段时间DPP-PEG/B-M中的MnO2持续与GSH和H2O2反应产生Mn2＋, Mn2＋继续发生类芬顿反应产生•OH. 将图4c中的检测时间改为混合后0.5 h, GSH的浓度由4 mmol/L调整成在0~50 mmol/L 范围变化, 其余条件不变, 由图4d看到随着GSH浓度的增加, MB的吸光度显著下降; 当GSH的浓度为50 mmol/L时, 吸光度下降至空白对照样品的20%左右, 这归因于高浓度的GSH加速MnO2的转化, 从而释放更多的Mn2＋用于生成•OH. 因此, 以上实验充分证明DPP-PEG/B-M在TME中具有一定的CDT效应, 并能够有效协同增强PDT效应.
如图4e所示, 将DPP-PEG/B-M的水溶液(400 μg/mL)用不同功率的激光(0.6~1.2 W/cm2, 808 nm)分别照射10 min, 最高温度从45 ℃提高到了56 ℃. 选择在激光功率1.2 W/cm2条件下进行光热稳定性和光热转化效率测试. 从图4f可以看出, 在激光照射和关闭的五个循环周期中, DPP-PEG/B-M水溶液能达到的最高温度保持在 56 ℃左右, 说明其具有良好的光热稳定性, 对其中的单次光热循环(图4g), 参考文献方法[33]作出降温过程中时间与－lnθ的线性拟合图(图4h), 并根据支持信息中光热转化效率公式S2计算出光热转化效率η=21.1%, 说明DPP-PEG/B-M是一个具有良好近红外光热效应的复合纳米材料. 如支持信息, 图S10, DPP-PEG与DPP-PEG/B-M(含相同浓度DPP-PEG)水溶液在同样的激光照射条件下进行光热效果测试, 能达到58 ℃左右的最高温度, 光热转化效率η=30.8%, 比DPP-PEG/B-M的效果好一些. DPP-PEG的共轭主链主要聚集在纳米粒子内部, 外面包裹的大量BSA分子和PEG亲水链可能会减弱共轭主链的光吸收, 导致光热效果有所下降.

2.4 细胞毒性分析

首先, 用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法比较研究了DPP-PEG/B-M和DPP-PEG/B对NIH-3T3和4T1肿瘤细胞的毒性. 如图5a, 5b所示, NIH-3T3细胞在黑暗条件下分别与两种纳米材料共孵育, 当材料浓度提升到500 μg/mL时, 细胞存活率均保持在85%以上, 说明它们都具有良好的生物相容性; 而对于相同实验条件下的4T1细胞, 与500 μg/mL的DPP-PEG/B共孵育时, 细胞存活率仍在85%以上, 而与500 μg/mL的DPP-PEG/B-M共孵育时, 细胞存活率下降到71%, 这可以归因于DPP-PEG/B-M中的MnO2对肿瘤细胞的弱酸性微环境、过表达的GSH 和H2O2发生响应而转化成Mn2＋, 并触发类芬顿反应, 生成•OH, 产生CDT效应, 从而使4T1细胞的存活率下降[15,32]. 从图5c还看到, 4T1细胞经808 nm激光照射8 min, 当DPP-PEG/B浓度为500 μg/mL时, 单独PDT处理时约45%的细胞被破坏, 单独PTT处理时约58%的细胞死亡, PDT/PTT联合处理进一步诱导了约66%的细胞死亡, 说明其在光照条件下具有良好的PDT/PTT协同治疗效果[34]; 而当DPP-PEG/B-M浓度为500 μg/mL时, 细胞死亡率达到88%左右, 这证明PDT/PTT/CDT的协同作用大大提高了治疗效果.
图5 黑暗条件下(a)与DPP-PEG/B共孵育的3T3和4T1细胞存活率; (b)黑暗条件下与DPP-PEG/B-M共孵育的3T3和4T1细胞存活率; (c)经过DPP-PEG/B光动力、光热和光动力/光热联合治疗后的4T1细胞存活率, 经过DPP-PEG/B-M光动力/光热联合治疗后的4T1细胞存活率(808 nm激光照射8 min, 0.8 W/cm2); (d)与DPP-PEG/B-M共孵育的4T1细胞在(1)黑暗和(2)光照(808 nm, 0.8 W/cm2) 8 min条件下的AM/PI染色; 与DPP-PEG/B共孵育的4T1细胞在(3)黑暗和(4)光照(808 nm, 0.8 W/cm2)8 min 条件下的AM/PI染色

Figure 5 Cell viability of 3T3 and 4T1 cells coincubated with (a) DPP-PEG/B or (b) DPP-PEG/B-M under dark conditions; (c) cell viability of 4T1 cells after PDT, PTT and PDT/PTT treatment with DPP-PEG/B, and cell viability of 4T1 cells after PTT/PDT treatment with DPP-PEG/B-M (808 nm laser irradiation, 8 min, 0.8 W/cm²); (d) AM/PI staining of 4T1 cells coincubated with DPP-PEG/B-M: (1) under dark condition and (2) under laser irradiation (808 nm, 0.8 W/cm², 8 min); AM/PI staining of 4T1 cells coincubated with DPP-PEG/B: (3) under dark condition and (4) under laser irradiation (808 nm, 0.8 W/cm², 8 min)

另外, 通过活死细胞染色实验进一步验证了MTT法对4T1细胞的检测结果. 碘化丙啶(PI)的红色荧光表示被染色的死细胞, 钙黄绿素乙酰氧基甲酯(AM)的绿色荧光表示被染色的活细胞[16]. 如图5d (1, 3)所示, 在黑暗条件下与 DPP-PEG/B-M共孵育的4T1细胞存活的很多, 也有少量死细胞, 而与DPP-PEG/B共孵育的4T1细胞基本上都存活. 这与MTT实验结果相似, 说明DPP-PEG/B-M中的MnO2对肿瘤细胞的微环境发生响应而转化成Mn2＋, 进一步发生类芬顿反应, 产生了CDT效应. 图5d (2, 4)中, 在808 nm激光照射8 min条件下, 与DPP-PEG/B-M共孵育的4T1细胞基本上都死亡, 而与DPP-PEG/B共孵育的4T1细胞大部分死亡, 但还有少量存活. 这也印证了MTT实验结果, 说明DPP-PEG/B-M和DPP-PEG/B在光照条件下杀死肿瘤细胞的效果都显著提升, 且DPP-PEG/B-M的细胞毒性更强, 表明其具有通过PDT/PTT/CDT协同作用实现高效治疗的潜力.

2.5 近红外二区荧光成像和光声成像

如图6a所示, 将DPP-PEG NPs的PBS溶液通过尾静脉注射到小鼠中, 2 min后, 小鼠的全身血管网络被点亮, 尤其是腹部和脑部组织血管亮度更高, 脑部和后肢血管能被清晰地识别出来; 注射2~6 h后, 血管荧光强度逐渐变弱, 肝脏和脾脏荧光信号逐渐增强, 说明DPP-PEG NPs在通过这些器官逐渐代谢[35]. 随后, 我们研究了DPP-PEG/B-M在4T1荷瘤小鼠体内的NIR-II荧光和光声成像能力. 如图6b, 6c所示, 随着DPP-PEG/B-M浓度的增加(0~1.6 mg/mL), 荧光、光声信号强度越来越高, 并且能分别与浓度拟合得到线性关系. 根据这些实验结果, 采用4 mg/mL的DPP-PEG/B-M溶液通过尾静脉注射到小鼠体内进行NIR-II荧光和光声成像.
图6 (a)静脉注射DPP-PEG NPs的PBS溶液后不同时间点的小鼠全身血管NIR-II荧光成像; (b) DPP-PEG/B-M的PBS溶液浓度与NIR-II荧光强度的线性关系; (c) DPP-PEG/B-M的PBS溶液浓度与光声强度的线性关系; 静脉注射DPP-PEG/B-M的PBS溶液后不同时间点的4T1荷瘤小鼠(d)体内NIR-II荧光成像; (e)体内光声成像(激发波长均为808 nm, 红色圆圈代表肿瘤区域)

Figure 6 (a) NIR-II fluorescence imaging of systemic vasculature in mice at various time points post intravenous injection of DPP-PEG NPs in PBS; (b) linear relationship between the concentration of DPP-PEG/B-M in PBS and NIR-II fluorescence intensity; (c) linear relationship between the concentration of DPP-PEG/B-M in PBS and photoacoustic intensity; (d) in vivo NIR-II fluorescence imaging and (e) in vivo photoacoustic imaging of 4T1 tumor-bearing mice at different time points after intravenous injection of DPP-PEG/B-M in PBS (λexc: 808 nm; red circles indicate tumor regions)

从图6d看到, 在808 nm激光器照射下, 注射后0.5 h, 就在小鼠肝脏部位出现明显的荧光信号; 注射后12 h, 小鼠肿瘤部位开始出现明显的荧光信号; 注射后24 h, 肿瘤部位荧光信号的强度达到最高, 说明DPP-PEG/B-M能通过EPR效应富集到肿瘤部位[31]; 注射后24~48 h, 肿瘤部位的光声信号逐渐消失. 从肿瘤部位的光声图像(图6e)看到, 注射后12 h, 光声信号明显增强; 注射后24 h, 光声信号最强; 注射后24~48 h, 光声信号逐渐消失. 这些结果均与荧光成像结果相对应, 由此证实了DPP-PEG/B-M在活体中出色NIR-II荧光成像和光声成像性能, 从而使其在肿瘤诊断和引导PTT/PDT/CDT协同治疗领域有很好的应用前景.

3 结论

本文构建了一种水溶性良好的多功能纳米诊疗剂DPP-PEG/B-M. 首先, 通过直接芳基化聚合反应合成了 两亲性共轭聚合物DPP-PEG, 在1000~1400 nm的NIR Ⅱ区域有较强的发射, 其纳米粒子荧光量子产率为0.374%. 随后, 将DPP-PEG与B-M复合, 得到DPP-PEG/B-M, 同时制备了DPP-PEG/B进行对比研究. 由于BSA的引入, DPP-PEG/B-M比DPP-PEG的水溶性明显提高. 细胞实验证明, DPP-PEG/B和DPP-PEG/B-M都能在808 nm激光照射下有效抑制4T1肿瘤细胞的增殖, 因为其中的DPP-PEG产生了优良的PDT/PTT协同效应. 而且, 与DPP-PEG/B相比, DPP-PEG/B-M在相同条件下的细胞毒性有显著提升. 这是因为TME中过表达的还原性GSH和H2O2可以有效地将MnO2转化为Mn2＋, Mn2＋进一步与H2O2发生类芬顿反应生成•OH, 从而产生额外CDT疗效; 而且MnO2与H2O2反应产生O2, 促进了1O2的生成, 增强了PDT效应, MnO2对GSH的消耗削弱了GSH对•OH和1O2的清除作用, 进一步协同增强PDT/CDT效应. 活体实验证明, DPP-PEG纳米粒子的NIR II荧光能在2 min内快速点亮小鼠的全身血管网络, 有助于清晰地识别脑部和后肢血管, 而DPP-PEG/B-M对4T1荷瘤小鼠的肿瘤呈现良好的靶向光声成像和NIR-II荧光成像性能. 因此, DPP-PEG/B-M有望在光声/NIR-II荧光双模成像指导下实现PDT/PTT/ CDT协同治疗, 在肿瘤早期诊断和精准高效治疗中具有较好的应用潜力.

4 实验部分

4.1 DPP-PEG/B-M的制备

聚合物DPP-PEG的合成路线见支持信息图S1、操作步骤和结构表征见支持信息图S2~S6. 另一方面, 进行B-M的制备. 在室温下将50 mg的BSA溶解在1 mL超纯水中, 然后加入KMnO4 (20 mg/mL, 0.04 mL)反应1 h, 再移入到透析袋(截留分子量: 1 kD)中透析24 h, 然后冷冻干燥, 得到土黄色B-M纳米颗粒. DPP-PEG/B-M的制备步骤如下: 参考以上B-M制备方案进行BSA和KMnO4的反应之后, 不透析, 而是继续加入DPP-PEG水溶液(0.5 mg/mL, 1 mL), 室温搅拌反应4 h, 反应结束后再将溶液移入到透析袋(截留分子量: 1 kD)中透析24 h, 然后冷冻干燥, 得到黄绿色DPP-PEG/B-M纳米颗粒.

4.2 DPP-PEG/B的制备

在室温下将50 mg的BSA溶解在1 mL的超纯水中, 然后加入DPP-PEG(0.5 mg/mL, 1 mL), 室温搅拌反应4 h, 再放入透析袋(截留分子量: 1 kD)中透析24 h, 最后冷冻干燥, 得到蓝色DPP-PEG/B纳米颗粒.

4.3 溶解氧检测

将PBS缓冲溶液(100 μmol/L H2O2, pH 5.5)添加到三个密封袋中, 分别加入DPP-PEG/B-M、B-M和DPP-PEG/B的样品溶液(200 μg/mL), 再插入便携式溶解氧测定仪的传感器, 每隔0.5 min监测并记录一次溶解氧的产生量, 持续6 min.

4.4 体外单线态氧(1O2)测试

避光条件下将指示剂DPBF(50 μmol/L)分别溶于含有DPP-PEG/B-M、DPP-PEG/B两种纳米材料的PBS溶液(pH 7.4)中, 测试其紫外-可见吸收光谱. 然后, 用808 nm激光器(1 W/cm2)照射溶液, 每间隔一段时间测试一次吸收光谱, 共测试20 min. 另外, 将DPP-PEG/B-M、DPP-PEG/B分别溶于含100 μmol/L H2O2的PBS溶液(pH 5.5)作为对照组, 操作同上.
采用DCFH-DA作为指示剂研究了DPP-PEG/B-M和DPP-PEG/B在4T1细胞内产生1O2的情况. 在共聚焦培养皿中培养4T1细胞后, 加入DPP-PEG/B-M的杜氏改良Eagle培养基(DMEM)溶液, 继续孵育12 h, 然后在黑暗中加入DCFH-DA的DMEM溶液. 孵育10 min后, 用激光共聚焦荧光显微镜观察(CLSM)并记录未经光照处理的图像. 随后, 每隔5 min用808 nm激光器(100 mW/cm2)照射一次, 用 CLSM记录(以488 nm激发, 收集505~555 nm的绿色荧光信号), 共测三次. DPP-PEG/B的细胞内1O2测试方法同上.

4.5 体外光热性能测试

配制DPP-PEG/B-M (200 μg/mL)的水溶液, 分成4等份, 并分别用808 nm激光器(功率分别为0.6, 0.8, 1.0, 1.2 W/cm2)照射10 min, 再用FLIR E50光热成像仪记录每个离心管的温度变化. 然后, 采用功率1.2 W/cm2, 808 nm激光连续光照10 min后, 关闭激光器, 使其自然冷却到起始温度, 再打开激光器照射10 min, 如此重复五次, 绘制期间的温度变化曲线, 并选取其中的单次循环, 根据公式(支持信息, S2[33])计算光热转换效率η.

4.6 化学动力学性能测试

以MB为指示剂监测•OH的生成. 配制含有DPP-PEG/B-M (400 μg/mL), GSH (4 mmol/L), H2O2 (1 mmol/L), NaHCO3 (25 mmol/L)和MB (10 μg/mL)的溶液, 并与仅含相同浓度MB的NaHCO3溶液对照, 监测不同时间点MB的吸收光谱变化, 共测试24 h. 为了研究GSH浓度对•OH生成的影响, 调节以上混合溶液中GSH的浓度(0, 2, 4, 6, 12, 28, 50 mmol/L), 并监测混合0.5 h后MB的吸收光谱变化.

4.7 细胞毒性测试

将4T1细胞和3T3细胞分别接种在两块96孔板的各个孔中, 培养至细胞均匀铺满孔底. 配制DPP-PEG/B-M浓度分别为0, 50, 100, 150, 200, 500 μg/mL的DMEM溶液, 按浓度梯度加入每列孔, 继续孵育24 h; 然后, 在每个孔中加入MTT溶液(5 mg/mL, 10 μL), 再孵育4 h; 最后, 加入200 μL的二甲基亚砜(DMSO), 用酶标仪测量每个孔在490 nm处的吸光度, 计算相对细胞活性. DPP-PEG/B的细胞暗毒性测试同上. 为了检测对4T1细胞的光毒性, 用不同浓度DPP-PEG/B-M孵育24 h后, 对每个孔用808 nm (0.8 W/cm2)的激光器分别光照8 min, 继续孵育4 h, 再采用标准MTT法检测. DPP-PEG/B的细胞光毒性测试方法同上, 此外, 为了区分其在缺氧环境中的PDT和PTT效应, 还在冰温下对4T1细胞进行激光照射, 或用NaN3预处理以清除1O2.
同时, 采用AM/PI染色法对细胞毒性进行了评价. 将4T1细胞均匀地接种到两个培养皿里并孵育24 h, 待皿底被细胞完全贴满后取出, 吸尽皿中废液. 加入DPP-PEG/B-M的DMEM溶液(0.2 mg/mL)后, 孵育4 h, 皿1不用激光照射, 皿2用808 nm, 0.8 W/cm2的激光照射8 min, 再孵育30 min, 继续加入1 mL的含AM/PI染色剂的DMEM溶液, 孵育30 min以装载探针, 最后用CLSM进行测试, 收集AM/PI的荧光信号.

4.8 动物模型

所有动物实验均严格按照相关法律和江苏凯基生物技术有限公司制定的方案进行. 采用7~8周龄的裸鼠, 将4T1肿瘤细胞接种在其右前肢背部, 定期用游标卡尺监测肿瘤的大小, 待小鼠的肿瘤成长到120 mm2左右时, 用于荧光、光声成像实验.

4.9 体内近红外二区荧光和光声成像

配制DPP-PEG NPs的PBS溶液(200 μL, 0.8 mg/mL), 通过尾静脉注射于裸鼠中进行全身血管近红外二区成像. 再配制不同浓度DPP-PEG/B-M (0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6 mg/mL)的PBS溶液, 放入近红外二区荧光成像仪器上进行测试, 激发波长为808 nm, 滤光片为980 nm, 并绘制荧光强度与浓度相关的拟合直线. 根据实验结果, 选用浓度为4 mg/mL的DPP-PEG/B-M溶液进行活体实验, 通过尾静脉注射到4T1荷瘤裸鼠尾部, 并在近红外二区成像仪器上进行体内荧光成像, 然后每隔一段时间测试一次, 直至48 h. 对于光声成像, 先在光声成像仪上测试以上不同浓度DPP-PEG/B-M的PBS溶液的光声信号, 激发波长为808 nm, 并绘制信号强度与浓度相关的拟合直线, 根据实验结果, 选用浓度为4 mg/mL的DPP-PEG/B-M的溶液进行活体实验, 其它测试步骤与体内荧光成像实验类似.
(Lu, Y.)

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