1 引言
纳米材料由于其与抗生素不同的抗菌机制在“无抗生素”策略方面展现出广阔的应用前景[7-10]. 其中, 纳米酶作为可模拟天然酶功能的纳米材料, 在温和条件下能将生物环境中的分子转化为剧毒的活性氧(ROS), 通过氧化细菌内部的生物分子, 如脂质、蛋白质和DNA等, 使其化学结构改变甚至活性丧失, 从而杀死细菌. 例如, 类氧化物酶(OXD-like)纳米酶可将O2转变成有毒的超氧阴离子自由基($\mathrm{gO}_{2}^{-}$)[11], 而类过氧化物酶(POD-like)纳米酶可通过类芬顿反应催化低浓度的H2O2产生剧毒的羟基自由基(•OH)[12-13], 从而诱导细菌死亡. 纳米酶既能克服天然酶的稳定性差和制备成本高等缺点, 又具有纳米材料的可设计性、多功能性及可应用性, 在抗菌治疗方面极具优势[14-17]. 近年来, 金属纳米酶由于其高效的抗菌活性和低耐药性成为细菌感染治疗的有效替代策略[18], 包括贵金属[19]、金属有机框架[20]和金属氧化物[21]. 与贵金属纳米材料相比, 金属氧化物纳米酶通常具有较低的价格和简洁的合成工艺. 然而, 单一金属氧化物的抗菌性能受低催化活性和内在毒性的限制, 难以达到理想的治疗效果. CuO纳米酶因其优异的类过氧化物酶催化活性和良好的杀菌性能而被广泛研究. 与铁基纳米酶相比, CuO纳米酶具有更高的类POD催化活性和更宽的pH催化范围[22-23]. ZnO是一种被美国食品药品监督管理局(FDA)认可的安全成分, ZnO纳米酶除了具有良好的杀菌能力以外, 还具备极高的生物安全性[24]. 因此, 将以上两种金属氧化物的优势结合起来, 构建复合型金属氧化物纳米酶有望能改善现有金属氧化物纳米酶的抗菌治疗效果.
基于以上分析, 本研究旨在通过简易且成本低廉的方法, 以聚丙烯酸钠纳米球(PAAS NSs)为模板, 合成CuO/ZnO复合纳米球(CuO/ZnO NSs), 并详细探讨其多酶活性、抑菌性能、抗菌机理及生物安全性(Scheme 1). 实验结果表明, 合成的CuO/ZnO复合纳米球具备类氧化物酶和类过氧化物酶活性, 且复合纳米球的催化活性明显高于同样条件下得到的单一CuO纳米球和ZnO纳米球. 在微量H2O2存在下, 50 μg/mL的CuO/ZnO复合纳米球即可100%杀灭大肠杆菌(E. coli)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA). 抗菌机理研究发现, CuO/ZnO复合纳米球的杀菌功效主要来自于其对细菌膜的破坏和处理后细菌内部蛋白质的泄露. 此外, CCK-8实验证实CuO/ZnO复合纳米球具备良好的生物安全性. 本研究为金属基纳米酶在耐药菌感染治疗领域的应用提供了新的研究思路.
2 结果与讨论
2.1 CuO/ZnO复合纳米球的表征
首先, 我们制备了平均直径为150 nm的PAAS纳米颗粒, 然后引入六水合硝酸铜和氯化锌, Cu2＋和Zn2＋与PAAS水解产生的OH－结合形成前驱体, 最后经过煅烧去除PAAS模板得到CuO/ZnO复合纳米球. 在其他方法不变的情况下, 通过分别加入等量的铜盐和锌盐得到单独的氧化铜纳米球和单独的氧化锌纳米球, 用于后期的对比实验. 首先, 通过透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)观察了合成的CuO/ZnO复合纳米球的形貌. 从图1A和1B可以看出, CuO/ZnO纳米球为介孔球状, 平均粒径约为200 nm, 大小不均一, 这主要是由于聚丙烯酸钠(PAAS)模板粒径大小不均一导致的. 通过图1C的高分辨扫描电镜照片可以看到CuO/ZnO纳米球表面由多个小颗粒堆积而成. 从图1D的高分辨透射电镜照片中可以找到0.2538和0.2672 nm两种晶格间距, 分别对应CuO的(002)晶面和ZnO的(002)晶面[25-26]. 高角环形暗场扫描透射(HAADF-STEM)图像及元素映射成像分析证实了CuO/ZnO纳米球中Cu、Zn和O三种元素的存在(见支持信息图S1).
接下来, 我们通过X射线衍射(XRD)、傅里叶红外光谱仪(FTIR)、X射线光电子能谱仪(XPS)以及氮气吸附仪对材料的组成进行进一步的表征(图2). 通过XRD研究了CuO/ZnO纳米球的晶体结构, 结果显示所有衍射峰都能与标准氧化铜(PDF#48-1548)和标准氧化锌(PDF#76-0704)相对应, 说明制备的CuO/ZnO纳米球具有较好的结晶度和较高的纯度(见支持信息图S2)[27-28]. CuO/ZnO纳米球的FTIR光谱如图2A所示, 在PAAS 模板和前驱体的谱图上都能找到1500 cm－1处的PAAS中COO－的特征吸收峰, 而在CuO/ZnO中, COO－的吸收峰几乎消失, 意味着在最终得到的CuO/ZnO纳米球中, PAAS模板已基本被去除. 图2B为CuO/ZnO纳米球的XPS宽扫描全谱图, 可以明显找到Cu 2p、Zn 2p和O 1s三种元素的轨道峰. 根据以往的研究, 400 ℃煅烧条件PAAS虽已完成失重阶段, 但仍有残留碳, 因此在283.9 eV处我们仍可以找到C 1s的轨道峰[29]. 图2C中, 从Cu 2p的高分辨XPS图谱中可以发现位于933.2和953.3 eV的两处主峰, 分别对应Cu 2p1/2和Cu 2p3/2轨道, 在941.1、943.3和961.9 eV处能观察到三处卫星峰, 证实CuO/ZnO纳米球中Cu以二价形式存在[30-31]. 图2D为Zn 2p的高分辨XPS图谱, 1044.8和1021.8 eV分别对应Zn 2p1/2和Zn 2p3/2轨道. O 1s图谱中位于531.2和529.08 eV的两处特征峰分别对应Cu—O键及Zn—O键, 证实两种金属氧化物的存在(支持信息图S3)[24,32]. 此外, 通过氮气吸附/脱附实验研究了CuO/ZnO纳米球的比表面积和孔径分布(见支持信息图S4). 等温吸附-脱附曲线中的吸附支线的滞后现象表明其表面存在介孔结构, 这可能是PAAS模板被去除和热处理后小纳米颗粒的堆积形成的. CuO/ZnO纳米球的比表面积为21.05 m²/g, 平均孔径为15.93 nm. 材料的稳定性是后续抗菌实验的重要前提, 因此我们将合成的CuO/ZnO纳米球在H2O、磷酸缓冲溶液(PBS)、生理盐水和DMEM培养基中分散12 h观察溶液前后状态. 结果显示, 材料在不同生物溶液中放置12 h后没有明显变化, 且电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)结果证实材料未见明显离子释放现象, 证明了其良好生物稳定性(见支持信息图S5), 且CuO/ZnO纳米球中铜和锌的含量分别为480.4和488.1 μg/ mg. 以上结果充分验证了CuO/ZnO纳米球的成功合成.
图2 (A) CuO/ZnO纳米球的傅里叶红外光谱图、(B) CuO/ZnO纳米球的X射线光电子能谱图(XPS)和(C, D) CuO/ZnO纳米球的高分辨XPS能谱图[Cu 2p (C), Zn 2p (D)]Figure 2 (A) Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) spectrum of CuO/ZnO nanospheres, (B) X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) spectrum of CuO/ZnO nanospheres and (C, D) High-resolution XPS spectra of CuO/ZnO nanospheres [Cu 2p (C), Zn 2p (D)] |
2.2 CuO/ZnO复合纳米球的类酶活性评估
我们详细研究了CuO/ZnO纳米球的类酶催化活性(图3A). 类OXD活性可将空气中的氧分子转化成毒性$\mathrm{gO}_{2}^{-}$, 而类POD活性可催化H2O2分子产生•OH, 同时将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)和邻苯二胺(OPDA)氧化成蓝色的ox-TMB和黄色的ox-OPDA. 我们使用TMB和OPDA作为探针, 通过观察监测ox-TMB在654 nm处和ox-OPDA在414 nm处吸光度的变化, 同时观察溶液颜色变化来评估CuO/ZnO纳米球的OXD样和POD样活性. 从图3B可以看到, CuO/ZnO纳米球在无H2O2存在时可使溶液变蓝且在654 nm处有较强吸光值, 表明其存在类OXD活性. 而加入H2O2后, 溶液蓝色变深且吸光度增强, 说明CuO/ZnO纳米球具备POD样活性. 图3C和图3D分别是不同材料浓度和不同H2O2浓度下CuO/ZnO＋H2O2＋TMB溶液的颜色变化及其紫外光谱图, 结果说明CuO/ZnO纳米球的类POD活性具有浓度依赖性, 随着材料和H2O2浓度的增加, 催化活性变强. 接下来, 我们检验了以OPDA为探针时CuO/ZnO纳米球的类酶活性, 结果如图3E~3G所示, 得到的结论与TMB探针时基本相同. 不同pH值环境中CuO/ZnO纳米球的类POD酶活性变化结果表明pH值越低, 类POD酶活性越强. 因细菌和免疫细胞的厌氧发酵和呼吸, 感染阶段的伤口微环境通常表现为弱酸性, 这有利于CuO/ZnO纳米球类POD活性的发挥[33](见支持信息图S6). 值得注意的是, 我们利用以上两种探针比较了相同方法合成得到的CuO纳米球、ZnO纳米球及CuO/ZnO纳米球的类POD活性, CuO/ZnO组的催化活性明显高于单独的CuO纳米球和ZnO纳米球, 验证了我们设计思路的合理性(见支持信息图S7).
图3 (A) CuO/ZnO纳米球的类氧化酶活性(OXD-like)和类过氧化物酶(POD-like)活性示意图、使用TMB探针得到的不同组合(B)、不同浓度(C)及不同H2O2浓度(D)下的CuO/ZnO纳米球的类酶催化活性以及使用OPDA探针得到的不同组合(E)、不同浓度(F)及不同H2O2浓度(G)下的CuO/ZnO纳米球的类酶催化活性Figure 3 (A) Schematic representation of the OXD-like and POD-like enzymatic activities of CuO/ZnO nanospheres, enzyme-like catalytic activity of CuO/ZnO nanospheres obtained under different combinations (B), concentrations (C) and H2O2 concentrations (D) using TMB probe, and enzyme-like catalytic activity of CuO/ZnO nanospheres obtained under different combinations (E), concentrations (F) and H2O2 concentrations (G) using OPDA prob |
2.3 CuO/ZnO复合纳米球的抗菌性能研究
由于CuO/ZnO纳米球的多酶活性, 我们推测其可在微量H2O2环境中大量产生活性氧杀灭细菌, 因此, 我们采用平板计数法评估了CuO/ZnO纳米球对大肠杆菌(E. coli)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的杀灭效果. 图4A和图4B分别为不同浓度CuO/ZnO纳米球在有无H2O2存在时与细菌共同培养2 h后, 在胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板上形成的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌落图片. 图中可以看出, 抑菌效果随着CuO/ZnO纳米球浓度的增加而增强, 且加H2O2组的抑菌效果优于单独CuO/ZnO组, 说明类OXD和类POD的双重催化活性提高了CuO/ZnO纳米球的抗菌效果. 此外, 也评估了不同浓度的H2O2的杀菌效果, 结果显示单独的H2O2对E. coli和MRSA细菌无杀灭效果, 进一步证实CuO/ZnO纳米球的高效杀菌性能得益于其多酶活性产生的ROS(见支持信息图S8). 图4C和图4D为经CuO/ZnO纳米球和H2O2处理后以上两种细菌的存活率统计, 经50 μg/mL的CuO/ZnO纳米球处理后, 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的存活率分别仅为46.98%和7.37%, 而H2O2存在情况下50 μg/mL的CuO/ZnO纳米球对两种细菌的抑菌率均达到100%, 充分说明在H2O2存在下, CuO/ZnO纳米球可充分发挥其多酶活性, 从而高效杀灭细菌.
图4 有无H2O2存在时不同浓度的CuO/ZnO纳米球处理后(A) E. coli和(B) MRSA在平板上的菌落数以及(C) E. coli和(D) MRSA的细菌存活率统计图Figure 4 (A) Number of colonies of E. coli (A) and MRSA (B) on plates and statistical graph of the lower bacterial survival rate of (C) E. coli and (D) MRSA after CuO/ZnO nanosphere treatment after treatment with CuO/ZnO nanospheres at different concentrations, with and without the presence of H2O |
2.4 CuO/ZnO复合纳米球的抗菌机制研究
为了探究CuO/ZnO纳米球的抗菌机制, 我们通过扫描电镜直接观察了不同处理后E. coli和MRSA的表面形态, 结果如图5A和图5B所示. SEM图像显示空白组和单独的H2O2组中的E. coli呈现杆状结构, 而MRSA为球形, 两者均形状完整且表明光滑, 表明低浓度的H2O2对细菌没有影响. 然而, 在CuO/ZnO和CuO/ ZnO＋H2O2处理后的细菌表面均能观察到不同程度的损伤, 后者对两种细菌的损害程度更为严重. 随着材料浓度的提升, 细菌表面破损程度逐渐加深, 内容物开始泄露. 接下来, 我们检测了有无H2O2时不同浓度的CuO/ZnO处理后的细菌的蛋白泄露情况(图5C和5D), 与扫描电镜观察到的结果一致, 随着H2O2的加入和CuO/ZnO浓度的提升, 从细菌内部泄露的蛋白含量逐渐增多. 以上结果表明, CuO/ZnO纳米球可发挥其多酶活性, 催化H2O2产生大量ROS, 通过破坏细菌膜和诱导蛋白泄露, 从而导致细菌死亡.
图5 有无H2O2存在时不同浓度的CuO/ZnO纳米球处理后(A) E. coli和(B) MRSA的扫描电镜(SEM)图像(箭头为细菌破损处)及(C) E. coli和(D) MRSA的蛋白泄露统计图Figure 5 Scanning electron microscopy (SEM) images of E. coli (A) and MRSA (B) (arrows indicate bacterial damage sites) and protein leakage statistics of E. coli (C) and MRSA (D) after treatment with CuO/ZnO nanoparticles of different concentrations, with or without the presence of H2O2 |
2.5 CuO/ZnO复合纳米球的生物安全性
3 结论
细菌感染及其耐药性问题一直严重危害人类健康, 本研究通过简单可重复的方法成功合成了CuO/ZnO复合纳米球. 该纳米球具备双重类酶活性, 在微量H2O2存在时可充分发挥其OXD样和POD样酶活性, 通过产生的ROS达到高效灭菌效果. 平板计数实验证实, 浓度低至50 μg/mL的CuO/ZnO纳米球即可对大肠杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌产生100%的杀灭效果. 与已有文献中合成的CuO基和ZnO基材料相比, 本工作得到的CuO/ZnO复合纳米球在较低的有效浓度下能更快地达到优异抗菌效果(见支持信息表S1). 抗菌机制研究发现, 细菌膜的破坏和蛋白泄露是CuO/ZnO纳米球的主要杀菌机理. 此外, CuO/ZnO纳米球具备较高的生物安全性, 有望为耐药菌的感染治疗提供一种新策略.
4 实验部分
4.1 仪器与试剂
集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S, 巩义市予华仪器有限公司); 电热干燥箱(DHG-9070A, 上海一恒科学仪器有限公司); 透射电子显微镜(JEM-2100, 日本日立公司); 扫描电子显微镜(S-4800, 日本日立公司); 傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet, 美国赛默飞公司); 电感耦合等离子体质谱仪(Prodigy, 美国利曼公司); N2-吸附脱附分析仪(ASAP2460, 美国麦克仪器有限公司); 紫外可见分光光度计(Lambda365, 美国铂金埃尔默仪器公司); 高速冷冻离心机(Sorvall LYNX 4000, 美国赛默飞公司); CO2细胞培养箱(HERAcell150i, 美国赛默飞公司).
聚丙烯酸钠(99%, 美国Sigma公司)、异丙醇(分析纯, 北京国药化学试剂有限公司)、硝酸铜三水合物(99%, 上海麦克林试剂生化科技股份有限公司）、氯化锌(98%, 上海麦克林试剂生化科技股份有限公司)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(99%, 上海麦克林试剂生化科技股份有限公司)、邻苯二胺(98%, 上海麦克林试剂生化科技股份有限公司)、30%过氧化氢溶液(分析纯, 北京国药化学试剂有限公司)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin- EDTA, 99%, 上海利翰生物科技有限公司)、细胞增殖-毒性检测试剂盒(分析纯, 上海翌圣生物科技有限公司).
4.2 CuO/ZnO纳米球的制备
取0.4 g聚丙烯酸钠粉末, 将其加入含有40 mL超纯水的圆底烧瓶中. 超声分散后将其置于磁力搅拌器上搅拌30 min. 称取0.252 g六水合硝酸铜和0.144 g氯化锌, 分别将其溶于400 μL超纯水中. 随后, 在搅拌的条件下, 将上述两种溶液逐滴加入PAAS溶液中. 将混合溶液在室温下持续搅拌过夜, 以确保金属离子充分与PAAS纳米球充分结合.
将上述溶液以7000 r/min离心10 min, 收集沉淀物并使用超纯水洗涤两次, 再用无水乙醇洗涤一次. 将最终得到的沉淀物置于50 ℃的烘箱中烘干2 h, 得到前驱体粉末.
将干燥后的前驱体粉末放入箱式电阻炉中, 以1 ℃/min的升温速率升至400 ℃后煅烧3 h, 最终得到CuO/ZnO纳米球.
4.3 CuO/ZnO纳米球的类酶活性
3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)和邻苯二胺(OPDA)探针用于评估CuO/ZnO纳米球的OXD样和POD样酶催化活性. 具体而言, 称取4.80 mg的TMB和10.81 mg的OPDA, 分别溶解于250 μL的二甲基亚砜(DMSO)和1 mL的超纯水中, 称取4 mg的CuO/ZnO纳米球溶于4 mL超纯水中超声分散, 备用.
将CuO/ZnO纳米球、H2O2和探针以六种不同组合(过氧化氢、TMB/OPDA、过氧化氢＋TMB/OPDA、CuO/ZnO＋TMB/OPDA、CuO/ZnO＋过氧化氢和CuO/ZnO＋过氧化氢＋TMB/OPDA)加入到PBS溶液中(pH=4.5)并在室温下孵育10 min, 体系总体积为1 mL. 其中, H2O2的浓度为100 mmol/L. 随后, 观察溶液颜色变化并通过紫外可见吸收光谱仪测量溶液在652和414 nm处吸光值.
此外, 通过改变过氧化氢的浓度(0.05、0.1、0.2、0.5、1 mmol/L)和CuO/ZnO纳米球的浓度(0、25、50、100、150、200 μg/mL)以及PBS溶液的pH值(4.5、5.5、6.5、7.4)评估了CuO/ZnO纳米球催化活性对以上条件的敏感性.
4.4 CuO/ZnO纳米球的抗菌性能研究
4.4.1 培养基的配制
Luria-Bertan液体培养基: 称取25 g Luria-Bertani (LB)粉末, 加入1000 mL纯水, 121 ℃灭菌15 min, 冷却后于4 ℃备用.
固体培养基: 称取30 g TSB粉末和15 g琼脂粉末, 加入1000 mL纯水, 121 ℃灭菌15 min, 倒入培养皿中, 自然晾干后倒置待用.
4.4.2 细菌培养
选取革兰氏阳性菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和革兰氏阴性菌大肠杆菌(E. coli)作为研究模型. 将大肠杆菌(DH5α)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Mu50)从冷冻甘油储备中复苏后, 接种到LB培养基中, 在37 ℃摇床中培养12 h. 细菌悬浮液用pH=5.6的PBS稀释至OD=1.0后备用.
4.4.3 抗菌实验
配置浓度为1 mg/mL的CuO/ZnO纳米球溶液, 梯度稀释得到浓度为10, 20, 40, 80, 200 μg/mL的CuO/ZnO纳米球溶液. 随后, 将菌液稀释10倍并配制0.4 mmol/L过氧化氢溶液备用.
分别取50 μL菌液于离心管中, 加入50 μL以上不同浓度的CuO/ZnO纳米球溶液, 过氧化氢组再加50 μL的H2O2, 所有组均用PBS (pH=7.4)补至总体积为200 μL. 所有溶液置于摇床37 ℃、200 r/min培养2 h. 从每个实验组中取40 μL溶液均匀涂布于TSB固体平板上, 在37 ℃下继续孵育18 h. 以上实验重复三次, 通过ImageJ计算各组形成的菌落数量, 并统计各组细菌存活率, 各组存活率和抑菌率计算公式如下:
$\text { 细菌存活率 }=\frac{\text { 实验组平板菌落数 }}{\text { 对照组平板菌落数 }} \times 100 \%$
$\text { 抑菌率 }=\frac{\text { 对照组平板菌落数 }- \text { 实验组平板菌落数 }}{\text { 对照组平板菌落数 }} \times 100 \%$
4.5 CuO/ZnO纳米球的抗菌机理研究
4.5.1 细菌形态学观察
为了观察不同处理后细菌的形态变化, 将各组经过不同处理的细菌悬浮液, 在4 ℃下用2.5%戊二醛固定过夜. 随后, 细菌用体积分数为30%、50%、70%、90%和100%的乙醇水溶液逐级脱水10 min后取10 μL溶液滴于硅片上, 用扫描电子显微镜(SEM)观察各组细菌形态.
4.5.2 蛋白泄露
为了评估不同处理后细菌蛋白质泄漏程度, 离心收集以上各组菌液上清液, 加入96孔板中, 使用酶标记物和2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)蛋白质测定试剂盒, 通过紫外可见吸收光谱仪测定在562 nm处的吸收值以确定各组蛋白浓度.
4.6 CuO/ZnO纳米球的生物相容性研究
将培养好的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)用培养液混匀后接种到96孔板中培养12 h, 使细胞贴壁生长. 随后, 每孔加入100 μL不同浓度的CuO/ZnO纳米球溶液(5、10、20、40、100、150、200 μg/mL), 对照组以100 μL细胞培养液替代, 紧接着向每孔加入100 μL细胞培养液. 在37 ℃, 95%空气和5% CO2细胞培养箱中培养12 h后, 每孔加入100 μL稀释10倍的CCK 8溶液接着培养2 h, 最后测定各孔在λ=450 nm处的吸光度值.
4.7 统计分析
所有数据均进行了统计分析, 并以平均值±标准差(SD)表示. 使用双尾Student’s t检验来确定组间是否存在显著差异. p<0.05表示统计学意义(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001).
(Zhao, C.)