Review

Organic Small-Molecule Fluorescent Probes for Neurotransmitter Sensing and Bioimaging

  • Qian Meng a ,
  • Qiwei Zhang , a, b, *
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  • a Shanghai Key Laboratory of Green Chemistry and Chemical Processes, School of Chemistry and Molecular Engineering, East China Normal University, Shanghai 200241
  • b Institute of Magnetic Resonance and Molecular Imaging in Medicine, East China Normal University, Shanghai 200241

For the VSI “Rising Stars in Chemistry”.

Received date: 2025-05-31

  Online published: 2025-08-14

Supported by

National Natural Science Foundation of China(22322405)

National Natural Science Foundation of China(22274055)

Shanghai Pilot Program for Basic Research(TQ20240206)

Abstract

Neurotransmitters are essential mediators of neuronal communication, governing neural circuit plasticity and maintaining cerebral functional homeostasis. They can be classified into major categories including monoamines, amino acids, acetylcholine, neuropeptides, purines, gaseous neurotransmitters, etc. Deciphering the dynamic fluctuations in neurotransmitter concentrations and distributions is paramount for elucidating fundamental neurophysiological processes and unraveling the mechanisms underpinning neuropathological conditions, such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, etc. Fluorescence imaging technique employs specific probes that transduce the biochemical event of neurotransmitter recognition into a quantifiable optical signal, enabling non-invasive, highly specific visualization with high spatiotemporal resolution in live systems, representing an exceptionally promising class of tools for neurotransmitter detection. Owing to the compact size, excellent structural stability, high biocompatibility, tunable photophysical properties, and designable recognition mechanisms, organic small-molecule fluorescent probes act as ideal candidates for sensitive and selective neurochemical imaging. This review examines the advancements in the development and application of organic fluorescent probes for neurotransmitter detection, focusing on molecular designs, recognition principles (covalent or non-covalent interactions), signal transduction mechanisms (e.g., photoinduced electron transfer, intramolecular charge transfer, fluorescence resonance energy transfer), analytical performance, and their imaging capabilities in live cells, tissues, and in vivo models. A dedicated section provides a critical analysis of the prevailing limitations hindering broader application of current organic small-molecule fluorescent probes, such as challenges with reversibility, slow response times, photobleaching, limited multiplexing capability, insufficient blood-brain barrier penetration, and depth limitations in in vivo imaging. Building upon this assessment, we offer forward-looking perspectives on the future trajectory of fluorescent probe development. Key focus areas include engineering probes with enhanced binding kinetics and reversibility for real-time monitoring, superior photostability for longitudinal studies, capabilities for multiplexed analysis, ideal excitation/emission properties for deeper tissue penetration, and improved pharmacokinetic properties for efficient BBB crossing. This review aims to provide strategic design insights and a developmental roadmap for the next generation of high-performance neurochemical probes, thereby advancing fundamental neuroscience research and clinical diagnostic technologies.

Cite this article

Qian Meng , Qiwei Zhang . Organic Small-Molecule Fluorescent Probes for Neurotransmitter Sensing and Bioimaging[J]. Acta Chimica Sinica, 2025 , 83(10) : 1252 -1266 . DOI: 10.6023/A25050200

1 引言

神经递质作为调控生命活动的重要信息分子, 承担着神经元间及神经元与效应细胞间信号传递的核心功能[1-3]. 在神经传导过程中, 当神经元受到外界刺激或突触前信号激活时, 储存于囊泡内的神经递质通过胞吐作用从突触前膜释放至突触间隙, 以旁分泌形式作用于突触后膜特异性受体, 完成跨细胞信号转导[4]. 神经递质的合成、释放及再摄取受到多维度调控, 包括饮食结构失衡、环境毒素暴露、神经炎症反应、慢性应激及遗传多态性等因素均可干扰其代谢稳态[5-8]. 此类失衡可通过破坏神经环路动态平衡, 诱发神经退行性疾病[如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)]及精神类疾病(如抑郁症、精神分裂症)等多种病理过程.
神经递质根据其化学结构可分为单胺类(如, 多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、血清素、组胺)、氨基酸类(如, 谷氨酸、γ-氨基丁酸、甘氨酸、天冬氨酸)、胆碱类(如, 乙酰胆碱)、多肽类(如, 神经肽)、嘌呤类(如, 腺苷、三磷酸腺苷)、气态物质(如, 一氧化氮)和脂类(如, 内源性大麻素)等(图1)[9-11]. 这些分子通过调控突触可塑性、神经兴奋/抑制平衡及神经免疫对话等机制, 深度参与认知行为、学习记忆、情绪调节、觉醒周期及内分泌稳态等高级脑功能[12-14]. 以中枢神经系统内主要兴奋性神经递质谷氨酸(Glu)为例, 其不仅介导突触强化与神经发育, 还可通过过度激活N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体引发兴奋性毒性, 成为帕金森病(PD)与阿尔茨海默病(AD)等神经退行性疾病的共性病理机制[15-17]. 因此, 实时、快速、准确和特异性检测神经递质的含量、分布以及动态变化, 对揭示神经信号网络调控规律及实现精神类疾病的早期诊断至关重要.
图1 综述中包含的小分子神经递质结构

Figure 1 The neurotransmitter structures involved in the review

目前用于神经递质检测的方法主要包括电生理技术[18]、基因编码技术[19-20]、电化学法[21-23]、液相色谱法(LC)[24]、毛细管电泳法(CE)[25]及其联用技术, 如毛细管电泳-液相色谱联用(CE-LC)[26]、毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)[27]和液相色谱-质谱联用(LC-MS)[28]等. 然而, 上述方法在检测特异性、靶向性、无创性、时空分辨成像等方面仍然存在一些难以克服的局限. 相较之下, 荧光成像技术通过设计特异性荧光探针, 将神经递质的分子识别过程转化为可定量检测的光学信号, 结合共聚焦显微技术或双光子成像等技术, 可实现活体组织非侵入性、高时空分辨率的原位可视化分析[29-34]. 该技术的核心在于探针分子工程: 其识别基团的选择性、信号转导模块的灵敏度及生物相容性参数共同决定了检测效能. 本文系统综述近年来针对单胺类、氨基酸类及胆碱类小分子神经递质(图1)开发的有机荧光探针, 重点解析其分子设计策略、信号响应机制及生物成像应用进展.

2 有机荧光探针用于神经递质检测与生物成像的研究进展

有机小分子荧光探针因其多维可调控特性成为神经活性分子检测领域的核心工具: 其结构可修饰性强, 支持精准的共价识别反应设计; 光物理性质(如激发/发射波长、量子产率)可通过分子工程灵活调节; 同时兼具优异的生物相容性与低细胞毒性, 为活体动态成像提供了重要基础[35-44]. 目前, 针对小分子神经递质的荧光探针开发已形成系统性研究体系, 其设计策略主要基于目标分子的关键化学特征, 包括: 结构特异性基团、空间尺寸效应、电子分布特性等. 本文重点讨论探针的识别机制设计, 包括共价反应(如硼酸酯反应、席夫碱反应、迈克尔加成反应等)和非共价相互作用(如范德华力、氢键网络、静电作用、超分子主客体作用等); 荧光转导策略, 包括淬灭型、点亮型、比率型等信号输出类型, 以及光诱导电子转移(PET)、分子内电荷转移(ICT)等光物理响应逻辑; 此外, 对于探针的分析性能也进行了评估, 包括识别特异性、响应动力学、检测准确度/灵敏度, 以及生物相容性等.

2.1 单胺类

单胺类神经递质是一类具有芳基乙胺核心结构的生物活性分子, 主要包括多巴胺(Dopamine, DA)、去甲肾上腺素(Norepinephrine, NE)、肾上腺素(Epinephrine, EP)、5-羟色胺(Serotonin, 5-HT)及组胺(Histamine, HA). 这类分子通过调控突触信号传递参与运动、情绪、认知及自主神经系统的生理过程, 其浓度异常与神经退行性疾病(如帕金森病)、精神障碍(如抑郁症)和代谢综合征等病理状态显著相关, 因而被视为重要的生物标志物[45-46]. 从结构化学视角分析, 多巴胺、去甲肾上腺素与肾上腺素同属儿茶酚胺亚类, 其共性特征为兼具邻苯二酚基团和β-羟基胺基团, 这一结构上的高度相似性给三者的特异性识别带来了巨大的挑战.

2.1.1 多巴胺(DA)

多巴胺作为中枢神经系统中含量最丰富的儿茶酚胺(占比约80%)[47], 在脑脊液中的生理浓度范围为0.5~25 nmol/L[48], 通过作用于多巴胺受体调控运动协调、奖赏机制、认知决策及神经内分泌稳态. 其信号通路的失调已被证实与多种疾病存在密切关联, 如帕金森病、精神分裂症和多动综合征[49]. 鉴于多巴胺在病理诊断中的关键价值, 研究者已发展出基于有机小分子探针识别的荧光传感策略, 本节主要从以下四种传感机制进行介绍.
第一类传感策略是基于邻苯二酚与金属离子的高亲和力配位特性, 通过竞争性配体交换实现信号转导. Seto等[50]设计合成了Fe²⁺-钙黄绿素蓝复合探针1. Fe²⁺与钙黄绿素蓝配位后引发荧光淬灭, 而多巴胺因邻苯二酚基团与Fe²⁺的配位常数更高, 可竞争性置换钙黄绿素蓝分子, 解除PET效应并恢复荧光(图2a). 选择性实验表明, 虽然探针1与肾上腺素、去甲肾上腺素有一定程度的荧光响应, 但与多巴胺反应荧光更强, 因此可以实现特异性检测多巴胺. 该体系在50 μmol/L~1 mmol/L范围内呈现线性响应, 检测限达10 μmol/L, 与酶联免疫测定相比, 该方法简单且经济, 适用于药物制剂中多巴胺的快速低成本检测. 基于同样的策略, Suzuki等[51-52]设计了基于氰基吡喃衍生物(探针2)和氟硼吡咯(BODIPY)荧光团(探针3)的新型探针系统, 该系列探针不仅使发射波长得到了红移, 检测限降低到了1.1 nmol/L, 还实现了选择性的提升, 可应用于人血清中多巴胺的特异性检测.
图2 (a)探针1~3的化学结构和探针1对多巴胺的检测机制示意图; 探针4 (b), 5 (c)和PBA-CA (d)用于多巴胺识别的机制示意图

Figure 2 (a) Chemical structure of probes 1~3 and schematic diagram of the detection mechanism of probe 1 toward DA; schematic diagram of the mechanism of probes 4 (b), (c) 5 and (d) PBA-CA for the recognition of DA

第二类传感策略是基于间苯二酚和多巴胺之间发生氧化-加成-环化的级联反应. 如图2b所示, Jia和Dai等[53]利用该原理实现了对多巴胺的检测: 多巴胺首先被氧化为醌式结构(多巴胺醌), 后者作为亲电试剂与富电子的探针4发生迈克尔加成反应, 随后经历分子内环化. 该反应在5 min内即可完成, 最终生成具有高荧光量子产率(72.6%)的环状芳香化合物, 并通过抗干扰实验证明常见干扰物对探针4与多巴胺的反应无明显影响, 具有较高的选择特异性. 此外, 该方法已成功应用于人体尿液样本中多巴胺的测定, 展现出良好的临床应用前景. 基于此工作, Sun和Yang等[54]采用结构相似的间萘二酚, 开发了用于比色与荧光双模式检测多巴胺的策略. 该方法具有优异的选择性和抗干扰性能, 并且其反应产物在水溶液中呈现强可见光吸收, 荧光量子产率高达78%. 该方法已实现了在稀释的血清中检测多巴胺.
第三类常见的多巴胺检测方法基于硼酸与邻苯二酚缩合形成五元环硼酸酯的原理. Qin团队[55]利用硼酸基团修饰的 BODIPY 衍生物(探针5)检测多巴胺(图2c). 该探针对多巴胺表现出良好的选择性, 优于其他分析物(如抗坏血酸、肾上腺素和酪胺). 然而, 由于多巴胺与邻苯二酚分子结构相似, 两者与探针反应后均可引发光诱导电子转移(PET)过程并导致荧光淬灭, 因此难以区分. 为解决此问题, 研究者基于pH 7.4水溶液中多巴胺带正电荷[56]而邻苯二酚呈中性的特性, 设计了含有探针5和阳离子交换剂的疏水性聚合物膜. 该膜可有效过滤中性邻苯二酚的干扰, 显著提升了对多巴胺的选择性. Liu等[57]则采用结构简单的3-羟基苯基硼酸(3-HPBA)分子鉴定多巴胺, 整个测定过程可在5 min内完成. 由于探针与去甲肾上腺素及多巴胺反应产物的最大吸收波长分别为488和417 nm, 因此该探针能够直接进行选择性检测多巴胺. 这种方法已成功应用于人类血清样本中的多巴胺传感.
第四类检测多巴胺的方法是基于多巴胺诱导的双荧光团分子间自共价偶联策略. 如图2d所示, Tomapatanaget团队[58]报道了荧光探针(PBA-CA), 该探针利用硼酸衍生物PBA特异性共价结合儿茶酚胺的邻苯二酚基团, 同时其醛基香豆素衍生物CA组分则通过醛基与多巴胺的伯胺发生席夫碱反应. 形成的三分子偶联产物可触发从芘基团到香豆素基团的荧光共振能量转移(FRET), 引起荧光信号的变化, 进而产生可检测的荧光信号变化. 值得注意的是, 单独的探针PBA可以与肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺发生酯化反应生成硼酸酯, 在451 nm处荧光增强. 而探针PBA与CA共同存在时, 只能与去甲肾上腺素和多巴胺发生分子间自共轭反应, 诱导荧光共振能量转移机制的发生, 使得在451 nm处的荧光消失, 487 nm处的荧光增强. 而肾上腺素的仲胺无法与CA的醛基反应生成席夫碱, 故不能形成三分子复合物及诱导FRET, 仅显示451 nm处的荧光增强. 基于上述荧光信号的显著差异, 该策略可在pH 7.4的缓冲溶液中有效区分肾上腺素与其他两种儿茶酚胺, 并实现对去甲肾上腺素和多巴胺总量的检测.

2.1.2 去甲肾上腺素(NE)

去甲肾上腺素的传递功能障碍与多种神经退行性疾病及精神疾病密切相关, 如癫痫、阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)[59]. 尽管当前去甲肾上腺素检测技术已取得一定进展, 但在活体神经元中实现高精度、高特异性、高时间分辨率的瞬时去甲肾上腺素动态直接可视化与精确定量, 仍面临严峻挑战[60].
Glass团队[61]开发了一系列基于醛基-氨基反应机制的探针分子: 其利用分泌囊泡内的酸性环境, 使亚胺产物质子化形成带电复合物, 通过强荧光响应实现单胺类神经递质检测. 该小组首先开发了探针分子6, 在3-醛基香豆素的4位引入甲氧基苯基调节荧光特性, 与分析物反应后触发荧光开启(图3a). 该探针可与儿茶酚胺及伯胺类氨基酸反应并呈现不同程度的荧光增强, 造成其选择性有限. 然而, 基于分泌囊泡内儿茶酚胺的高浓度特性, 可忽略低浓度氨基酸神经递质的干扰, 从而选择性成像囊泡内的去甲肾上腺素与多巴胺; 同时利用醛基与仲胺的弱结合特性, 可有效区分富含去甲肾上腺素和富含肾上腺素的嗜铬细胞群(图3b). 接着, 该小组[62]合成了探针7(图3a), 可以与去甲肾上腺素、多巴胺及谷氨酸结合形成亚胺离子, 产物通过分子内电荷转移(ICT)机制显著增强荧光, 且最大吸收/发射波长较探针6明显红移, 在生物应用中兼具更低光损伤与更强组织穿透能力. 为了提升对去甲肾上腺素的特异性, 该小组[63]制备了探针8(图3a). 该探针引入硼酸基团增强对儿茶酚胺邻苯二酚基团的亲和力, 并将香豆素荧光团替换为富电子喹啉结构以降低淬灭效应. 其与去甲肾上腺素反应后吸收波长从428 nm红移至473 nm, 荧光强度倍增; 而对其他儿茶酚胺则呈现不同程度的荧光淬灭, 由此实现选择性检测. 通过510 nm荧光电流法结合全内反射荧光(TIRF)显微镜观测, 该传感器可对富含去甲肾上腺素的嗜铬细胞进行明亮成像, 并捕捉单个细胞胞吐后的荧光淬灭现象, 实现了对去甲肾上腺素释放过程的动态追踪.
图3 (a)探针6对去甲肾上腺素的检测机制示意图及传感器6~8的化学结构; (b)用探针6和PNMT抗体染色富含去甲肾上腺素和肾上腺素的混合嗜铬细胞图(绿色圆圈内的细胞表示NE富集细胞, 红色圆圈内的细胞表示EP富集细胞)[61]

Figure 3 (a) Schematic diagram of the detection mechanism of probe 6 toward NE, and chemical structures of probes 6~8; (b) stain mixed chromaffin cells rich in norepinephrine and adrenaline with probe 6 and PNMT antibody (cells circled in green indicate NE-enriched cells, and cells circled in red indicate EP-enriched cells)[61], Copyright 2013, American Chemical Society

阴彩霞团队[64]开发了一种基于亲核取代-环化级联反应的新机制: 首先, 去甲肾上腺素的强亲核性伯胺基团优先进攻探针硫代碳酸酯位点, 触发离去基团解离; 随后, β-羟基作为分子内亲核试剂进攻羰基碳, 形成稳定的五元环内酯结构并释放荧光团. 此设计巧妙规避了其他胺类物质通过分子内光诱导电子转移(PET)引发的荧光淬灭问题, 同时利用去甲肾上腺素特有的伯胺-β-羟基共定位结构, 显著提升了选择性(图4a). 基于此机制, 团队构建了探针9: 该探针采用螺环开闭环调控的荧光素作为信号单元, 结合4-甲基苯硫酚作为活性离去基团, 与去甲肾上腺素反应后成功实现了荧光信号的增强(图4b). 该探针为去甲肾上腺素能神经元的原位可视化提供了高特异性工具, 在神经递质动态监测中具有重要价值. 后续, 该团队[65]使用相同的方法设计了探针10 (图4b), 引入长波长发射的花菁骨架及磺酸根基团增强水溶性, 响应时间缩短至50 min. 为了进一步提高探针的信噪比, 该团队[66]以半花菁-苯并吡喃鎓共轭体系为骨架构建近红外探针11(图4b), 该探针与去甲肾上腺素结合后在724 nm处荧光增强. 为了进一步提高荧光探针对去甲肾上腺素的响应效率, 该团队提出了一种“狩猎-射击”策略[67-68], 设计合成了具有醛基和邻位酯基的双位点识别探针12(图4b, 4c). 其中醛基可以与氨基快速反应实现去甲肾上腺素的预富集, 然后β-羟基亲核环化形成五元环, 环内-NH-进攻邻位酯基释放荧光团. 该设计将检测时间压缩至12 min, 并实现血脑屏障有效穿透, 成功应用于癫痫小鼠脑部去甲肾上腺素的实时原位成像(图4d).
图4 (a)探针检测去甲肾上腺素的级联亲核取代机制; (b)探针9~12的化学结构; (c)探针检测去甲肾上腺素的“狩猎-射击”策略; (d)小鼠脑荧光变化: (ⅰ)经尾静脉注射探针12后监测, (ⅱ)经尾血管注射探针12前(左)和后(右)监测, (ⅲ)通过解剖实验观察癫痫发作和非癫痫发作小鼠脑的荧光强度[68]

Figure 4 (a) Cascade nucleophilic substitution mechanism for probe detection of norepinephrine; (b) chemical structures of probes 9~12; (c) the "hunting-shooting" strategy for probe detection of norepinephrine; (d) changes in mice brain fluorescence (ⅰ) monitored after the injection of probe 12 via the tail vein, (ⅱ) before (left) and after (right) epileptic injection of probe 12 via tail vein, (ⅲ) fluorescence intensity of the mice brains with and without epileptic seizure by anatomical experiment[68], Copyright 2023, American Chemical Society

尽管上述策略的引入显著提升了探针对去甲肾上腺素的响应速率, 但其响应时间仍然在分钟级(>10 min). 然而, 生物体内神经递质的动态过程(包括转运、释放、扩散及与受体结合)通常在秒级至毫秒级时间尺度内完成. 这一矛盾凸显出现有化学探针在时间分辨率上的根本性局限, 难以满足神经递质瞬态信号捕捉的需求. 因此, 突破检测探针的反应动力学瓶颈已成为该领域亟待解决的关键科学问题.
针对这一挑战, 我们课题组[69]率先提出分子构象工程策略, 通过精准调控探针的构象以优化反应过渡态能垒, 从而实现对反应动力学的加速. 如图5a所示, 我们创新性地设计并合成了具有动态折叠构象的双光子荧光探针BPS3. 其分子结构设计包含两大核心要素: (1)末端修饰的S-对甲苯硫代碳酸酯作为特异性识别基团, 可与去甲肾上腺素分子中的伯胺基和β-羟基发生级联亲核取代-环化反应, 展现出优异的选择性(图5b); (2)引入构象可调的分子骨架, 通过共价和非共价两种策略实现对探针分子伸展构象与折叠构象的精准调控(图5c). 荧光动力学研究发现, 探针在折叠构象比伸展构象时反应速率提升了105倍, 能够在短至100 ms的时间内完成对去甲肾上腺素的光谱响应(图5d). 该探针在0~200 nmol/L浓度范围内呈现良好的线性响应, 检测限低至0.5 nmol/L, 满足了神经元内低浓度去甲肾上腺素检测所需的线性范围和灵敏度要求. 更值得关注的是, 探针的双正电荷特性赋予其优异的细胞膜靶向能力, 而近红外双光子激发特性则有效规避生物自发荧光的干扰. 基于这些优势, 我们成功实现了活体神经元在K⁺刺激下去甲肾上腺素的快速胞吐过程(<2 s)的动态示踪, 并通过急性阿尔兹海默病模型小鼠脑切片成像, 揭示了神经元中去甲肾上腺素水平下调与阿尔兹海默病病理以及抗氧化治疗之间的密切联系. 此项工作不仅革新了去甲肾上腺素检测的时空分辨率极限, 更重要的是揭示了构象折叠介导的过渡态能垒调控机制, 为超快生物传感探针的设计提供了全新范式.
图5 (a)探针BPS3通过构象折叠和水桥的双重加速增强对去甲肾上腺素的超快传感机制示意图[69]; (b)探针BPS3对去甲肾上腺素的检测机制示意图[69]; (c)用共价或超分子方法进行分子构象调节的示意图. 探针BPS3的化学结构[69]; (d) BPS2、BPS3、BPS4和BPS3+CB[7]水溶液的归一化荧光响应动力学, 插图: BPS3和BPS4对NE的响应的部分曲线的放大图[69]

Figure 5 (a) Schematic diagram of the ultrafast sensing mechanism of probe BPS3 for norepinephrine through dual acceleration of conformational folding and water bridging[69]; (b) schematic diagram of the detection mechanism of probe BPS3 toward NE[69]; (c) schematic of molecular conformational regulations by covalent or supramolecular approaches[69]; (d) normalized fluorescence response dynamics of aqueous solution of BPS2, BPS3, BPS4, and BPS3+CB[7], Inset: enlarged view of the partial curve for the response of BPS3 and BPS4 toward NE[69], reproduced under a CC BY license

为进一步突破性能极限, 我们于同年开展了探针结构的系统性优化研究, 成功构建了近红外比率型荧光探针13a~13d(图6a)[70]. 通过密度泛函理论(DFT)计算发现, 水分子可参与形成六元环过渡态, 促进分子间质子转移, 从而降低反应能垒1.8 kcal/mol, 使动力学提升约680倍(图6b). 同时, 对硫酚离去基团的理性设计表明: 对位强吸电子基团(如—F)可通过诱导效应增强羰基碳的亲电性, 使氨基亲核进攻的活化能进一步降低. 得益于上述双重加速机制, 最终将探针响应时间缩短至60 ms(图6c), 创下目前化学探针检测去甲肾上腺素的最快记录. 同时, 得益于级联反应识别原理, 探针对去甲肾上腺素表现出很高的检测特异性, 其他单胺类神经递质与探针13a的响应可忽略不计. 因此该探针凭借近红外双通道自校准(F710/F805)、超快响应及nmol/L级灵敏度等优势, 已成功应用于活神经元、急性脑切片和活体小鼠脑内去甲肾上腺素的实时、快速精准分析与荧光成像(图6d), 为神经退行性疾病机制研究提供了强有力的工具.
图6 (a)探针13的化学结构及其传感示意图[70]; (b)探针13a在含水量不同的乙腈-水混合溶剂中的反应动力学[70]; (c)通过计算得出在探针13a~13d和NE之间的亲核取代过程中, 可能反应坐标的相对能量[70]; (d)探针13a在正常小鼠、帕金森病(PD)模型小鼠以及经N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理的PD模型小鼠的四个大脑区域组织切片荧光图像、体内成像以及相应的荧光变化柱状图[70]

Figure 6 (a) Chemical structures of probe 13 and its sensing schematic diagram[70]; (b) Reaction kinetics of probe 13a in acetonitrile-water mixed solvents with different water contents[70]; (c) Calculate the relative energy of possible reaction coordinates during the nucleophilic substitution process between probes 13a~13d and NE[70]; (d) Fluorescence images of tissue sections from four brain regions, in vivo imaging, and corresponding fluorescence change histograms of probe 13a in normal mice, Parkinson's disease (PD) model mice, and PD model mice treated with N-acetylcysteine (NAC) [70]. Copyright 2023, American Chemical Society

超分子主-客体荧光探针基于大环化合物与底物的非共价相互作用构建[71-82], 凭借其多位点功能化潜力、可调控的光物理性质及底物识别选择性, 在生物活性分子检测领域备受关注[83-87]. 田阳团队[88]据此开发了一种去甲肾上腺素超分子荧光探针, 该体系通过主体葫芦[10] 脲(CB[10])与客体分子14自组装形成(图7a). 其检测机制依赖于双位点协同识别: 客体分子14的醛基与去甲肾上腺素氨基经席夫碱反应生成亚胺; 硼酸基团与邻苯二酚基团缩合形成硼酸酯. 该主客体自组装探针的关键优势在于客体分子在CB[10]空腔内的预组织效应显著缩短了两个识别位点的空间距离. 而且, 大环的空腔尺寸效应使反应选择性进一步得到提升, 使得干扰物肾上腺素和多巴胺几乎不对探针的荧光信号造成影响, 同时将响应时间压缩至百毫秒级. 利用该探针, 研究团队成功监测了恐惧应激条件下小鼠4个脑区的去甲肾上腺素动态变化(图7b), 揭示这些与情绪处理相关脑区的递质浓度均呈现不同程度升高. 此工作表明, 该类化学传感器有望成为解析不同生物模型中神经递质动力学的有力工具.
图7 (a)探针14的化学结构及优化的超分子传感器; (b)电刺激后用探针14孵育小鼠S1BF, CA1, LD和CPU区域的脑组织切片的荧光图像[88]

Figure 7 (a) Chemical structure of probe 14 and optimized supramolecular probe; (b) fluorescence images of brain tissue slices from S1BF, CA1, LD, and CPU regions incubated with probe 14 after electrical stimulation[88], Copyright 2025, American Chemical Society

2.1.3 肾上腺素(EP)

肾上腺素(EP)作为中枢神经系统中重要的儿茶酚胺类神经递质, 其浓度变化与阿尔茨海默病、帕金森病等神经疾病的进展密切相关[89]. 因此, 实现肾上腺素的精准可视化对解析其在大脑中的生理/病理机制至关重要. 目前, 具有高特异性、高灵敏度、高时空分辨率的肾上腺素检测探针仍然非常稀少.
Huang等[90]合成了一种新的阴离子七甲川花菁探针15, 探针的氯苯基碳酸酯可以选择性地与肾上腺素的仲胺发生亲核取代反应, 并进一步通过分子内环化反应以释放荧光团15-OH(图8a). 该级联反应机制探针可以将肾上腺素的仲胺与多巴胺和去甲肾上腺素的伯胺之间形成反应性差异, 使得探针15对肾上腺素表现出良好的特异性. 探针15已成功地实现了肾上腺素在活细胞中的生物成像和肾上腺素类似物(羟酪胺)在线虫体内的生物成像, 证实了其生物应用潜力.
图8 (a)探针15的化学结构及其对肾上腺素的检测机制示意图; (b)探针16的化学结构及其对肾上腺素的检测机制示意图[91]; (c) 26个不同脑区荧光信号的量化图[91]

Figure 8 (a) Chemical structure of probe 15 and schematic diagram of the detection mechanism toward EP; (b) chemical structure of probe 16 and its detection mechanism for EP[91]; (c) quantized maps of fluorescence signals in 26 different brain regions[91], reproduced under a CC BY license

田阳团队[91]基于主客体作用构建一系列超分子探针用于检测肾上腺素(图8b). 其客体分子中的硼酸基团(缩合邻苯二酚)与氟苯酯基团(仲胺酰胺化)实现了对肾上腺素的双位点检测. 同时, 通过调节桥联烷基链的链长, 可以精确调节双识别位点间距, 提高识别选择性和反应动力学. 优化结果显示, 含C4烷基链的客体分子16与主体CB[10]组装后, 与结构相似的单胺类神经递质相比, 探针对肾上腺素的选择性显著提升, 响应时间短至240 ms. 该探针实现了在小鼠的26个脑区进行实时监测和定量分析, 以获取肾上腺素在大脑中的详细分布和变化信息(图8c). 这一高选择性与高时间分辨的超分子荧光探针的成功应用再次证明了多位点识别以及共价/非共价协同作用策略的有效性和通用性, 为其他生物分子检测的探针设计提供了启发.

2.1.4 5-羟色胺(5-HT)

5-羟色胺(血清素)作为中枢及外周组织的关键单胺类神经递质与调节分子, 通过其广泛生理功能成为连接心理-生理-病理过程的核心介质. 其重要性体现于情绪调节、胃肠运动、痛觉感知及凝血调控等多重生理/病理环节[92-93], 在医学研究与临床实践中具有不可替代性. 但是长期以来高性能血清素探针的缺乏, 严重制约了对5-羟色胺相关疾病机制的认识与药物研发.
Glass团队[94]报道了5-羟色胺近红外荧光探针17(图9a). 该探针以富电子1,2,3,4-四氢喹喔啉(THQ)衍生的3-醛基香豆素为骨架, 其醛基与5-HT氨基形成亚胺键, 增强推拉电子效应并触发分子内电荷转移(ICT),产生了明显的荧光信号增强与光谱红移. 与儿茶酚胺相比, 探针17对5-羟色胺的亲和力更高, 作为一种非侵入性的成像工具, 可以选择性标记和直接可视化5-羟色胺.
图9 (a)探针17的化学结构示意图及其对5-HT的检测机制示意图; (b)探针18对5-HT的检测机制示意图

Figure 9 (a) Schematic diagram of the chemical structure of probe 17 and its detection mechanism for 5-HT; (b) Schematic diagram of the detection mechanism of probe 18 for 5-HT

为了进一步提高选择性, 林伟英团队[95]通过巯基-烯点击反应和氨基-羰基分子内亲核级联反应, 开发了探针18. 探针结构中, 3-巯基丙酸酯可以破坏二氰基亚甲基-4H-色烯近红外荧光团的分子内电荷转移(ICT)机制, 使其荧光淬灭. 当加入5-羟色胺后, 其五元环部分的碳碳双键可以与3-巯基丙酸酯发生巯基-烯点击反应, 接着羰基与氨基分子内亲核环化, 从而恢复近红外荧光发射(图9b). 该研究已用于成像抑郁细胞和脑组织中的5-羟色胺水平变化. 通过比较正常细胞和抑郁细胞的荧光成像结果, 发现释放5-羟色胺的能力降低可能是抑郁行为的根本原因. 影像学研究进一步表明, 抑郁症细胞中5-羟色胺释放能力降低的主要原因可能是由于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)活性降低. 这些研究结果将有助于全面理解抑郁症的机制, 为抗抑郁药治疗提供有价值的信息.

2.1.5 组胺(HA)

组胺是一种广泛分布于人体组织中的生物胺, 作为关键的信号分子参与免疫反应、神经调控、消化分泌及血管功能等生理病理过程, 在循环和免疫系统中具有重要作用[96-97].
Chang等[98]开发了一种以酰基氟为响应位点的介离子化合物荧光探针19, 用于活细胞中组胺的成像(图10a). 介离子核心富电子区向缺电子酰基氟的分子内电子转移(PET)导致探针初始荧光的淬灭. 因此当组胺氨基与酰基氟缩合形成酰胺键后, 可以阻断PET效应, 从而触发荧光开启. 由于组胺中的咪唑基团可以通过质子转移催化酰胺化反应, 所以探针19对组胺显示出较好的选择性. 该探针可应用于活RBL-2 H3嗜碱性粒细胞中组胺的成像, 以及监测活RAW 264.7巨噬细胞中组胺的摄取和合成, 为组胺生理病理功能研究提供新工具. Bhattacharya等[99]合成了一种基于荧光素衍生物的双模式荧光素探针20(图10b).在pH=7.0的水溶液中, 探针20的醛基与氨基反应形成亚胺, 咪唑基团作为质子转移催化剂加速了反应的进行. 反应溶液迅速由亮黄色变为无色, 同时绿色荧光淬灭, 从而实现了对组胺的比色和荧光双模式检测. 该小组使用探针20成功实现了小鼠巨噬细胞系RAW264.7中组胺的荧光成像, 同时还开发了便携式试纸条, 用于快速、现场检测组胺.
图10 探针19 (a)和20 (b)的化学结构及其对组胺的检测机制示意图

Figure 10 Chemical structures of probes 19 (a) and 20 (b), and schematic diagram of the detection mechanism toward HA

2.2 胆碱类

乙酰胆碱(ACh)作为神经系统关键神经递质, 由胆碱乙酰转移酶催化胆碱与乙酰辅酶A合成[100]. 该酶定位于胞浆, 故乙酰胆碱在胞浆合成后由突触小泡摄取储存. 乙酰胆碱不仅参与注意、唤醒及联想学习等认知功能, 还通过与其他神经递质互作共同调控动机与强化学习等复杂行为[101]. 因此, 实时高精度监测乙酰胆碱动态对解析脑功能机制至关重要.
乙酰胆碱结构中包含正电荷, 非常适合与富含电子的大环空腔相互作用[102]. Gosse课题组[103]合成了一种新的乙酰胆碱的点亮(turn-on)型荧光探针. 由环三藜芦烯(CTV)单元和C3对称部分三(2-氨基乙基)胺(TREN)组成了预组织空腔半隐烷1 (HC 1)(图11a). 研究结果表明乙酰胆碱的铵部分可以与富电子TREN单元特异性结合, 形成1∶1的复合物. Nau等[104]建立了一个由磺酸基杯[4]芳烃与荧光染料N,N'-二甲基-9,9'-二吖啶硝酸盐(光泽精, LCG)组合形成超分子复合物. 大环导致光泽精的荧光淬灭. 而添加对大环磺酸基杯[4]芳烃具有高亲和力并可以进入细胞的化合物, 如胆碱、乙酰胆碱或非瑟酮, 则可以重新开启光泽精的荧光, 从而可以通过指示剂置换分析(IDA)法对乙酰胆碱进行荧光检测. 其中由于胆碱/乙酰胆碱与4-磺酰杯[4]芳烃具有相似的高亲和力, 使得反应后荧光强度无法区分, 未能实现选择性检测.
图11 (a)半隐烷1 (HC 1)的化学结构; (b)探针21的化学结构

Figure 11 (a) Chemical structure of hemicryptophane 1 (HC 1); (b) chemical structure of probe 21

田阳团队[105]设计并制备了一种高通量超分子荧光探针21(图11b). 该探针通过柱[5]芳烃上缘萘酰亚胺衍生的硼酸基团和下缘香豆素衍生的醛基修饰得到. 所开发的探针由于具有富电子空腔, 可以通过静电相互作用吸引带电神经递质, 由此实现对乙酰胆碱的响应. 此外, 该探针还可以利用上端的硼酸基团与邻苯二酚发生酯化反应, 检测儿茶酚胺类神经递质(DA, NE, EP). 以及探针分子下端的醛基通过醛-胺缩合反应检测单胺类神经递质(HA, 5-HT, DA, NE, Glu). 通过主成分分析(PCA)对获得的信号进行统计处理, 实现了在双通道荧光响应下对神经递质进行高通量分析.

2.3 氨基酸类

氨基酸类神经递质作为中枢神经系统核心信号分子, 可分为兴奋性递质(如谷氨酸、天冬氨酸)与抑制性递质(如γ-氨基丁酸、甘氨酸)两类[106-107]. 其通过调控神经元兴奋性、突触可塑性及神经环路功能, 深度参与学习记忆、情绪调控与运动控制等生理过程. 鉴于其在生命活动中的关键作用, 该类递质已成为多种疾病的重要生物标志物[108].
谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)是化学结构非常相似的同系物. 其中谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统含量最高的兴奋性递质(约占脑内氨基酸总量20%), 神经元内浓度达1~10 mmol/L. 急性缺血性卒中患者血浆及脑脊液中Glu水平显著升高[109]. 天冬氨酸虽含量略低, 但在皮层、海马和小脑等广泛分布, 其脑脊液浓度为1.22±0.21 mmol/L[110]; 过量天冬氨酸可能诱发肌萎缩性脊髓侧索硬化症[111]. 二者功能异常与多种神经系统疾病密切相关[112], 故精准检测谷氨酸和天冬氨酸的含量对解析神经代谢网络及疾病诊疗具重要意义.
Adhikari等[113]构建了一种含有二乙氨基苯和吡啶修饰的BODIPY探针22(图12a). 谷氨酸和天冬氨酸中的双羧基可以与探针22N,N-二乙基氨基部分和吡啶单元的氮原子分别形成氢键. 这一双氢键结构可以抑制探针的光诱导电子转移过程, 从而快速增强荧光, 同时溶液颜色从粉红色变为无色. 因此, 通过荧光显微镜可以实现HeLa(图12a), A549, MDA-MB-468和HEK-293T活细胞中的谷氨酸和天冬氨酸成像, 且具有较低的细胞毒性.
图12 (a)探针22对谷氨酸和天冬氨酸的检测机制示意图及其在HeLa细胞中对天冬氨酸/谷氨酸的成像[113]; (b) 23的化学结构及其对谷氨酸和天冬氨酸的检测机制示意图

Figure 12 (a) Schematic diagram of the detection mechanism of probe 22 for glutamate and aspartic acid and its imaging of Asp/Glu in HeLa cells[113], Copyright 2012, American Chemical Society; (b) chemical structures of probe 23 and schematic diagram of the detection mechanism toward Glu and Asp

Dessingou等[114]设计了一种基于金属配合物的传感策略. 合成了一种含苯并咪唑结构的1,1′-硫代双(2-萘氧基)配体分子23. 如图12b所示, 配体分子23中的两个苯并咪唑部分的N原子与Ag进行2∶1配位, 产生近线性的几何形状, 荧光发射明显增强并发生30 nm红移. 当加入半胱氨酸、谷氨酸和天冬氨酸后, 氨基酸与银离子的竞争性配位作用使探针23从配合物中置换出来, 配体在390 nm处的荧光发生淬灭. 因此, 通过这种荧光引起的“开-关”响应, 可以实现对上述氨基酸的检测. 类似地, Prabhakaran等[115]使用3-甲氧基水杨醛缩氨基硫脲为荧光探针配位各种阳离子(如氯化物盐), 其中探针与Cu2+复合物可以作为检测天冬氨酸的“开启”荧光探针.
分子逻辑门由特定功能分子构成, 可通过化学结构响应输入信号(如化学物质、光、电), 并依据预设逻辑规则输出可检测信号. 基于输入数量可构建多种逻辑功能(如AND, OR, NOT), 其核心优势在于: 单分子平台可同步响应多种分析物(输入)并输出整合信号, 有效规避多探针联用引发的信号干扰、时空分辨率失配等问题, 实现多分析物高效协同检测.
基于分子逻辑门在分析物检测中的优势, Glass团队[116]设计了一种基于“AND”逻辑门的荧光探针24用于谷氨酸和pH双分析物检测(图13a). 该探针首先进入囊泡中与谷氨酸的氨基发生席夫碱反应, 由于处于酸性环境(pH≈5), 而保持探针分子的荧光处于“关闭”状态. 胞吐作用将该反应物释放至突触间隙(pH≈7.4), 随着环境pH的变化, 处于结合状态的反应物中磺酰胺部分去质子化, 增强了荧光团之间的电荷转移, 荧光信号增强与波长红移. 因此, 当两个信号(谷氨酸和pH值增加)同时存在时, 才能输出增强的荧光信号. 通过这一“AND”逻辑门的实施, 可以实现突触间隙谷氨酸的动态可视化.
图13 (a~c)探针24~26的化学结构及其对谷氨酸、天冬氨酸及pH的检测机制示意图

Figure 13 (a~c) Chemical structures of probes 24~26 and schematic diagram of the detection mechanism toward Glu, Asp and pH

由于谷氨酸能神经元中含有高浓度的谷氨酸和锌离子, 它们共同释放到突触间隙中, 其中关于锌离子在胞吐后的去向具有重要研究价值. 基于此, Glass团队[117]进一步设计并合成了探针25, 该探针使用香豆素骨架构建了一个谷氨酸、Zn2+和pH三输入的“AND”分子逻辑门. 如图13b所示, 香豆素3位的醛基先与谷氨酸可逆地形成亚胺, 锌离子则进一步与内酯羰基氧和亚胺形成多位点配位. 随着胞吐的发生, pH环境发生变化, 具有pH敏感性的羟基作为荧光信号打开的最终开关. 在模拟囊泡胞吐的条件下, 探针荧光增强了11倍. 然而, 上述三输入响应方式增加了检测过程对pH的依赖. 为了解除这一限制, 该团队[118]移除了探针分子中pH敏感的羟基, 将香豆素转换为苯并咪唑荧光团, 从而开发出了新型的双输入“AND”逻辑门探针26, 该探针仅当谷氨酸与Zn²⁺共存时才可触发荧光增强(AND逻辑)(图13c). 上述逻辑门探针为高浓度谷氨酸/Zn2+共存的神经元传递研究提供特异性工具.

3 总结与展望

综述了近年来用于检测单胺类、氨基酸类和胆碱类神经递质的有机荧光探针的设计策略、识别原理、信号转导机制以及生物应用进展. 现有研究表明, 有机荧光探针已在神经递质的特异性、高灵敏检测以及荧光成像方面取得了显著成果, 为神经科学研究提供了强大的工具.
尽管有机荧光探针在神经递质检测领域展现出巨大潜力, 但要深入解析神经环路机制并最终实现临床转化, 仍需克服检测性能极限突破与成像能力纵深拓展等关键挑战. 未来研究应聚焦以下核心方向:
(1)识别性能多维突破. 首先, 亟需发展基于新型反应动力学的亚秒/毫秒级探针, 以匹配神经递质瞬时释放特征, 突破现有分钟级响应的局限. 其次, 需突破单向共价识别反应的局限, 利用非共价相互作用或动态共价化学构建可逆响应系统, 实现递质浓度波动的原位、实时监测. 再次, 应发展具有正交反应通道的探针体系, 结合窄发射荧光团、发光寿命解析策略[119]及多通道成像技术, 实现多种递质的高通量同步追踪.
(2)光稳定性显著增强. 为满足神经元亚细胞结构超高分辨成像(如STED)对染料抗光漂白性的严苛要求, 需设计具备高光学稳定性的探针, 以支撑长时程(>24 h)、纳米级精度的稳定成像.
(3)细胞器靶向性能提升. 针对现有基于非共价识别的靶向基团在细胞器环境变化时易脱靶的问题, 未来可引入光标记、邻近标记等共价锚定策略, 显著提升探针的靶向精度与长时靶向稳定性.
(4)活体分析效能优化. 首先, 在脑部高效富集方面, 需通过理性设计探针的脂水分配系数与分子量, 或引入外源性载体, 突破血脑屏障限制, 提升脑内富集浓度与信号强度. 其次, 在成像深度方面, 为克服生物组织对光子的散射及吸收造成的穿透深度浅的问题, 需开发近红外二区及短波红外发射以及上转换探针[120-122], 并探索超声/X射线激发型探针, 以适配深部脑区成像需求.
综上所述, 开发性能更优异的有机荧光探针, 解决当前面临的技术瓶颈, 将有助于更深入地解析复杂的神经环路机制, 并为精准医疗的实现提供强有力的支持.
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