1 引言
光动力治疗(PDT)是一种基于光化学反应的局部微创技术, 近年来在肿瘤及微生物感染等疾病的临床治疗中展现出独特的价值与应用前景[1-4]. 光敏剂作为PDT的核心组分, 能够选择性富集于病灶区域, 在特定波长光照激发下实现对目标组织的精准杀伤, 并且最大限度地保护正常组织[5-10]. 光敏剂的筛选与优化是提升PDT疗效的关键, 而天然产物因其来源广泛、生物相容性良好、光敏活性高及暗毒性低等优势, 成为开发新型光敏剂的重要来源[11-14]. 其中, 作为二代光敏剂的苝醌类天然光敏剂因具有较高的活性氧(ROS)产率和良好的生物相容性, 引起了人们的广泛关注[15-17]. 然而, 其进一步应用仍面临两大挑战: 一方面, 其芳环共轭结构导致水溶性差, 易引起分子聚集与荧光淬灭, 降低ROS产 率[18]; 另一方面, 其吸收波长短, 在光疗窗口(600~900 nm)内吸收弱, 导致组织穿透深度有限, 难以治疗深部病灶[19-20]. 因此, 提升该类光敏剂的水溶性并延长其吸收波长至光疗窗口, 成为其研究重点.
近年来, 超分子化学的发展为药物递送系统带来了重要突破[21]. 大环化合物作为该领域的核心构建单元, 凭借其独特的空腔结构和多样化的主客体相互作用, 成为设计新型药物载体的理想平台, 在提升药物溶解度和稳定性方面展现出显著潜力[22-25]. 然而常见的大环宿主分子(如环糊精、杯芳烃、葫芦脲和柱芳烃)受限于较小的空腔尺寸, 难以与较大的共轭分子直接形成主客体结构[26-28]. 具有π-共轭体系的纳米环由于其可调控的共轭空腔和奇特的光物理性质, 在主客体络合、生物传感、催化等领域得到了广泛的应用[29-33]. 我们前期基于具有不同空腔大小和结构柔韧性的两种阳离子共轭大环 AnBox4＋和ExAnBox4＋成功构建了基于苝醌类天然产物的超分子光敏剂, 实验证明其具备优异的光动力抗肿瘤与抗菌效果[34-35]. 然而, 此类天然产物光敏剂的吸收波长偏短, 处于组织穿透能力的“弱势区间”, 限制了其在深部实体肿瘤治疗中的应用.
基于以上挑战, 本研究选用竹红菌素衍生物HCEA作为客体分子, 其主峰在581 nm, 且在600~700 nm范围内有强吸收, 摩尔吸光系数高达15870 L•mol－1•cm－1. HCEA作为I型光敏剂[36], 能够高效产生超氧阴离子($\text{O}_{2}^{\bullet - }$)和羟基自由基(•OH), 减少对氧气的依赖[37-40], 适用于乏氧肿瘤的PDT. 将其与阳离子共轭大环AnBox4＋和ExAnBox4＋共组装得到了两种超分子光敏剂HCEA⊂AnBox4＋和HCEA⊂ExAnBox4＋, 主客体络合计量比为1∶1, 结合常数达到106~108数量级. 络合后的两种超分子光敏剂不仅保留了HCEA的近红外特征吸收和I型光敏剂的性质, 水溶性也大幅增加. 肿瘤细胞光毒性实验结果表明, HCEA⊂AnBox4＋和HCEA⊂ ExAnBox4＋在乏氧条件下均具有优异的光动力杀伤效果. 本研究通过主客体组装策略既解决了天然竹红菌素吸收波长短的问题, 也通过简便的方法得到水溶性高、稳定性好以及结合力强的I型近红外超分子光敏剂, 有望用于活体乏氧肿瘤的光动力治疗.
2 结果与讨论
2.1 超分子光敏剂的制备与结构表征
共轭大环AnBox4＋或ExAnBox4＋采用已经报道的蒽光二聚/解聚策略制备[34], 2位取代的竹红菌素衍生物HCEA由竹红菌丙素(HC)和乙醇胺直接反应获得(见支持信息, 图S1)[36]. 将HCEA固体分别溶于含有两种共轭大环的水溶液中(物质的量比为1∶1), 在室温下超声30 min后, 溶液颜色由橙黄色变为灰绿色, 即可得到两种超分子光敏剂HCEA⊂AnBox4＋和HCEA⊂ExAnBox4＋. 如图1所示, 在有机溶剂中, 所制备超分子光敏剂的质子核磁共振信号表现出显著的化学位移变化. HCEA⊂AnBox4＋中共轭大环的核磁共振峰明显变宽, 表明在时间尺度上存在主客体快速交换的动态平衡过程. 此外, 两个共轭大环中心质子的共振(AnBox4＋的1~5位和ExAnBox4＋的1'~5'位)均向高场方向显著位移, 可能是由于客体分子HCEA与蒽环之间的屏蔽效应造成, 而共轭大环角落的质子(AnBox4＋的6、7和a位; ExAnBox4＋的6'~8'、a'和b'位)受到客体分子的影响较小. HCEA芳香环质子峰和2位取代氨基质子峰也出现明显的位移. 随后通过二维核磁进一步证明了主客体之间的相互作用. 在HCEA⊂AnBox4＋的COSY谱图(见支持信息, 图S5)中观察到AnBox4＋的a位质子和HCEA的芳香环质子氢之间有明显的相关性; 在HCEA⊂ExAnBox4＋的NOESY谱图中(见支持信息, 图S6), 可以清晰地观察到ExAnBox4＋的a, b位与HCEA的芳香质子之间亦存在明显的相互作用. 这一结果验证了HCEA分子已进入共轭大环的疏水空腔内部, 形成了主客体络合物.
2.2 HCEA及超分子光敏剂的光谱性质测试
首先, 测试了HCEA在乙腈和水溶液(ϕDMSO=20%)中的吸收和荧光光谱. 如图2a所示, 在有机溶剂里HCEA的最大吸收峰在581 nm, 并且在600~700 nm之间有较强的吸收, 最大发射波长为750 nm. 与有机溶剂相比, 水溶液中HCEA的荧光显著猝灭. 如图2b~2c所示, 两种共轭大环AnBox4＋和ExAnBox4＋在纯水中的最大吸收为455 nm, 加入HCEA后红移至465 nm, 并且在600~700 nm出现了HCEA的特征吸收, 溶液颜色由橙黄色变成灰绿色, 表明主客体之间的非共价相互作用显著提高了HCEA的水溶性. 相比之下, 如图S7 (见支持信息)所示, 即使经过更长时间的超声处理, HCEA固体在纯水中也几乎不溶并且仍表现出极低的紫外可见吸收. 随后采用Job’s Plot方法, 利用紫外吸收可见光谱测试了主客体的络合计量比为1∶1(见支持信息, 图 S8). 荧光光谱测试结果表明, 在纯水中, 加入HCEA后两种共轭大环的荧光几乎被完全猝灭(见支持信息, 图S9), 因此可采用荧光滴定法来测试主客体的结合常数. 如图S10~S11 (见支持信息)和表S1 (见支持信息)所示, AnBox4＋和ExAnBox4＋与HCEA的结合常数分别为(5.87±0.47)×108 L/mol和(5.05±0.82)×106 L/mol, 表明HCEA与结构更为柔性的阳离子共轭大环ExAnBox4＋具有更强的结合力. 两种共轭大环和竹红菌素的结合能力差异可能是由于二者的空腔尺寸、结构刚性和电子云分布不同导致的, 该差异也可能对超分子光敏剂的性能造成不同影响[34].
图2 (a) HCEA (10 μmol/L)在乙腈和水溶液(ϕDMSO=20%)中的吸收和荧光光谱, 25 ℃; (b)纯水中等物质的量AnBox4＋和HCEA⊂AnBox4＋ (10 μmol/L)的归一化紫外-可见吸收光谱, 25 ℃; (c)纯水中等物质的量ExAnBox4＋和HCEA⊂ExAnBox4＋ (10 μmol/L)的归一化紫外-可见吸收光谱, 25 ℃Figure 2 (a) UV-vis absorption and fluorescence spectra of HCEA (10 μmol/L) in CH3CN and H2O (ϕDMSO=20%) at 25 ℃; (b) Normalized UV-vis absorption spectra of equimolar AnBox4＋ and HCEA⊂AnBox4＋ (10 μmol/L) in H2O at 25 ℃; (c) Normalized UV-vis absorption spectra of equimolar ExAnBox4＋ and HCEA⊂ExAnBox4＋ (10 μmol/L) in H2O at 25 ℃ |
2.3 超分子光敏剂的ROS检测
选用活性氧探针2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)测试了两种超分子光敏剂在溶液中的总ROS产生情况. DCFH-DA能够被ROS氧化成DCF, 在488 nm激发光下呈现绿色荧光. 如图3a和S12 (见支持信息)所示, 在635 nm激光照射下, HCEA⊂AnBox4＋和HCEA⊂ExAnBox4＋溶液中均能观察到荧光强度显著增加, 表明超分子光敏剂具有优异的ROS生成能力.
图3 (a) 在HCEA⊂AnBox4＋, HCEA⊂ExAnBox4＋, AnBox4＋或ExAnBox4＋存在下, DCFH在525 nm处荧光强度的相对变化(635 nm, 20 mW/cm2); (b)~(d)在MB, HCEA⊂AnBox4＋或HCEA⊂ExAnBox4＋存在下, ABDA吸收光谱的变化(635 nm, 5 mW/cm2) (pH 7.4 PBS, 635 nm处吸光度为0.1, 25 ℃)Figure 3 (a) Relative changes in fluorescence intensity at 525 nm of DCFH within HCEA⊂AnBox4＋, HCEA⊂ExAnBox4＋, AnBox4＋ or ExAnBox4＋ (635 nm, 20 mW/cm2); (b)~(d) The changes of absorption spectra of ABDA within MB, HCEA⊂AnBox4＋ or HCEA⊂ExAnBox4＋ (635 nm, 5 mW/cm2) (pH 7.4 PBS, The absorbance at 635 nm is 0.1, 25 ℃) |
根据光敏剂与氧气的作用机理不同, ROS的产生途径可以分为两种类型(I型和II型), 包括三线态光敏剂通过电子转移形成Ⅰ型自由基($\text{O}_{2}^{\bullet - }$、•OH等)以及通过能量转移产生II型单线态氧(1O2), 因此选用不同的活性氧探针研究超分子光敏剂产生的ROS类型. 首先, 选用9,10-蒽二基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)作为1O2探针, 来检测HCEA和超分子光敏剂1O2的产生能力. 如图3b~3d和S13 (见支持信息)所示, 在635 nm激光照射下, 与共轭大环、HCEA和超分子光敏剂共孵育后的ABDA吸收光谱均未发生显著变化; 而参比光敏剂亚甲基蓝MB经激光照射后, 体系中的ABDA吸光光谱强度显著下降, 表明两种共轭大环、HCEA和超分子光敏剂均不产生1O2. 其次, 选用羟苯基荧光素(HPF)和二氢罗丹明123 (DHR123)分别作为•OH和$\text{O}_{2}^{\bullet - }$的特异性探针, 探究两种超分子光敏剂通过Ⅰ型途径产生ROS的情况. 在635 nm激光照射下, 本身不具有荧光信号的HPF在与超分子光敏剂产生的•OH作用后产生强烈的绿色荧光信号, 且表现为荧光强度逐渐增加[图4a和S14 (见支持信息)]. 同样地, 在激光照射下, DHR123与超分子光敏剂产生的$\text{O}_{2}^{\bullet - }$作用后荧光强度亦逐渐升高[图4b和S15 (见支持信息)]. 随后采用EPR方法进一步验证超分子光敏剂的ROS生成种类. 如图S16 (见支持信息)所示, 超分子光敏剂不产生1O2, 与上述结果一致. 以上实验结果表明两种超分子光敏剂在激光照射下均能有效产生•OH和$\text{O}_{2}^{\bullet - }$, 可作为Ⅰ型光敏剂减少对氧气的依赖.
图4 (a)在HCEA⊂AnBox4＋, HCEA⊂ExAnBox4＋, AnBox4＋或ExAnBox4＋存在下, HPF在526 nm处荧光强度的相对变化(635 nm, 50 mW/cm2); (b)在HCEA⊂AnBox4＋, HCEA⊂ExAnBox4＋, AnBox4＋或ExAnBox4＋存在下, DHR123在527 nm处荧光强度的变化(635 nm, 50 mW/cm2); (c) HCEA⊂AnBox4＋和HCEA⊂ExAnBox4＋在水中的稳定性测试(635 nm, 100 mW/cm2); (d)黑暗条件下HCEA⊂AnBox4＋和HCEA⊂ExAnBox4＋在pH7.4的PBS中稳定性测试Figure 4 (a) Relative changes in fluorescence intensity at 526 nm of HPF within HCEA⊂AnBox4＋, HCEA⊂ExAnBox4＋, AnBox4＋or ExAnBox4＋ (635 nm, 50 mW/cm2); (b) The changes of fluorescence intensity of DHR123 at 527 nm within HCEA⊂AnBox4＋, HCEA⊂ExAnBox4＋, AnBox4＋or ExAnBox4＋(635 nm, 50 mW/cm2); (c) The stability of HCEA⊂AnBox4＋ and HCEA⊂ExAnBox4＋ detected via absorbance spectra (635 nm, 100 mW/cm2); (d) The stability of HCEA⊂AnBox4＋ and HCEA⊂ExAnBox4＋ detected in pH 7.4 PBS stored in dark |
稳定性作为光敏剂性能的评价指标, 也尤为重要.为了考察HCEA⊂AnBox4＋和HCEA⊂ExAnBox4＋的光稳定性, 将其分散在水中, 用635 nm激光持续照射60 min. 如图4c和S17 (见支持信息), 在经过激光照射之后, 两种超分子光敏剂水溶液仍保持澄清且吸收光谱几乎没有明显变化, 吸光度保持在初始值的90%以上, 表明两种超分子光敏剂在水溶液中具有优异的光稳定性, 能够在PDT过程中持续高效地产生ROS. 随后对二者在生理环境下的稳定性进行了测试. 如图4d和S18 (见支持信息)所示, 在pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中, HCEA⊂AnBox4＋和HCEA⊂ExAnBox4＋连续7天的吸光度几乎没有太大变化, 表明两种超分子光敏剂在生理环境下具有优异的稳定性.
2.4 细胞定位及细胞内ROS检测
为了探究超分子光敏剂的细胞摄取情况, 利用激光共聚焦显微镜对HeLa细胞(人宫颈腺癌上皮细胞系)进行了不同时间的体外荧光成像实验. 如图S19~S20 (见支持信息)所示, 随着孵育时间的增加超分子光敏剂也能更好的进入细胞并且在Cy5通道能够明显看到孵育2 h时为最佳内化时间. 如图5a所示, 采用DNA荧光探针Hoechst与超分子光敏剂进行共染, 结果表明两种超分子光敏剂均进入细胞质, 而不进入细胞核.
图5 (a)超分子光敏剂HCEA⊂AnBox4＋或HCEA⊂ExAnBox4＋分别与Hoechst共染后的荧光成像; (b)采用DCFH-DA检测HCEA⊂AnBox4＋或HCEA⊂ExAnBox4＋在HeLa细胞内常氧和乏氧条件下产生的ROS荧光成像; (c)采用DHE检测HCEA⊂AnBox4＋或HCEA⊂ExAnBox4＋在HeLa细胞内常氧和乏氧条件下产生的$\text{O}_{2}^{\bullet - }$荧光成像; (d)采用HPF检测HCEA⊂AnBox4＋或HCEA⊂ExAnBox4＋在HeLa细胞内常氧和乏氧条件下产生的•OH荧光成像. 标尺: 25 μmFigure 5 (a) Fluorescence images of supramolecular photosensitizers HCEA⊂AnBox4＋ or HCEA⊂ExAnBox4＋ co-incubated with Hoechst; (b) Fluorescence images of ROS production detected by DCFH-DA in HeLa cells treated with HCEA⊂AnBox4＋ or HCEA⊂ExAnBox4＋ under normoxic or hypoxic conditions; (c) Fluorescence images of $\text{O}_{2}^{\bullet - }$ production detected by DHE in HeLa cells treated with HCEA⊂AnBox4＋ or HCEA⊂ExAnBox4＋ under normoxic or hypoxic conditions; (d) Fluorescence images of •OH production detected by HPF in HeLa cells treated with HCEA⊂AnBox4＋ or HCEA⊂ExAnBox4＋ under normoxic or hypoxic conditions. Scale bar: 25 μm |
接下来, 探究了超分子光敏剂在细胞内的ROS产生情况. 首先, 采用DCFH-DA来检测胞内的总ROS. 如图5b所示, 在DCFH-DA和两种超分子光敏剂HCEA⊂AnBox4＋和HCEA⊂ExAnBox4＋共孵育的细胞中, 激光照射之前仅能观察到极微弱的绿色荧光信号, 而在激光照射之后, HeLa细胞在常氧和乏氧条件下均显现出强烈的绿色荧光信号, 表明两种超分子光敏剂在常氧和乏氧条件下均能高效产生ROS. 其次, 采用荧光探针二氢乙啶(DHE)和HPF来检测细胞内的$\text{O}_{2}^{\bullet - }$和•OH. 如图5c~5d所示, 经过激光照射之后, 细胞内的荧光信号均显著增强, 而所有的对照组荧光强度几乎没有任何变化(见支持信息, 图S21). 然而两种超分子光敏剂在乏氧条件下的荧光均弱于常氧条件(见支持信息, 图S22), 表明氧气对自由基的产生也有一定影响.
2.5 体外光动力杀伤效果评价
为了考察超分子光敏剂对肿瘤细胞的杀伤效果, 采用噻唑蓝(MTT)法对HeLa细胞进行毒性研究. 如图6a~6b所示, 将HeLa细胞和超分子光敏剂共同孵育, 使用激光照射后, 两种超分子光敏剂呈现剂量依赖性杀伤效果, 细胞毒性随着超分子光敏剂浓度的增加而逐渐增强. 在乏氧条件下, 超分子光敏剂通过产生$\text{O}_{2}^{\bullet - }$和•OH损伤肿瘤细胞, 亦表现出良好的光动力疗效. 然而, 在没有光照的条件下, 细胞存活率高达90%以上(图6c), 表明超分子光敏剂具有良好的生物相容性. 为了进一步验证超分子光敏剂的PDT效果, 使用Calcein AM/PI细胞活性检测试剂盒对HeLa细胞进行测试. 如图6d所示, 含同样浓度的超分子光敏剂但不光照control组的细胞显示出强烈的绿色荧光, 进一步表明了超分子光敏剂生物相容性良好. 而在光照的实验组中, 随着超分子光敏剂浓度的增加, 肿瘤细胞几乎全部被杀死, 乏氧条件下亦有大部分细胞死亡, 与MTT实验结果一致. 为评估超分子光敏剂对不同肿瘤细胞的PDT效果, 选用4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞系)进行MTT测试. 如图S23 (见支持信息)所示, 超分子光敏剂对4T1细胞也具有良好的PDT疗效, IC50值如表S2 (见支持信息)所示. 此外, 如图S24 (见支持信息)所示, 客体HCEA在常氧和乏氧条件下均能对细胞产生光动力杀伤效果, 而两种共轭大环AnBox4＋和ExAnBox4＋几乎没有光毒性和暗毒性(见支持信息, 图S25). 因此, 超分子光敏剂的细胞毒性主要来源于客体分子HCEA. 以上实验结果表明, 超分子光敏剂具有良好的生物相容性和较高的光毒性, 有望应用于乏氧肿瘤的PDT.
图6 HeLa细胞与(a) HCEA⊂AnBox4＋和(b) HCEA⊂ExAnBox4＋在常氧和乏氧条件下孵育2 h并光照后的细胞活力检测(635 nm, 100 mW/cm2); (c) HeLa细胞与HCEA⊂AnBox4＋或HCEA⊂ExAnBox4＋孵育2 h后的暗毒性; (d) HeLa细胞孵育不同浓度的HCEA⊂AnBox4＋或HCEA⊂ExAnBox4＋并光照后的AM/PI荧光成像实验(635 nm, 100 mW/cm2). 标尺: 100 μmFigure 6 Relative viability of HeLa cells incubated 2 h with (a) HCEA⊂AnBox4＋and (b) HCEA⊂ExAnBox4＋ under both normoxic and hypoxic conditions after laser irradiation (635 nm, 100 mW/cm2); (c) Dark toxicity of HeLa cells incubated with HCEA⊂AnBox4＋ or HCEA⊂ExAnBox4＋; (d) Fluorescence images of the calcein AM and propidium iodide (PI) incubated with HCEA⊂AnBox4＋ or HCEA⊂ExAnBox4＋ after laser irradiation (635 nm, 100 mW/cm2). Scale bar: 100 μm |
3 结论
在本研究中, 利用具有近红外吸收的竹红菌素衍生物HCEA与阳离子共轭大环组装得到了Ⅰ型超分子光敏剂HCEA⊂AnBox4＋和HCEA⊂ExAnBox4＋, 有效解决了竹红菌素在光疗窗口吸收波长短和水溶性差的问题. HCEA与阳离子共轭大环络合后水溶性大大增加, 主客体络合比为1∶1, 结合常数能达到106~108数量级, 在常氧和乏氧条件下均表现出优异的PDT效果, 有望应用于活体光动力抗肿瘤或者抗菌治疗中, 相关工作正在进一步研究中.
4 实验部分
4.1 超分子光敏剂的制备和表征
超分子光敏剂的制备: 取1.5 mg AnBox4＋ (1.48 μmol)或ExAnBox4＋ (1.26 μmol)于去离子水中(1 mmol/L), 充分溶解后, 取0.76 mg HCEA (1.48 μmol)固体加入AnBox4＋水溶液中或取0.65 mg HCEA (1.26 μmol)固体加入ExAnBox4＋水溶液中, 超声30 min后, HCEA完全溶解形成均一的水溶液, 并且溶液颜色由橙黄色变为灰绿色.
核磁表征: 取适量AnBox4＋或ExAnBox4＋溶于氘代乙腈中使其浓度为1 mmol/L, 取适量HCEA固体于氘代乙腈中使其浓度为1 mmol/L, 然后HCEA与共轭大环各取相同体积的氘代乙腈溶液于离心管, 充分混合并超声30 min. AnBox4＋: 1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ: 8.79 (d, J=6.3 Hz, 8H), 8.53 (s, 8H), 8.28 (d, J=6.4 Hz, 8H), 8.13 (d, J=8.9 Hz, 4H), 7.82 (d, J=9.1 Hz, 4H), 7.65 (s, 8H), 5.70 (s, 8H); HCEA⊂AnBox4＋: 1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ: 8.80 (d, J=6.5 Hz, 8H), 8.06 (s, 8H), 7.84 (s, 8H), 7.61 (s, 4H), 7.45 (s, 12H), 6.23 (s, 1H), 6.14 (s, 1H), 6.01 (s, 1H), 5.73 (s, 8H), 5.04 (s, 1H), 4.30 (s, 3H), 4.22 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.68~3.59 (m, 4H), 3.47 (s, 2H); HCEA: 1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ: 16.93 (s, 1H), 16.59 (s, 1H), 6.63 (s, 1H), 6.60 (s, 1H), 6.18 (s, 1H), 5.95 (s, 1H), 4.07 (s, 3H), 4.06 (s, 6H), 3.98 (d, J=12.7 Hz, 2H), 3.70 (d, J=4.2 Hz, 4H), 2.96 (s, 3H); HCEA⊂ExAnBox4＋: 1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ: 8.72 (d, J=6.4 Hz, 8H), 8.10 (d, J=6.4 Hz, 8H), 7.94 (s, 4H), 7.82 (s, 4H), 7.61 (d, J=8.8 Hz, 4H), 7.51 (d, J=8.0 Hz, 8H), 7.43 (d, J=8.1 Hz, 12H), 6.28 (s, 1H), 6.26 (s, 1H), 5.99 (s, 1H), 5.66 (s, 8H), 5.41 (s, 1H), 4.16~4.13 (m, 4H), 4.10 (s, 3H), 4.09~4.05 (m, 2H), 4.04~4.03 (m, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.65~3.54 (m, 8H); ExAnBox4＋: 1H NMR δ: 8.74 (d, J=6.5 Hz, 8H), 8.65 (s, 8H), 8.34 (d, J=6.7 Hz, 8H), 8.17 (d, J=8.9 Hz, 4H), 7.86 (d, J=10.8 Hz, 4H), 7.48~7.36 (m, 16H), 5.67 (s, 8H), 4.05 (s, 4H).
4.2 超分子光敏剂的光物理性质测试
荧光滴定实验: 制备浓度为1 mmol/L的AnBox4＋, ExAnBox4＋和HCEA水溶液(ϕDMSO=20%)待用. 取20 μL AnBox4＋或ExAnBox4＋母液于总体积为2 mL的水溶液(ϕDMSO=20%)置于比色皿中, 测定初始荧光强度, 随后每次加入4 μL的HCEA母液进行滴定, 在日立F-4600荧光光谱仪记录AnBox4＋或ExAnBox4＋荧光强度的变化. 激发波长: 370 nm; 滴定曲线的拟合和结合常数的计算通过BindFit程序完成, 在BindFit程序中选择1∶1的主客体结合计量比[41].
总ROS检测: 采用DCFH-DA作为检测总活性氧的荧光探针. 活化后的0.1 mmol/L DCFH-DA溶液备用. 分别取超分子光敏剂 HCEA⊂AnBox4＋和 HCEA⊂ExAnBox4＋溶液于2 mL pH 7.4 PBS中使其浓度为10 μmol/L, 取200 μL DCFH溶液于2 mL pH 7.4 PBS中, 所得溶液置于635 nm激光(20 mW/cm2)下照射. 利用日立F-4600荧光光谱仪记录DCFH在相同照射时间间隔后(每20 s)的荧光光谱变化.
1O2检测: 为了检测超分子光敏剂产生1O2的能力,使用ABDA作为捕获剂. 将60 µL浓度为1 mg/mL的ABDA溶液分别加入到在635 nm处吸光度为0.1, 总体积为1.5 mL的AnBox4＋, ExAnBox4＋, HCEA, HCEA⊂AnBox4＋, HCEA⊂ExAnBox4＋的PBS溶液中. 混合均匀后, 使用635 nm激光(5 mW/cm2)进行照射, 并记录ABDA吸收光谱强度的变化.
$\text{O}_{2}^{\bullet - }$检测: 选用DHR123作为捕获剂探究超分子产生$\text{O}_{2}^{\bullet - }$的能力. 将20 µL DHR123溶液[1 mmol/L的二甲基亚砜(DMSO)溶液]加入到2 mL浓度为5 µmol/L的AnBox4＋, ExAnBox4＋, HCEA⊂AnBox4＋和HCEA⊂ ExAnBox4＋水溶液中, 均匀混合后测试其初始荧光光谱. 然后在635 nm激光照射(50 mW/cm2)后再次测试其荧光光谱, 并记录相同时间间隔后(每隔1 min)荧光强度的变化.
•OH检测: 采用HPF作为检测•OH的特异性荧光探针. 将10 µL HPF溶液(1 mmol/L的DMSO溶液)加入到2 mL浓度为2.5 µmol/L的AnBox4＋, ExAnBox4＋, HCEA⊂AnBox4＋和HCEA⊂ExAnBox4＋水溶液中, 均匀混合后测试其初始荧光光谱, 所得溶液置于635 nm激光(50 mW/cm2)下照射. 利用日立F-4600荧光光谱仪记录HPF在相同照射时间间隔后(每隔1 min)的荧光光谱变化.
稳定性测试: 首先测试光稳定性, 将2 mL浓度为10 µmol/L的HCEA⊂AnBox4＋, HCEA⊂ExAnBox4＋水溶液置于635 nm激光器下连续照射60 min (激光功率密度为100 mW/cm2), 利用Hitachi U-3900分光光度计每隔15 min记录300~800 nm范围内的紫外可见吸收光谱, 同时监测并记录465 nm处吸光度强度的变化. 然后测试其在生理环境pH 7.4 PBS条件下连续7天的吸收光谱, 并检测465 nm处吸光度值的变化.
4.3 细胞培养及荧光成像
HeLa细胞(人宫颈腺癌上皮细胞系)和4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞系)均来自北京协和细胞库; HeLa细胞培养于Dulbecco’s Modified Eagle Medium培养液; 4T1细胞培养于RPMI 1640培养液. 培养基中添加了10%(体积比)热灭活的胎牛血清和抗生素(100 μg/mL的链霉素和100 IU/mL的青霉素), 在恒温培养箱中(37 ℃, 5% CO2)孵育24 h后使用.
细胞荧光成像: HeLa细胞接种于共聚焦皿中, 在温度为37 ℃, CO2含量为5%的培养箱中孵育24 h, 将浓度为2.5 μmol/L的超分子光敏剂HCEA⊂AnBox4＋或HCEA⊂ExAnBox4＋加入到共聚焦皿中, 孵育不同时间0.5 h, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 然后用pH 7.4 PBS洗涤3次后用CLSM进行荧光成像. 激发波长: 488 nm, 641 nm; 收集通道: 500~550 nm (TRITC); 663~738 nm (Cy5).
细胞内定位: HeLa细胞培养于DMEM培养基中, 并置于37 ℃, 5% CO2的恒温培养箱培育24 h. 然后加入10 μmol/L的HCEA⊂AnBox4＋或HCEA⊂ExAnBox4＋孵育2 h. 用pH7.4 PBS清洗3次, 加入Hoechst孵育15~20 min. 再次用pH 7.4 PBS清洗3次后, 利用CLSM收集荧光信号. 激发波长: 405 nm, 488 nm, 641 nm; 收集通道: 425~475 nm (Hoechst); 500~550 nm (FITC); 663~738 nm (Cy5.5).
(Cheng, F.)