1 引言
基于纳米材料的药物递送体系, 能够提升药物体内循环稳定性、改善药物生物利用度, 同时有效降低化疗药物的全身毒副作用, 已在临床研究与应用中展现出显著优势[1-3]. 尽管如此, 纳米药物递送体系在实际应用中仍面临诸多关键科学问题, 其中最具挑战性的问题之一在于难以准确获知药物在靶组织中的真实释放过程与有效浓度. 这一信息缺失不仅增加了临床给药方案优化的难度, 也制约了治疗窗口的精准判定[4-5]. 因此, 实现纳米药物在肿瘤微环境中的实时释放监测, 对于提升肿瘤精准治疗水平具有重要意义[6]. 目前, 药物释放动力学的研究多依赖于体外缓冲体系中的释放实验, 而肿瘤位置直接定量药物释放往往过程复杂且具有侵入性. 为此, 研究者通常通过放射性或荧光标记药物分子, 借助正电子发射断层成像(PET)或荧光成像技术对其在肿瘤部位的分布进行间接监测[7-8]. 然而, 该策略难以区分药物的“包载状态”与“释放状态”, 无法真实反映药物的释放动力学行为. 为克服这一局限, 将成像信号的激活与药物释放过程直接关联, 使药物释放能够即时转化为可检测的响应信号[9-10], 被认为是一种理想的策略.
近年来, 光热治疗(photothermal therapy, PTT)因其非侵入性和空间可控性, 在肿瘤治疗领域展现出广阔应用前景[11-13]. 然而, 单一光热治疗受限于光穿透深度有限、肿瘤内部热分布不均及耐热细胞残留等问题, 往往难以实现彻底肿瘤消融[14-16]. 将光热治疗与化疗相结合, 通过光热效应促进肿瘤血管通透性、增强药物渗透与细胞摄取, 可实现协同增效治疗, 从而显著提升整体治疗效果[17-18]. 因此, 开发能够同时兼具高效光热转换能力与药物递送功能的多功能纳米材料, 是实现光热-化疗联合治疗的关键[19]. 近年来, 有机半导体材料因其分子结构可设计性强、光学与能级性质可调、生物相容性良好等优点, 逐渐成为光热诊疗材料的重要研究方向[20-22]. 通过合理的分子结构设计与聚合策略, 有机半导体纳米材料可在近红外区域表现出强吸收与高光热转换效率, 同时兼具优异的胶体稳定性与药物负载能力[23-24].
基于上述分析, 本文合成了一种具有优异光热性能的有机半导体聚合物PDPP3T, 通过半互穿网络交联策略制备了有机半导体纳米球PDPP3T NSs. 该策略能够在聚合物纳米结构中引入pH和谷胱甘肽(GSH)响应的功能单元, 从而赋予体系对肿瘤微环境的刺激响应能力. 同时, 结合半互穿网络结构的稳定性及其与药物之间的强相互作用, 实现药物的可控精准释放(图1). 结果表明PDPP3T NSs具有优异的胶体稳定性, 并可用于高效负载化疗药阿霉素(Doxorubicin, DOX)和荧光染料Cy5, 构建pH/GSH双响应PDPP3T@Cy5@DOX NSs诊疗剂. 体外实验结果表明, 在完整的PDPP3T@Cy5@DOX NSs中, Cy5的荧光信号初始状态下被有效猝灭, 在低pH/高GSH条件下, DOX和Cy5从PDPP3T@Cy5@DOX NSs中缓慢释放, Cy5荧光逐渐恢复, 且其增强程度与DOX从纳米体系中释放的量呈正相关关系. 此外, PDPP3T兼具光热治疗功能, 对于肿瘤细胞具有显著的杀伤效果, 可实现光热-化疗协同的肿瘤诊疗一体化应用.
2 结果与讨论
2.1 PDPP3T@Cy5@DOX NSs的制备与表征
首先采用纳米沉淀法制备了PDPP3T纳米颗粒(PDPP3T NPs)[25-27]. 基于前期研究, 我们发现, 采用半互穿聚合物网络策略修饰有机半导体纳米粒子, 可有效提高有机半导体纳米颗粒的结构稳定性, 同时提升载药量并延长药物释放时间. 在此基础上, 引入对环境敏感的功能单元(如pH和GSH响应基团), 可赋予聚合物良好的刺激响应特性, 从而进一步实现药物的可控释放[28]. 因此, 我们以BMOD 为交联剂, N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)和丙烯酸(AA)为共聚单体, 采用半互穿网络交联策略构建了具有pH/GSH双响应功能的有机半导体纳米诊疗剂(PDPP3T NSs). 在此基础上, 将近红外荧光染料Cy5作为药物释放示踪分子, 与化疗药物阿霉素(DOX)共负载于PDPP3T NSs中, 构建了有机半导体纳米诊疗剂PDPP3T@Cy5@DOX NSs. 动态光散射(DLS)测试结果显示, PDPP3T NSs纳米颗粒(PDPP3T NSs)的多分散性指数(PDI)均小于0.3, 表明其在水相体系中具有良好的分散性. 如图2A所示, PDPP3T NSs在水溶液中的平均流体动力学直径约为90 nm. 透射电子显微镜(TEM)图像(图2B)显示, PDPP3T NSs呈规则的球形结构, 平均粒径约为80 nm, 与DLS测试结果基本一致, 且颗粒分布均一、无明显团聚现象. Zeta电位测试结果表明, PDPP3T NSs的表面电位约为－20 mV(支持信息, 图S1), 说明其具有一定的胶体稳定性. 图2C为PDPP3T NPs和PDPP3T NSs的紫外-可见吸收光谱, 表明PDPP3T NSs在650~900 nm范围内表现出显著的吸收特征, 该吸收主要来源于PDPP3T分子共轭骨架的电子跃迁, 为其在光热治疗中的应用提供了重要基础. 进一步的稳定性评估结果表明(图2D), PDPP3T NSs在血清、杜氏改良Eagle培养基(DMEM)、Tris-HCl及PBS缓冲液等不同溶液中储存14天后均未出现明显沉淀, 其粒径分布保持稳定, 表明该纳米体系具有优异的胶体稳定性.
图2 (A) PDPP3T NSs的粒径分布图; (B) PDPP3T NSs的透射电子显微镜(TEM)图像; (C) PDPP3T NPs和PDPP3T NSs的紫外吸收光谱; (D) PDPP3T NSs在不同溶液中尺寸随时间变化情况Figure 2 (A) DLS data of PDPP3T NSs. (B) Transmission electron microscopy (TEM) image of PDPP3T NSs. (C) UV-Vis absorption spectra of PDPP3T NPs and PDPP3T NSs. (D) The hydrodynamic diameter of PDPP3T NSs as a function of storage time |
2.2 PDPP3T NSs的光热性能评估
我们研究了PDPP3T纳米球(PDPP3T NSs)的光热转换性能. 如图3所示, 在808 nm激光(功率密度为1 W/cm2)照射条件下, PDPP3T NSs的光热升温行为明显依赖于激光照射时间和材料浓度, 在相同材料浓度下, 随着照射时间的延长, 体系温度逐渐升高, 且在约5 min内温度达到平台值. 而在相同照射时间内, 随着材料浓度的增加, 体系所能达到的最终温度显著提高. 其中, 40 μg/mL的PDPP3T NSs溶液温度可升高至约 60 ℃, 该温度已足以有效诱导肿瘤细胞死亡, 表明其在肿瘤光热治疗中具有潜在应用价值. 我们进一步考察了激光功率对PDPP3T NSs光热性能的影响. 如图3C所示, 在不同激光功率密度(0.50, 0.75, 1.00和1.25 W/cm2)照射下, PDPP3T NSs的光热升温效果随激光功率的增加而显著增强, 表现为在相同照射时间内更快的升温速率和更高的终止温度. 根据文献报道[29-30]的方法, 进一步计算得到PDPP3T NSs的光热转换效率为52.7%. 此外, 为评估PDPP3T NSs的光热稳定性, 在808 nm激光、1 W/cm2功率密度条件下, 对材料进行5次“激光开-关”循环测试. 如图3D所示, 在连续循环过程中, PDPP3T NSs在每一轮照射中均可稳定升温至约57 ℃, 未观察到明显的光热性能衰减, 表明该纳米体系具有良好的光热稳定性和可重复使用性.
图3 (A) PDPP3T NSs的光热升温图像; (B)不同浓度和(C)不同激光功率照射下PDPP3T NSs的光热升温曲线; (D) PDPP3T NSs的光热循环稳定性. 数据以均值±标准差表示(n=3)Figure 3 (A) IR thermal images of PDPP3T NSs and water with 808 nm laser irradiation. Temperature elevation of PDPP3T NSs (B) at various concentrations under 808 nm irradiation at 1 W/cm2 and (C) with different laser power densities at 40 μg/mL. (D) Photothermal stability of PDPP3T NSs with 808 nm laser irradiation at 20 μg/mL. Data are presented as means±SD (n=3) |
2.3 pH/GSH双响应药物释放行为研究
由于PDPP3T@Cy5@DOX NSs表面引入了羧基及二硫键等多种刺激响应性官能团, 该纳米体系对肿瘤微环境中的pH变化和还原性条件具有显著响应特性. 首先, 为评估其pH响应性药物释放行为, 在不同pH条件(pH 7.4和pH 5.4)下研究了抗癌药物DOX的体外释放特性. 如图4A所示, 在不同pH条件刺激下, PDPP3T@Cy5@DOX NSs中DOX的释放量均随时间逐渐增加. 在接近生理条件的pH 7.4环境中, DOX的释放速率较慢, 8 h内累计释放量仅为12.2%, 表明该纳米体系在正常组织环境下具有良好的稳定性. 相比之下, 在模拟肿瘤微环境的弱酸性条件(pH 5.4)下, DOX的释放明显加快, 8 h内累计释放量达到22.8%, 约为pH 7.4条件下的两倍, 说明酸性环境可有效促进药物释放. 此外, 鉴于PDPP3T@Cy5@DOX NSs结构中所采用的交联剂BMOD含有对还原环境高度敏感的二硫键, 其在高浓度谷胱甘肽(GSH)存在下可发生断裂, 从而进一步触发DOX的释放. 如图4B所示, 在10 mmol/L GSH(模拟肿瘤细胞内高GSH水平)条件下, PDPP3T@Cy5@DOX NSs在6 h内释放了约56.4%的DOX, 显著高于pH 7.4条件下的释放水平, 充分表明该体系对GSH具有高度敏感的刺激响应特性. 综上所述, PDPP3T@Cy5@DOX NSs同时具备pH和GSH的双重刺激响应能力, 能够在肿瘤微环境特征条件下实现加速和可控的药物释放. 这种环境响应性递药行为有助于提高肿瘤部位的药物累积并降低正常组织中的非特异性释放, 表明该纳米平台在肿瘤精准治疗中具有良好的应用潜力.
2.4 GSH响应下PDPP3T@Cy5@DOX NSs对DOX释放过程的监测
根据前期实验, 我们发现有机半导体材料PDPP3T是优异的荧光猝灭剂, 能够有效猝灭染料Cy5的荧光. 因此我们将Cy5和阿霉素(Doxorubicin, DOX)共同负载于PDPP3T NSs中, 构建PDPP3T@Cy5@DOX NSs体系, 在pH和GSH的刺激下, PDPP3T@Cy5@DOX NSs释放抗癌药物DOX的同时释放荧光染料Cy5, 因此利用Cy5响应性释放引起的荧光恢复可以实现对化疗药DOX释放过程的实时监测. 为评估PDPP3T@Cy5@DOX NSs在GSH激活药物释放过程中的实时监测与定量能力, 我们分析了其在GSH作用下光谱强度的变化. 如图5A所示, 在未加入GSH的情况下, PDPP3T@Cy5@DOX NSs分散液的发射光谱在675 nm处仅呈现微弱且稳定的荧光峰, 表明分布于PDPP3T纳米球中的Cy5分子荧光几乎被有机半导体PDPP3T纳米颗粒完全猝灭. 当加入GSH后, BMOD交联剂中二硫键在高浓度GSH作用下发生断裂, 从而导致网络结构解体, PDPP3T@Cy5@DOX NSs分散液的荧光强度随时间逐渐增强. 其中, 染料Cy5的荧光强度在6 h时, 为初始状态的5.8倍(图5B). 上述结果表明, Cy5荧光信号的恢复主要归因于其从PDPP3T@Cy5@DOX NSs纳米体系中的释放以及原有猝灭效应的解除. 在纳米结构完整时, Cy5与PDPP3T之间的相互作用导致荧光被有效猝灭, 随着体系在刺激条件下解离, Cy5和化疗药DOX逐渐释放, Cy5的荧光信号随之恢复. 因此, 该荧光变化可用于反映药物释放过程的动态趋势. 将PDPP3T@Cy5@DOXNSs与GSH共孵育, 在不同时间点收集释放的DOX并通过紫外-可见吸收光谱法进行定量分析(图5C). 结果显示, DOX的累积释放过程符合指数动力学模型, 其中约40%的DOX在加入GSH后的前1.5 h内迅速释放, 随后阶段又释放了约16%的DOX. 然而, 荧光信号变化是否能够作为DOX释放的定量指示仍需进一步验证. 为此, 我们将荧光染料Cy5的荧光强度增加倍数与抗癌药物DOX的释放量进行线性拟合, 结果表明Cy5的荧光强度增加倍数(x)与DOX的累积释放量(y)之间呈现近似线性关系(图5D). 该关系可通过线性方程拟合:
y=12.01x－12.05 (R2=0.99709)
表明PDPP3T@Cy5@DOX NSs具备实现药物释放过程实时追踪的能力.
图5 (A) GSH处理不同时间下PDPP3T@Cy5@DOX NSs的荧光发射光谱. (B) GSH处理后不同时间点PDPP3T@Cy5@DOX NSs在675 nm处的荧光发射峰强度变化. (C) GSH处理后不同时间点PDPP3T@Cy5@DOX NSs中DOX的累积释放曲线. (D)在GSH存在条件下, DOX释放百分比与Cy5荧光强度增加倍数之间的线性关系拟合Figure 5 (A) Fluorescence emission spectrum of PDPP3T@Cy5@DOX NSs in PBS after the addition of GSH. (B) Intensity of the 675 nm emission peak of PDPP3T@Cy5@DOX NSs in the presence of GSH at different times. (C) Time-dependent profile of cumulative release of DOX from PDPP3T@Cy5@DOX NSs in the presence of GSH measured by UV-vis spectrophotometer. (D) Linear curve fitting between the percentage of released DOX and the increased fluorescence intensity of Cy5 in the presence of GSH |
2.5 pH响应下PDPP3T@Cy5@DOX NSs对DOX释放过程的监测
为验证肿瘤酸性微环境下Cy5荧光恢复程度能够有效反映PDPP3T@Cy5@DOX NSs中药物DOX释放的比例, 将PDPP3T@Cy5@DOX NSs溶解在pH 5.4缓冲液中, 于不同孵育时间点收集溶液, 采用荧光分光光度计进行分析. 如图6所示, PDPP3T@Cy5@DOX NSs的荧光强度随孵育时间逐渐增强, 孵育时间为6 h时, 荧光强度为初始荧光强度的1.9倍, 此时抗癌药物DOX释放了22.8%. 对荧光染料Cy5的荧光强度增加倍数与从PDPP3T@Cy5@DOX NSs中释放的DOX比例进行作图, 结果表明两者之间呈现显著的线性相关关系(R2=0.9877). 上述结果充分证明, PDPP3T@Cy5@DOX NSs中DOX的释放过程可通过监测Cy5荧光强度实现实时和定量的表征.
图6 (A) PDPP3T@Cy5@DOX NSs在pH 5.4缓冲液中的荧光发射光谱. (B)不同时间点PDPP3T@Cy5@DOX NSs溶液在675 nm处的荧光发射峰强度变化(pH 5.4). (C) PDPP3T@Cy5@DOX NSs中DOX的累积释放曲线(pH 5.4). (D) DOX释放百分比与Cy5荧光强度增加倍数之间的线性关系拟合(pH 5.4)Figure 6 (A) Fluorescence emission spectrum of PDPP3T@Cy5@DOX NSs in PBS buffer (pH 5.4). (B) Intensity of the 675 nm emission peak of PDPP3T@Cy5@DOX NSs in PBS buffer (pH 5.4) at different times. (C) Time-dependent profile of cumulative release of DOX from PDPP3T@Cy5@DOX NSs in PBS buffer (pH 5.4). (D) Linear curve fitting between the percentage of released DOX and the increased fluorescence intensity of Cy5 in PBS buffer (pH 5.4) |
2.6 pH/GSH双响应下PDPP3T@Cy5@DOX NSs对DOX释放过程的监测
由于在复杂的肿瘤微环境中, 谷胱甘肽(GSH)水平升高与酸性pH条件通常同时存在[31-32]. 我们考察了PDPP3T@Cy5@DOX NSs在pH 5.4与10 mmol/L GSH双重条件同时存在下的DOX释放行为及其对DOX释放过程的监测. 如图7所示, 在pH 5.4酸性环境与10 mmol/L GSH还原环境的双重刺激下, 聚合物网络结构进一步发生松弛或不稳定, PDPP3T@Cy5@DOX NSs的DOX释放速率明显加快, 表现出协同增强的药物释放行为, DOX释放率达到70%左右. 同时体系中Cy5的荧光信号也呈现同步增强趋势, 其荧光强度变化与从PDPP3T@Cy5@DOX NSs中释放的DOX比例呈现较好的线性相关关系(R2=0.9954), 说明Cy5能够有效反映pH/GSH双刺激下载药体系的药物释放过程.
图7 (A) GSH处理后, PDPP3T@Cy5@DOX NSs PBS溶液(pH 5.4)的荧光发射光谱. (B) GSH处理后不同时间点PDPP3T@Cy5@DOX NSs在675 nm处的荧光发射峰强度变化(pH 5.4). (C) GSH处理后不同时间点PDPP3T@Cy5@DOX NSs中DOX的累积释放曲线(pH 5.4). (D)在GSH存在条件下, DOX释放百分比与Cy5荧光强度增加倍数之间的线性关系拟合Figure 7 (A) Fluorescence emission spectrum of PDPP3T@Cy5@DOX NSs in PBS after the addition of GSH (pH 5.4). (B) Intensity of the 675 nm emission peak of PDPP3T@Cy5@DOX NSs in the presence of GSH at different times (pH 5.4). (C) Time-dependent profile of cumulative release of DOX from PDPP3T@Cy5@DOX NSs in the presence of GSH measured by UV-vis spectrophotometer (pH 5.4). (D) Linear curve fitting between the percentage of released DOX and the increased fluorescence intensity of Cy5 in the presence of GSH |
2.7 PDPP3T@Cy5@DOX NS化学-光热联合治疗效果评估
为评估PDPP3T@Cy5@DOX NSs在细胞水平上的抗肿瘤效果, 选用小鼠乳腺癌细胞(4T1)作为模型细胞, 并通过噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率. 首先进行生物相容性评估, 如图8A所示, 在未接受激光照射条件下, PBS空白对照组以及含不同浓度PDPP3T NSs的处理组中, 4T1细胞存活率均保持在95%以上, 表明PDPP3T NSs体外细胞毒性极低, 具备优异生物相容性. 相比之下, 负载化疗药物DOX和荧光染料Cy5的PDPP3T@Cy5@DOX NSs处理组中, 4T1细胞存活率显著降低至约45%, 表明该纳米体系能够通过化疗作用有效抑制肿瘤细胞增殖. 进一步在近红外激光照射条件下评估其光热治疗效果. 结果显示, 在激光照射后, PDPP3T NSs和PDPP3T@Cy5@DOX NSs处理组均表现出显著增强的细胞杀伤效果, 4T1细胞存活率均降低至20%以下. 其中, PDPP3T@Cy5@DOX NSs在光热条件下表现出更为显著的抗肿瘤效果, 细胞杀伤率超过95%, 表明化疗与光热治疗之间存在明显的协同作用(图8B). 综上所述, PDPP3T NSs在无激光条件下表现出优异的生物相容性, 而PDPP3T@Cy5@DOX NSs在近红外激光激发下能够实现高效的光热-化疗协同治疗效果, 充分证明该纳米体系在肿瘤联合治疗中的应用潜力.
2.8 PDPP3T@Cy5@DOX NSs对细胞内DOX释放过程的监测
根据PDPP3T@Cy5@DOX NSs溶液实验获得的良好结果, 我们进一步在细胞内评估了PDPP3T@Cy5@DOX NSs作为pH/GSH双响应药物释放的实时监测与定量报告工具的可行性. 为实现对PDPP3T@Cy5@DOX NSs中药物刺激响应释放行为的可视化监测, 采用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)研究了PDPP3T@Cy5@DOX NSs在4T1细胞内的药物释放过程.
如图9A所示, 随着孵育时间的延长, 细胞内Cy5和DOX的荧光信号均呈现逐渐增强的趋势, 表明PDPP3T@Cy5@DOX NSs在细胞内发生了持续的药物释放过程. 通过对细胞内原位释放过程的荧光成像分析可以发现, 随着Cy5荧光信号的逐步恢复和增强, DOX的荧光信号也同步增加, 表明Cy5荧光强度的变化趋势与DOX荧光变化高度一致. 进一步对CLSM图像中不同时间点的Cy5和DOX荧光强度进行定量分析, 其结果如图9B所示. 随着响应释放时间的延长, Cy5与DOX的荧光强度均持续升高, 呈现出明显的时间依赖性, 且二者在时间维度上具有良好的同步性. 这一结果表明, Cy5荧光信号能够有效反映化疗药DOX在细胞内的释放行为. 上述结果与溶液中pH/GSH响应药物释放实验结果高度一致, 进一步验证了Cy5荧光信号作为“自报告”探针用于指示化疗药DOX释放过程的可靠性. 综上所述, PDPP3T@Cy5@DOX NSs能够在肿瘤细胞内响应酸性和高GSH微环境, 实现化疗药DOX的可控释放, 并通过Cy5荧光信号对该过程进行实时、可视化监测, 充分体现了该纳米体系在肿瘤精准治疗和自报告递药系统中的应用潜力.
图9 (A) 4T1细胞与PDPP3T@Cy5@DOX NSs孵育不同时间的共聚焦荧光图像; (B) 4T1细胞与PDPP3T@Cy5@DOX NSs孵育不同时间的荧光强度曲线图Figure 9 (A) Fluorescence images of 4T1 cells incubated with PDPP3T@Cy5@DOX NSs for different times at 37 ℃. (B) Quantitative data of the fluorescence signal in 4T1 cells incubated with PDPP3T@Cy5@DOX NSs |
3 结论
本文通过半互穿网络交联策略成功构建了一种具有pH/GSH双重刺激响应特性的有机半导体纳米诊疗剂PDPP3T@Cy5@DOX NSs, 所得纳米诊疗剂表现出良好的结构稳定性与生物相容性. 得益于表面引入的羧基和二硫键等功能性基团, 该纳米平台可高效负载抗癌药物阿霉素(DOX)及荧光染料Cy5. 在肿瘤微环境模拟条件下, PDPP3T@Cy5@DOX NSs能够响应酸性pH和高浓度GSH实现DOX的可控释放. 更为重要的是, Cy5荧光信号的恢复程度与DOX的释放行为高度一致, 使该体系具备“自报告”药物释放能力, 从而实现对原本不可直接可视化的化疗药物释放过程的实时监测. 细胞及体外实验结果进一步验证了该荧光信号在表征药物释放动力学过程中的可靠性. 综上所述, PDPP3T@Cy5@DOX NSs不仅实现了化疗药物在模拟肿瘤微环境响应下的精准递送与释放, 还同步提供了药物释放过程的动态监测手段. 需要指出的是, 在体内复杂生理环境中, 体系的应用仍面临一定挑战. 例如, 组织对光的吸收与散射可能限制荧光信号的穿透深度, 从而影响成像灵敏度; 同时, 生物背景信号及非特异性相互作用也可能对检测结果产生干扰. 因此, 未来我们将进一步开展体内层面的系统研究, 以评估其生物安全性与应用潜力.
4 实验部分
4.1 PDPP3T纳米粒子制备
称取10 mg聚噻吩-吡咯并吡咯二酮(PDPP3T)溶于10 mL四氢呋喃(THF)中, 配制成浓度为1 mg/mL的PDPP3T溶液, 在高强度超声作用下使其完全溶解, 用0.45 μm的有机相过滤器进行过滤. 将其配制成0.1 mg/mL的溶液, 在超声下迅速注入超纯水中, 制备得到PDPP3T纳米粒子, 旋转蒸发去除溶液中多余的四氢呋喃和水, 最后通过0.22 μm聚醚砜水相过滤器过滤后得到分散在水中的PDPP3T纳米颗粒.
4.2 PDPP3T NSs纳米球制备
在100 mL圆底烧瓶中加入NIPAM (6.0 mL, 100 mmol/L)、AA (0.67 mL, 100 mmol /L)、十二烷基硫酸钠(SDS)表面活性剂(100 μL, 100 mmol/L)、BMOD (1.2 mL, 50 mmol/L)溶液, 3 mL PDPP3T NPs, 氮气氛围下加热升温至72 ℃, 待温度稳定后加入过硫酸铵(APS)引发剂(1 mL, 10 mmol/L), 反应4 h后, 高速离心除去小分子, 得到产物PDPP3T NSs.
4.3 PDPP3T@Cy5@DOX NSs构建
将PDPP3T NSs与不同浓度的DOX和Cy5在震荡仪中摇匀震荡, 恒温37 ℃共孵育12 h. 高速离心(30 min, 14000 r/min)三次除去未负载上的DOX或Cy5, 得到最终产物PDPP3T@Cy5@DOX NSs.
4.4 PDPP3T@Cy5@DOX NSs光热性能测试.
分别制备浓度为0, 5, 10, 20, 40 μg/mL的PDPP3T NSs, 用1 W/cm2的功率在808 nm激光器照射下, 利用热成像仪记录样品在10 min内的升温过程, 得到不同浓度样品温度与照射时间曲线. 通过808 nm激光器照射20 μg/mL的PDPP3T NSs 10 min后关闭激光器, 等材料恢复到室温再使用激光器照射材料使温度升到最高. 重复循环5次. 利用热成像仪记录材料升温降温过程, 测试材料升温降温循环曲线.
4.5 pH/GSH药物可控释放研究
取制备好的PDPP3T@Cy5@DOX NSs溶液注入高温活化的透析袋内(其分子量为3.5 kDa), 并分别置于不同pH (7.4和5.4)的PBS缓冲溶液中, 转速200 r/min下进行药物释放. 在0.5, 1, 2, 3, 4, 6 h的固定时间分别取2 mL透析液测试DOX在480 nm处的紫外吸收和Cy5在675 nm处的荧光强度, 并用于监控Cy5的释放, 同时加入等体积的相应pH的PBS缓冲溶液.
取制备好的稳定的产物PDPP3T@Cy5@DOX NSs溶液注入高温活化的透析袋内(其分子量为3.5 kDa), 并分别置于GSH浓度为10 mmol/L的透析液内, 转速200 r/min下进行药物释放. 在0.5, 1, 2, 3, 4, 6 h的固定时间分别取2 mL透析液测试DOX在480 nm处的紫外吸收和Cy5在675 nm处的荧光强度, 用于监控Cy5的释放, 同时加入等体积的补充透析液.
4.6 细胞内PDPP3T@Cy5@DOX NSs对DOX释放过程的监测
复苏4T1细胞, 完全培养基37 ℃、5% CO2常规传代, 取对数期细胞, 0.25%胰酶消化后, 以1×105个/孔接种至35 mm共聚焦培养皿, 37 ℃、5% CO2孵育培养24 h至细胞贴壁. 弃旧培养基, 用PBS洗涤细胞. 配置含PDPP3T@Cy5@DOX NSs的无血清培养基, 每皿加 1 mL, 37 ℃、5% CO₂孵育, 分别在0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12 h这七个时间点, 采用激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)进行细胞荧光成像.
4.7 PDPP3T@Cy5@DOX NS化学-光热联合治疗效果评估
复苏4T1细胞, 接种于含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培养基, 37 ℃、5% CO2培养箱培养. 待细胞达对数生长期, 胰酶消化收集, PBS洗涤2次后调整浓度至5×104个/mL. 96孔板每孔加100 μL细胞悬液, 孵育24 h至细胞完全贴壁. 细胞贴壁后移除旧培养基, 按分组加入对应浓度PDPP3T@Cy5@DOX NSs和PBS, 每组6个复孔. 放回培养箱继续孵育24 h. 24 h后, 以808 nm近红外激光(功率密度1 W/cm2)每孔照射5 min. 激光处理后(无激光组直接进行), 每孔加20 μL 5 mg/mL MTT溶液, 37 ℃孵育4 h. 移除培养基, 每孔加150 μL二甲基亚砜(DMSO)振荡溶解结晶, 酶标仪490 nm处检测光密度(OD)值并记录.
(Lu, Y.)