1 引言
SO2是一种重要的气体信号分子, 通过吸入或溶解在水中后迅速水化形成硫酸盐和亚硫酸盐普遍存在于环境和生物体中[1-3]. 同时, SO2主要通过线粒体中含硫生物活性物质(如半胱氨酸和谷胱甘肽)的代谢产生, 参与体内的各种生理过程, 具有抗氧化特性, 有助于降低血压, 控制心血管疾病等[4-7]. 然而, 过量摄入二氧化硫衍生物会引起毒性反应造成严重的健康危害, 包括呼吸系统疾病和中枢神经系统损伤[8-11]. 在生理pH值条件下(pH=7.4), SO2及其衍生物在水溶液中存在解离平衡, 其中 HSO3⁻是主要存在形式, 常被作为生物体内SO2水平的代表性检测标志物. 因此, 建立一种能够灵敏、特异性检测生物体系中HSO3⁻的技术至关重要.
到目前为止, 检测HSO3−的常用方法包括离子色谱法、分光光度法和电化学方法[12-14]. 然而, 这些传统的检测方法具有局限性. 荧光探针具有样品损伤小、灵敏度高、实时原位分析等优点, 可以实现生物靶点的精确成像和定量检测[15-23]. 迄今为止, 已经开发出多种高效检测HSO3⁻的荧光探针, 如乙酰乙酸脱保护、醛加成、C=C双键的1,2加成反应、Michael加成等[24-27]. 虽然已经有一些荧光探针被报道用于检测HSO3−, 然而, 已报道的荧光探针在选择性、响应速度方面仍不理想, 且易受生物胺、硫化氢、生物硫醇等其他亲核分子的干扰, 严重制约了其在生物成像中的应用. 此外, 部分探针水溶性较差, 需借助高比例的有机溶剂方可进行检测, 这不仅降低了生物相容性, 也限制了其在活体成像中的实际应用潜力[28-32]. 因此, 开发一种在保证检测性能的同时、能够在生物成像条件下实现快速、特异性识别, 并兼具紫外与荧光双模式检测能力的探针, 对于在生物体内准确监测HSO3⁻具有重要意义.
本工作成功设计并合成了一种新型比色-荧光双模式探针QS-EC, 用于HSO3⁻的特异性检测(合成路线如图1所示). 该探针采用A-π-A型分子骨架, 在HSO3⁻诱导下发生1,4-亲核加成反应, 转化为D-π-A结构的加合物QS-EC-HSO3⁻, 恢复分子内电荷转移(ICT)效应, 同步开启比色与荧光响应. 其独特性在于: 通过HSO3⁻与喹啉盐单元的专一性反应, 实现了响应型ICT机制的动态转换, 兼具高选择性、高灵敏度、强抗干扰能力、宽pH适用范围、良好生物相容性及合成路线简便等优势. 在生物成像应用中, 该探针能够在活细胞及斑马鱼活体层面清晰追踪内源性与外源性HSO3⁻, 表现出明显的荧光开启效应与组织穿透能力, 为复杂生理环境中HSO3⁻的检测提供了可相互验证的双模式分析手段.
2 结果与讨论
2.1 探针QS-EC对HSO3-的检测性能
在合成的探针QS-EC中, 喹啉鎓盐部分赋予了目标结构优异的水溶性. 因此, 我们测定了具有A-π-A结构的QS-EC的紫外-可见吸收光谱. 如图2a所示, QS-EC溶液在400 nm处有一个明显的吸收峰, 向QS-EC的溶液中加入不同含量的HSO3⁻后, 400 nm处的紫外吸收峰逐渐下降, 同时560 nm处出现新的吸收峰, 并随着HSO3⁻含量的增加逐渐增强, 当加入的HSO3⁻浓度达到40 μmol/L时, 吸光度达到最大值且不再变化, 探针溶液的颜色由黄色变为紫色, 该现象可能是由于QS-EC-HSO3⁻增强了ICT效应所致. 此外, 在450 nm 处可观测到明显的等吸收点, 表明滴定过程中体系仅存在探针与加合物QS-EC-HSO3⁻两种吸光组分的相互转化, 反应过程无副产物生成. 荧光发射光谱的测定进一步揭示了QS-EC对HSO3⁻的传感能力(图2b). QS-EC在溶液中表现出较低的荧光强度. 当HSO3⁻含量增加到40 μmol/L时, QS-EC在660 nm处的荧光强度增强了45倍. 这种荧光信号的变化是由于HSO3⁻的亲核加成反应使分子结构从A-π-A转变为D-π-A所致. 同时, 在365 nm紫外灯照射下, 溶液发射出明亮的红色荧光, 实现了从无色到鲜红色的高对比度转变, 适用于复杂生物体系中HSO3⁻的检测. 另外, 当体系HSO3⁻浓度在0~40 μmol/L范围内时, 660 nm处的荧光强度与HSO3⁻浓度存在良好的线性关系, 相关系数R2=0.9988. 计算出该探针对HSO3⁻的检测限低至14.69 μmol/L (LOD=3σ/k)(图2c), 表明其对HSO3⁻的检测灵敏度很高. 上述结果表明, QS-EC能准确反映体系中HSO3⁻的变化, 具有较高的实用价值.
图2 (a)向QS-EC的溶液中加入不同浓度HSO3⁻ (0~40 μmol/L)时的紫外可见吸收光谱; (b)向QS-EC的溶液中加入不同浓度HSO3⁻ (0~40 μmol/L)时的荧光光谱; (c) 660 nm处荧光强度与HSO3⁻浓度的线性关系Figure 2 (a) UV-Vis absorption spectra of different concentrations of HSO3⁻ (0~40 μmol/L) added to the aqueous solution of QS-EC; (b) fluorescence spectra of different concentrations of HSO3⁻ (0~40 μmol/L) added to the aqueous solution of QS-EC; and (c) linearity of fluorescence intensity at 660 nm versus HSO₃⁻ concentration |
2.2 探针QS-EC的选择性研究
进一步评估了QS-EC的选择性和抗干扰性能. 在水体系中测试了各种干扰阴离子(F⁻、Cl⁻、Br⁻、I⁻、CO32⁻、N3⁻、HCO3⁻、CH3COO⁻、PPi、CN⁻、SCN⁻、PO42⁻、SO42⁻、N3、S2O32⁻、HS⁻)和生物硫醇(Cys、Hcy、GSH)对QS-EC的影响. 如图3a和3b所示, 与其他潜在的干扰离子相比, HSO3⁻和SO32⁻能够使紫外-可见吸收红移并产生显著的红色荧光发射(660 nm). 此外, 在含有干扰物的溶液中继续加入HSO3⁻后, 所有溶液的荧光强度都显著增加. 这些结果表明, QS-EC具有良好的选择性和优异抗干扰能力, 具有在复杂生物体系中检测HSO3⁻的应用潜力.
图3 (a) QS-EC与不同分析物响应的紫外吸收光谱; (b) QS-EC与不同分析物反应的荧光选择性实验和QS-EC在不同分析物存在下加入HSO3⁻的竞争性实验Figure 3 (a) UV-Vis absorption spectra of QS-EC reacting with different analytes; (b) fluorescence selectivity experiments of QS-EC reacting with different analytes and competition experiments of QS-EC adding HSO3⁻ in the presence of different analytes |
2.3 不同pH环境下探针QS-EC对HSO3⁻的检测能力研究
pH检测范围是评价荧光探针在分析物检测过程中性能的关键参数. 如图4a所示, 探针QS-EC在pH值1~13的宽范围内均呈现荧光“关闭”状态. 表明其自身的荧光团结构在不同pH条件下保持稳定. 添加HSO3⁻后, QS-EC在pH值6~13范围内有明显的近红外荧光发射. 实验结果表明, 生理pH条件(即血液及组织液pH 7.35~7.45、细胞质pH 6.8~7.4)下, QS-EC能够检测HSO3⁻, 且有效抵抗体内轻微pH波动干扰, 为其在活细胞和活体水平上的HSO3⁻成像应用提供了重要保障.
2.4 QS-EC的反应动力学和稳定性研究
2.5 反应机制研究
探针QS-EC与HSO3⁻相互作用前后荧光信号的高对比度促使我们研究其识别机制. 具有A-π-A结构的QS-EC因其强吸电子特性抑制了ICT过程导致探针本身的光学性质受限, 具体表现为紫外吸收波长短且荧光发射猝灭. 而喹啉盐结构中带正电的氮原子使其4'位更容易受到亲核试剂的攻击. 亲核试剂HSO3⁻能够与QS-EC的喹啉鎓盐进行特异性1,4-亲核加成反应(图5). QS-EC的A-π-A结构转化为QS-EC-HSO3⁻的D-π-A结构, 并恢复ICT效应, 诱导高亮度荧光发射. 该加成反应通过高分辨率质谱(High-Resolution Mass Spectrometry, HRMS)验证(见支持信息图S4). 在m/z=439.0319处观察到的明显峰对应于加成产物QS-EC-HSO3⁻ (C19H16N2O5S2 [M＋Na+]+=439.0393). 该结果证明了HSO3⁻与QS-EC的喹啉盐4位发生亲核加成反应, 改变了共轭体系, 导致QS-EC与HSO3⁻结合后光谱性质发生显著变化, 进而实现在体外特异性检测HSO3⁻.
2.6 细胞成像实验
细胞内HSO3⁻的含量是活细胞生理状态的重要间接指标. 我们通过共聚焦荧光成像技术评估QS-EC在细胞环境中对该参数的检测能力. 首先验证了探针QS-EC的生物相容性, 我们利用MTT (3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)法检测了其细胞毒性. 如图6a所示, 人乳腺癌细胞系MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7)与0~20 μmol/L的QS-EC孵育24 h后, 细胞活力均稳定维持在80%以上, 这表明该探针即使在较高浓度下也具备低细胞毒性和良好的生物相容性. 随后, 我们评估了QS-EC对外源性HSO3⁻的成像能力. 如图6b所示, 将探针QS-EC (5 μmol/L)在MCF-7中孵育30 min后, 红色荧光通道没有明显的荧光发射. 将不同浓度的HSO3⁻ (5 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L)与探针处理过的细胞共培养, 观察到红色通道荧光呈浓度依赖性增强. 表明该探针具有优异的细胞膜渗透性并可成功用于外源性HSO3⁻的检测. 此外, 进一步评估了QS-EC对细胞中内源性HSO3⁻的成像能力. 将MCF-7细胞与探针QS-EC共孵育, 随后用N-苄基-2,4-二硝基苯磺酰胺(NDB, 一种已知的SO2供体)处理上述细胞. 如图6c所示, 与对照组相比, 暴露于NBD的细胞红色通道的荧光强度明显增强. 为进一步验证QS-EC对内源性SO2的检测能力, 将NBD预处理过的MCF-7 细胞与N-乙基马来酰亚胺(N-Ethylmaleimide, NEM, 一种生物硫醇清除剂)一起孵育, 发现红色通道荧光强度明显下降. 该实验通过NEM对生物硫醇的消耗有效抑制了HSO3⁻的生成, 进一步验证了QS-EC对内源性HSO3⁻的检测能力. 上述实验结果表明, 探针QS-EC能够成功地检测活细胞中外源性和内源性的HSO3⁻, 突出了其对细胞内亚硫酸氢盐成像的实用性.
图6 (a)不同浓度的探针QS-EC (1、5、10、15、20 μmol/L)与MCF-7细胞共孵育后的细胞存活率; (b) MCF-7细胞中外源性HSO3⁻ (5、10、30 μmol/L)的荧光成像图; (c) MCF-7细胞中内源性HSO3⁻的荧光成像Figure 6 (a) Cell viability of MCF-7 cells after co-incubation with different concentrations of QS-EC (1, 5, 10, 15, 20 μmol/L). (b) Fluorescence images of exogenous HSO3⁻ (5, 10, 30 μmol/L) in MCF-7 cells. (c) Fluorescence imaging of endogenous HSO3⁻ in MCF-7 cells |
3 结论
本研究成功构建了一种基于A-π-A结构的新型喹啉基近红外荧光探针QS-EC用于高选择性、高灵敏度检测HSO3⁻. 探针通过HSO3⁻触发的1,4-亲核加成反应, 实现由A-π-A至D-π-A的结构转变, 恢复ICT效应, 进而引起显著的比色与荧光双模式响应. 光谱研究表明, QS-EC具有响应速度快、检测限低、抗干扰能力强及适用pH范围广等优势. 此外, QS-EC不仅成功用于活细胞中内源性与外源性HSO3⁻的实时成像, 更在斑马鱼活体层面展现出高信噪比的近红外荧光开启性能, 实现对体内HSO3⁻分布的可视化追踪. 本工作为开发适用于复杂生物体系的HSO3⁻检测工具提供了新思路, 并在SO2相关疾病的早期诊断与生理功能研究方面展现出良好的应用前景.
4 实验部分
4.1 材料与试剂
3-溴喹啉、5-醛基噻吩硼酸、碳酸铯、双(三苯基膦)二氯化钯、三氟甲烷磺酸甲酯、腈乙酸乙酯、甲苯、甲醇、二氯甲烷、乙腈, 购买于安耐吉有限公司; 硅胶(100~200目), 购买于青岛裕民化工厂.
4.2 仪器与设备
数字熔点仪(WRS-1B), 上海优浦科学仪器有限公司; 酸度计(S-25B), 美国Agilent仪器公司; 核磁共振仪(400 MHz), 美国Agilent仪器公司; 荧光分光光度计(F-4700), 日本日立高新技术科学那珂事业所; 紫外分光光度计(U-T1810DS), 屹谱仪器制造(上海)有限公司.
4.3 探针QS-EC的合成
目标探针QS-EC的具体合成步骤如下.
4.3.1 化合物1的合成
将称取的3-溴喹啉(1.30 g, 2.89 mmol)、5-醛基噻吩硼酸(1.0 g, 2.89 mol)和碳酸铯(5.22 g, 7.23 mol)溶于30 mL混合溶液(V(甲苯)∶V(甲醇)=1∶1)中, 随后加入双(三苯基膦)二氯化钯(0.37 g, 0.014 mol). 使用超声波清洗器脱气功能2 min后, 在N2保护下将上述反应加热回流并保持10 h, 利用薄层色谱监控反应进程. 随后将反应冷却至室温, 并用二氯甲烷萃取, 有机层减压蒸馏得到的粗产物通过柱层析(洗脱剂为V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶150)分离提纯, 得到化合物1.
4.3.2 化合物2的合成
将化合物1 (0.3 g, 1.26 mol)溶于二氯甲烷(10 mL)中, 随后加入三氟甲烷磺酸甲酯(0.3 g, 1.88 mol), 将反应瓶处于室温下反应30 min, 过滤得到的黄色固体即为化合物2 (0.35 g, 产率85%).
4.3.3 化合物QS-EC的合成
在圆底烧瓶中加入化合物2 (0.5 g, 1.53 mmol)并溶解在甲醇中, 随后加入腈乙酸乙酯(0.42 g, 2.26 mmol). 将上述反应置于油浴锅中, 加热至40 ℃保持2 h. 反应后经过滤得到深黄色固体, 并用冰甲醇洗涤产物即可得到目标化合物QS-EC (0.52 g, 产率70%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.07 (s, 1H), 9.64 (s, 1H), 8.70 (s, 1H), 8.56~8.52 (m, 2H), 8.32~8.28 (m, 1H), 8.24~8.23 (m, 1H), 8.13~8.03 (m, 2H), 4.71 (s, 3H), 4.34 (q, J=4 Hz, 2H), 1.33 (t, J=4 Hz, 3H) (见支持信息图S1). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 153.10, 149.11, 147.25, 146.01, 144.03, 142.84, 142.09, 138.05, 137.25, 136.07, 135.19, 129.25, 128.53, 126.60, 119.66, 115.45, 113.91, 80.86, 45.90 (见支持信息图S2). HRMS (ESI+): calcd for C19H15N2O2S+ [M]+ m/z 335.0849, found 335.0857(见支持信息图S3).
4.4 探针QS-EC的光谱性能测试
4.4.1 探针母液的制备
称取探针QS-EC溶解于乙腈中, 配置成浓度为1 mmol/L的探针储备液并置于冰箱避光保存.
4.4.2 不同HSO3⁻浓度下探针的紫外吸收光谱与荧光发射光谱测试
将1 mmol/L的探针储备液用体系(V(DMF)∶V(HEPES)=5∶5)稀释至10 μmol/L得到探针测试液, 向测试液中加入不同浓度的HSO3⁻溶液(0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L、35 μmol/L、40 μmol/L), 分别测试其紫外吸收光谱和荧光发射光谱.
4.4.3 不同pH值下的传感能力
将测试液处于不同的pH值环境中(pH=2~13)测试其荧光光谱, 随后向测试液中加入HSO3⁻溶液进行荧光光谱的检测.
4.4.4 探针的选择性实验
向10 μmol/L的探针测试液中加入等量的不同离子溶液(F⁻、Cl⁻、Br⁻、I⁻、CO32⁻、N3⁻、HCO3⁻、CH3COO⁻、PPi、CN⁻、SCN⁻、PO42⁻、SO42⁻、N3、S2O32⁻、HS⁻)进行荧光光谱和紫外吸收光谱的测试. 随后在选择性实验的基础上继续加入HSO3⁻, 测定荧光光谱, 用于验证探针的抗干扰能力.
4.5 细胞实验
4.5.1 细胞毒性
用MTT法检测QS-EC染料对MCF-7细胞的体外细胞毒性. 将细胞接种到96孔板中培养24 h后, 用磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗该板三次, 并与不同浓度的探针(0、1、5、10、15、20 μmol/L (n=3))一起培养24 h. 最后, 用PBS冲洗沉淀三次, 并用150 μL的二甲基亚砜(DMSO)溶解沉淀. 用紫外-可见微孔板阅读器测量570 nm处的吸光度.
4.5.2 细胞成像实验
外源性HSO3⁻的细胞成像: 将MCF-7细胞分为四组. 第一组仅用探针孵育0.5 h进行成像. 第二组在加入探针孵育0.5 h后用5 μmol/L的HSO3⁻处理0.5 h, 然后孵育30 min再成像. 第三组在加入探针孵育0.5 h后用10 μmol/L的HSO3⁻处理30 min后成像. 第四组在加入探针孵育0.5 h后用30 μmol/L的HSO3⁻处理30 min后成像. 成像前, 每组细胞用PBS冲洗三次. 使用红色通道(λex=550 nm, λem=625~700 nm)观察所有组.
内源性HSO3⁻的细胞成像: 将MCF-7细胞分为三组. 第一组仅用探针孵育0.5 h进行成像. 第二组在加入探针前用30 μmol/L的NBD处理0.5 h, 然后孵育30 min再成像. 第三组用硫醇消耗剂NEM处理0.5 h, 然后与探针一起孵育30 min. 成像前, 每组细胞用PBS冲洗三次. 使用红色通道(λex=550 nm, λem=625~700 nm)观察所有组.
4.5.3 斑马鱼成像实验
在斑马鱼活体成像实验中, 选用3~5日龄健康斑马鱼, 将其分为实验组(探针处理＋HSO3⁻暴露)和对照组(仅探针处理). 首先将斑马鱼在10 μmol/L的QS-EC探针溶液中孵育30 min, 随后转移至含不同浓度HSO3⁻ (0~30 μmol/L)的培养液中继续暴露30 min. 使用共聚焦显微镜在激发波长550 nm、发射波段625~700 nm条件下采集图像, 保持所有组别曝光参数一致. 所有实验均重复三次, 过程中斑马鱼保持正常生理状态, 证实QS-EC具有优异的活体成像能力与生物相容性.
(Cheng, B.)