一氧化碳(carbon monoxide, CO)是重要的气体信号传递分子之一, 在多种生理和病理过程中发挥重要的调节作用, 对维持生物体内平衡至关重要[1-2]. 人体中的内源性CO主要通过血红素加氧酶催化血红素降解产生[3], 通过与蛋白质中的低价过渡金属中心配位表现出对细胞信号通路和离子通道等[4-5]调控作用, 以及心肌保护[6]、抗炎[7]、抗凋亡[8]和抗肿瘤[9]等多种生物活性. 近年来, CO作为一种潜在的可治疗多种疾病的药物分子受到了极大的关注[10]. 目前, 几项涉及吸入性CO作为治疗炎症和血管疾病的药物已经完成或正在处于临床研究中[10-11].
然而, CO作为药物治疗分子包括其生理病理调控机制的研究还需要克服一些难题. 首先, CO具有毒性, 其毒性主要来源于CO可以与氧气竞争性结合血液中红细胞的血红蛋白, 阻碍氧气的正常运输, 从而导致生物体缺氧窒息[12]. 其次, 由于CO作为气体分子, 具有易扩散性, 难以在疾病的病理组织或者特定的细胞中的富集[13]. 此外, CO在不同疾病条件下生物活性的量效关系还不是很清楚. 为解决这些难题, 研究者们发展了能在生理条件下释放CO的一氧化碳释放分子(CO releasing molecules, CORMs)或者CO给体(CO donors), 主要可分为过渡金属羰基配合物[14-17]和有机小分子CO给体两大类[18]. 从CO的可控释放方式上可分为光控释放[19]、酶促释放[20]以及点击化学释放[21]等. 有机小分子CO给体分子如α,α-双烷基醛、三烃基硅酸、碳酸硼盐、黄酮醇等, 它们具有生物相容性好、方便结构修饰改造等优点, 与光控释放相结合, 更容易实现CO的时空可控释放[22]. 其中, 以3-羟基黄酮醇(3-hydroxyflavonol, HF)为CO光控释放结构单元的有机小分子CO给体, 由于该结构来源于天然产物, 受到了广泛的关注[13,23]. 机理研究表明它可能通过不同的光反应路径与氧气反应生成CO. 在光照条件下, HF的三线态质子转移激发态与基态的氧气分子反应能生成CO, 基态的HF也能与经染料分子敏化生成的单线态氧反应释放CO. 这种多反应路径使得HF能在氧气的存在下, 几乎定量光解释放CO[24]. 此外, 由于HF分子本身具有荧光, 而光解后C环开裂生成的缩酚酸产物荧光消失, 可方便地通过荧光信号的减弱或消失指示CO的释放, 这对研究CO的量效关系尤为重要. 另外, 由于3位的羟基对CO的光控释放是必不可少的, 可方便地通过对3位羟基的保护实现多一层的可控释放或靶向释放. HF作为光控释放CO给体仍有一些缺点, 限制了它作为CO给体的应用. 首先, 它的吸收主要在紫外区, 需要用紫外光或蓝光光解, 光解波长短, 光毒性大, 并且在生物学应用时的组织穿透性低[25]. 其次, 它在CO光控释放时产生的荧光响应是荧光淬灭(On-Off)型, 对通过荧光成像来监测CO的释放是不利的.
近年来, 针对HF分子的结构改造, 以获得光解波长更长, 荧光响应为荧光增强(Off-On)型或者比率型荧光响应的光控释放CO给体分子取得了一些进展. 其中, 大多数的结构改造聚焦于在A环引入取代基、将苯环替换为萘环或者融合菁染料结构, 或者通过在B环上引入取代基或者替换为简单的杂环等. 2019年, Feng等[26]通过将黄酮醇的B环替换为香豆素荧光团, 得到了第一个在可见光照射(460 nm)下实现光控释放CO的CO给体分子Cou-Flavone(图1b), 同时产生比率型荧光响应, 可在细胞和动物体内实现CO的释放和荧光成像监测. 2020年, Štacková等[27]将黄酮醇与近红外菁染料结构相融合, 发展了可在近红外光控释放CO给体分子Cyanine-Flavonol Hybrids(图1b), 但未对其荧光变化进行研究. 2023年, Li等[28]通过在黄酮醇的A环和B环上同时扩展π共轭, 得到吸收峰和发射峰均发生较大红移的光控释放CO给体分子Nbp-flaH(图1b). 尽管目前研究者们已经开发了多个基于黄酮醇的CORMs, 但它们大都需要用紫外光或蓝光进行光解, 组织穿透性低, 光毒性大. 另外, 现有的研究中, 在黄酮醇结构中引入荧光团的分子设计的普适性还不强, 荧光信号生成的波段也有限. 因此, 进一步发展在黄酮醇结构中引入荧光团的通用性分子设计, 开发可在其它可见光波段光解或者荧光响应的黄酮醇类似物作为光控释放CO给体用于CO的可控释放和荧光定量跟踪, 仍然具有重要意义.
图1 (a)已报道的基于3-羟基黄酮醇结构衍生的光控CO给体; (b)光解波长在可见区或近红外区的3-羟基黄酮醇衍生物的代表性结构; (c)本工作: 3-羟基黄酮醇(HF)通过在B环4'位以双键共轭的连接方式与氟硼二吡咯(BODIPY)荧光团连接Figure 1 (a) Reported 3-HF derivatives for photo-controlled CO donors; (b) Representative structures of 3-HF derivatives with photolysis wavelength at visible or near-infrared region; (c) This work: incorporation of a boron-dipyrromethene (BODIPY) fluorophore conjugated to 4' position of 3-hydroxyflavone (HF) via a double-bond linkage |
1 结果与讨论
1.1 探针BODIPY-Fla-1的合成
1.2 BODIPY-Fla-1光解反应紫外-可见吸收光谱的变化
BODIPY-Fla-1在磷酸盐缓冲溶液(PBS,10 mmol/L, pH=7.4)中的紫外-可见吸收谱图有三个吸收峰, 分别在390、554和606 nm (图2a). 它在绿光波段(550 nm左右)有明显的吸收. 以15 W绿色LED灯为光解光源, 每光照5 min后测一次紫外-可见吸收光谱. 结果显示, 随着光照时间的增加, 390和606 nm处的吸收峰强度逐渐降低, 而504 nm处的吸收峰逐渐升高. 光照60 min后变化趋于平缓, 显示光解反应达到终点.
图2 (a) BODIPY-Fla-1 (10 μmol/L)随光解时间变化的紫外吸收光谱; (b) BODIPY-Fla-1 (10 μmol/L)随光解时间变化的荧光发射光谱图(λex=520 nm)Figure 2 (a) Time-dependent UV absorption spectra of BODIPY-Fla-1 (10 μmol/L) upon photolysis; (b) Time-dependent fluorescence emission spectrum of BODIPY-Fla-1 (10 μmol/L, λex=520 nm) upon photolysis All measurements were performed in 10 mmol/L pH=7.4 PBS buffer. Photolysis reactions were performed under a 15 W green LED light. |
1.3 BODIPY-Fla-1光解反应荧光光谱变化
光照前BODIPY-Fla-1的荧光很弱, 推测是由于其疏水性和平面结构, 在水溶液中容易发生聚集, 而平面结构在分子聚集时容易发生分子间π轨道堆积作用产生聚集荧光淬灭(aggregation-caused quenching, ACQ)现象(参见1.6). 用15 W绿光LED光源照射后, 562 nm处荧光发射峰逐渐增强(图2b), 60 min后达到最大值, 显示光解反应达到终点. 荧光激发光谱显示其最大激发波长位于552 nm处. 由于BODIPY-Fla-1的Stocks位移较小, 因此, 选取520 nm作为后续荧光信号检测光解释放CO的激发波长.
1.4 BODIPY-Fla-1的光控释放CO的确认
采用了两种不同的方法来验证BODIPY-Fla-1光解后释放CO. 首先, 利用CO荧光探针NF-APC[32]来检测BODIPY-Fla-1光解后产生的CO. CO通过快速还原Pd(II)为Pd(0), 催化荧光探针NF-FPC脱去烯丙基碳酸酯, 产生688 nm的特征荧光发射峰(λex=620 nm). 如图3a所示, 10 μmol/L的BODIPY-Fla-1在绿色LED灯下光照15 min后加入探针NF-APC (10 μmol/L)和Na2PdCl4 (60 μmol/L)后, 确实能观察到688 nm处的荧光随放置时间不断增强, 证明了BODIPY- Fla-1在光照下能够释放CO. 进一步利用血红蛋白捕获光解产生的CO, 通过紫外-可见吸收光谱的变化验证光解释放CO. 当BODIPY-Fla-1与血红蛋白(hemoglobin, Hb)的混合溶液光照后, 每10 min测一次吸收光谱, 血红蛋白由于结合CO转化为碳氧血红蛋白(carboxyhemoglobin, HbCO), 其在427 nm处的最大吸收峰逐渐蓝移至407 nm左右(图3b)[33], 从而可以确证BODIPY-Fla-1在绿光LED的照射下释放了CO.
图3 (a) BODIPY-Fla-1 (10 μmol/L)绿光照射15 min后加入探针NF-APC (10 μmol/L)与Na2PdCl4 (60 μmol/L)后荧光发射谱图随时间的变化(λex=620 nm); (b)探针BODIPY-Fla-1 (50 μmol/L)与血红蛋白(4.2 μmol/L)共孵育条件下的紫外吸收光谱随绿光照射时间的变化(每10 min测一次); (c)相应生成的碳氧血红蛋白浓度计算值随光照时间的变化Figure 3 (a) Time-dependent fluorescence emission spectra of 10 μmol/L BODIPY-Fla-1 preirradiated with green LED light for 15 min incubated with NF-APC (10 μmol/L) and Na2PdCl4 (60 μmol/L) (λex=620 nm); (b) Time-dependent absorption spectra of the probe BODIPY-Fla-1 (50 μmol/L) coincubated with Hb (4.2 μmol/L) upon irradiated with green LED light; (c) Corresponding time-dependent calculated COHb concentration upon photoirradiation All measurements were performed in 10 mmol/L pH=7.4 PBS buffer, the light source is green LED, 15 W |
进一步参考He等[33]基于血红蛋白捕获CO前后紫外-可见吸收光谱变化推导的与CO结合的碳氧血红蛋白的浓度计算公式CHbCO=[(528.6×A410－304.0×A430)/(216.5×A410－442.4×A430)]CHb来计算被捕获的CO浓度, 其中A410和A430分别代表和410和430 nm的吸光度, 即在实验中实测血红蛋白和碳氧血红蛋白最大吸收波长处的吸光度, 而CHb为血红蛋白的起始浓度. 由于实测的血红蛋白和碳氧血红蛋白的最大吸收波长分别位于427和407 nm处, 以这两处的吸光度代替公式中430和410 nm处的吸光度, 粗略计算HbCO的浓度, 即所捕获的CO浓度. 如图3c所示, 血红蛋白捕获的CO的浓度随着BODIPY-Fla-1光解照射时间的增加而增加. 光照40 min后计算HbCO的浓度为2.7 µmol/L, 由此计算10 μmol/L BODIPY-Fla-1在15 W绿色LED灯光照下释放CO的产率至少为5.4%.
1.5 BODIPY-Fla-1光解生成的荧光产物的结构确证研究
对BODIPY-Fla-1光解反应(图4)的主要产物BODIPY-Carboxylate-1进行了分离提纯，通过核磁共振氢谱和HRMS对其结构进行了确认, 并对BODIPY- Carboxylate-1和光解溶液的归一化荧光光谱进行了比较, 确认了它就是荧光产物.
此外, 也对不同照射时间的BODIPY-Fla-1的PBS缓冲溶液进行高效液相色谱法(HPLC)分析, 随着光照时间的增加, 可以观察原料峰(BODIPY-Fla-1, 保留时间为16.8 min)的下降和主要产物峰(BODIPY-Car- boxylate-1, 保留时间7.8 min)的增加, 进一步确认了光解反应的产物为BODIPY-Carboxylate-1.
1.6 BODIPY-Fla-1光解前后溶液聚集粒径变化研究
为验证BODIPY-Fla-1的聚集荧光淬灭机制, 通过动态光散射分析技术对测试条件下即BODIPY-Fla-1 (10 µmol/L)于细胞完全培养基中绿光照射前后聚集粒径的变化进行测量. 结果显示, 光照前测得的粒径为343.9 nm, 而光照60 min后降低为284.2 nm, 说明光解后聚集粒径降低. 推测其原因, 一方面, 光解产物BODIPY-Carboxylate-1具有亲水性基团羧基, 亲水性增加. 另一方面, 由于黄酮醇基团C环的裂解, 导致分子的平面性减弱, ACQ效应减弱, 由此在562 nm处产生由于荧光产物BODIPY-Carboxylate-1溶解产生的荧光增强信号.
1.7 BODIPY-Fla-1绿光可控光解和荧光监测性能的循环测试验证
为进一步验证BODIPY-Fla-1在绿光照射下可控光解释放CO并产生荧光信号, 对BODIPY-Fla-1 (10 µmol/L)的PBS缓冲溶液, 进行了绿光照射和荧光检测(λex/em=520/562 nm)循环测试, 每照射15 min用荧光仪监测5 min. 从荧光强度增加的阶梯图(图5)可以看出, BODIPY-Fla-1的PBS溶液每照射15 min后荧光均有不同程度的增强, 在避光条件下溶液荧光保持平稳不变. 从荧光产物的生成量可以反推CO的释放量也近似相等. 因此, 可以通过光照的时间和地点调控以实现精准的时间和空间控制的CO的释放.
图5 探针BODIPY-Fla-1 (10 μmol/L)在PBS缓冲液(10 mmol/L, pH=7.4)中每隔15 min周期性照射(15 W, 绿色LED灯)后在562 nm处(λex=520 nm)的荧光强度随时间变化Figure 5 Time-dependent of fluorescent intensity changes of probe BODIPY-Fla-1 (10 μmol/L) at 562 nm (λex=520 nm) in PBS buffer (10 mmol/L, pH=7.4) after the periodic irradiation with green LED (15 W) in every 15 min |
1.8 BODIPY-Fla-1的光控CO释放的荧光跟踪成像和生物功能验证
1.8.1 细胞毒性实验
首先在HeLa细胞和RAW264.7细胞中考察了CO光控释放给体分子BODIPY-Fla-1的细胞毒性(图6). 在非光照的条件下BODIPY-Fla-1在浓度达到100 µmol/L时仍未表现出明显的细胞毒性.
图6 (a)不同浓度的BODIPY-Fla-1作用于HeLa细胞8 h后的细胞存活率; (b)不同浓度的BODIPY-Fla-1作用于RAW264.7细胞8 h后的细胞存活率Figure 6 (a) Percentage of viable HeLa cells after treated with different concentrations of BODIPY-Fla-1 for 8 h; (b) Percentage of viable RAW264.7 cells after treated with different concentrations of BODIPY-Fla-1 for 8 h |
1.8.2 活细胞中CO光控释放和荧光成像实验
对不同浓度的BODIPY-Fla-1在RAW 264.7巨噬细胞中CO光控释放进行了荧光成像实验. 未经BODIPY- Fla-1处理的细胞没有明显的荧光(图7a), 然后使用10 µmol/L的BODIPY-Fla-1处理细胞, 其中图7a~7b是未经光照处理的细胞荧光成像图, 图7c是使用绿光照射30 min后的细胞影响成像图. 从图7可知, 用10 µmol/L浓度探针BODIPY-Fla-1处理的细胞在光照前后荧光有明显的差异, 光照前几乎没有荧光, 光照后荧光显著增强. 因此, 在活细胞中的荧光成像实验表明探针BODIPY-Fla-1可以在活细胞中实现光控CO释放, 同时可以通过荧光强度的增强实现对CO释放位置追踪.
图7 探针BODIPY-Fla-1 (10 μmol/L)在RAW 264.7细胞中的CO释放荧光成像图: (a)细胞在正常培养基中孵育; (b)探针BODIPY-Fla-1 (10 µmol/L)孵育10 min后的细胞荧光图像; (c)探针BODIPY-Fla-1 (10 µmol/L)孵育10 min后再光照30 min后的细胞荧光图像; (d~f)相应的明场图像; (g)不同细胞组中荧光图像的相对荧光强度(于λex=340~380 nm, λem>425 nm处采集荧光图像, 光解所用光源为15 W绿色LED灯, 误差棒表示三个重复的标准偏差, ****P≤0.0001, ***P≤0.001)Figure 7 Fluorescence imaging of CO-release with probe BODIPY-Fla-1 in living RAW 264.7 cells. (a) Cells were incubated in normal media; (b) Fluorescence image of cells incubated in 10 μmol/L probe BODIPY-Fla-1 for 10 min; (c) Fluorescence image of cells incubated in 10 μmol/L probe BODIPY-Fla-1 for 10 min followed by 30 min of irradiation; (d~f) Corresponding bright-field images; (g) Relative fluorescence intensities of fluorescence images in different cell groups (Fluorescence images were captured with λex=340~380 nm and λem>425 nm; irradiation light source: green LED,15 W. The error bar represents the standard deviation of three repetitions, ****P≤0.0001, ***P≤0.001) |
1.8.3 活细胞中的CO光控释放对氧化应激的影响
为了进一步考察BODIPY-Fla-1光照释放的CO具有生物功能, 以10 µmol/L过氧化氢处理后的A549细胞为细胞氧化应激模型, 考察不同浓度的BODIPY-Fla-1孵育和光解释放CO后对细胞的超氧自由基水平的影响. 采用二氢乙锭(Dihydroethidium, DHE)作为超氧自由基荧光探针[34], 其与超氧自由基反应前的激发和发射波长为370和420 nm, 反应后的激发和发射波长为535和610 nm. 由于610 nm处的发射和BODIPY-Fla-1在光照后产生的荧光有一定的重合, 因此, 将420 nm处的荧光强度变化来衡量细胞内超氧自由基的水平变化. 为了排除光解产物BODIPY-Carboxylate-1可能的影响, 将50 µmol/L的BODIPY-Carboxylate-1处理的细胞也作为参照. 如图8所示, 用10和50 µmol/L BODIPY- Fla-1处理后未进行光照的细胞内超氧自由基水平表现出一定水平的下降, 说明该类黄酮醇衍生物本身就具有一定的抗氧化活性. 用10 µmol/L BODIPY-Fla-1处理细胞后, 绿光照射30 min, 细胞内的超氧自由基水平没有明显降低, 可能与光照释放的CO的量不够有关. 而当BODIPY-Fla-1浓度提高至50 µmol/L时, 可以观察到比未光照更为显著的荧光强度的降低. 而50 µmol/L的光解荧光产物BODIPY-Carboxylate-1并未表现出明显的荧光强度降低. 说明在该条件下光控释放的CO而不是荧光产物, 能显著地缓解和改善A549细胞的氧化应激水平.
图8 不同浓度的BODIPY-Fla-1在绿光照射或黑暗条件下对A549细胞的抗氧化应激作用Figure 8 Anti-oxidative stress effect of different concentrations of BODIPY-Fla-1 on A549 cells in dark or under green light irradiation Error bars represent standard deviations of three replicate images in the same group, ***P≤0.001, *P≤0.1, ns: no significant difference. |
2 结论
以3-羟基黄酮醇为光控释放CO基团, 通过在黄酮醇的B环4'位以双键的方式引入BODIPY荧光团, 设计合成了一种可在绿光照射下释放CO的新型光控释放CO给体分子BODIPY-Fla-1. 它在水溶液中由于聚集产生ACQ效应引起荧光淬灭, 绿光照射后释放CO, 生成的荧光产物的水溶性增大, ACQ效应消失, 产生562 nm的荧光发射峰. 通过荧光成像对CO给体BODIPY-Fla- 1在RAW 264.7巨噬细胞中的光照释放CO进行了研究. RAW 264.7巨噬细胞在用50 μmol/L CO给体BODIPY- Fla-1孵育后, 在绿色LED灯照射后通过荧光成像可观察到显著的光照依赖性荧光增强, 验证了其能在复杂的生物体系中实现光控释放CO, 并可通过产生的荧光增强信号跟踪CO的释放. 此外, 为验证光控释放CO给体BODIPY-Fla-1光照产生的CO具有生物功能, 以过氧化氢预处理的A549细胞为细胞氧化应激模型, BODIPY-Fla-1孵育后在绿光照射下释放CO, 有效地降低了细胞超氧自由基水平, 并具有浓度的依赖性, 说明该CO给体通过光控释放CO能降低细胞的氧化应激水平. 相比于3-羟基黄酮醇母核需要在400 nm左右的蓝光照射下才能释放CO, BODIPY-Fla-1在550 nm的绿光照射下即可释放CO, 长波长的绿光照射具有更低的光毒性和更深的组织穿透性. 这种通过在3-羟基黄酮醇B环引入共轭双键连接荧光团的设计具有通用性, 为进一步开发光解波长更长、可荧光跟踪CO释放的光控CO给体分子的设计提供了新的设计思路.
3 实验部分
3.1 仪器与试剂
核磁共振氢谱和碳谱数据由Brucker Avance 400 NMR型核磁共振仪和Brucker Avance 600 NMR型核磁共振仪测定. 质谱所用仪器为Micromass GCTTM. 所用紫外分光光度计型号为Shimadzu UV-1800. 所用pH计为METTLER TOLEDO公司生产的便携式pH计, 型号为Seven2go. 文中所使用的所有溶剂和试剂除有特殊说明, 均为AR级.
3.2 实验方法
3.2.1 探针BODIPY-Fla-1的合成及表征
取大小合适的微波反应管, 将化合物1 (44 mg, 0.2 mmol)和化合物2 (64 mg, 0.2 mmol)混悬于5 mL无水乙醇中, 向其中依次加入哌啶(81 μL, 2.0 mmol)和乙酸(81 μL, 2.0 mmol), 加料完毕后盖上瓶塞, 将反应管置于微波反应器中, 设置微波反应温度为120 ℃, 反应功率为80 W, 反应时间为30 min. 反应完毕后降至室温, 过滤, 滤饼用冰乙醇洗涤, 粗产物经快速柱层析得到目标化合物BODIPY-Fla-1 36 mg, 产率39%, 紫色固体. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.93 (s, 1H), 8.36 (d, J=8.3 Hz, 2H), 8.13 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.90~7.75 (m, 7H), 7.55 (d, J=16.3 Hz, 1H), 7.49 (t, J=7.3 Hz, 1H), 7.19 (s, 1H), 7.15 (d, J=4.0 Hz, 1H), 6.56 (dd, J=3.9, 2.1 Hz, 1H), 2.36 (s, 3H); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ: 173.0, 157.5, 154.6, 145.4, 139.8, 139.5, 139.4, 137.4, 136.7, 133.9, 133.9, 133.3, 132.5, 128.3, 127.7, 127.3, 125.4, 124.8, 124.6, 124.6, 121.3, 118.6, 118.4, 117.9, 117.0, 11.3; EI-HRMS calcd for C27H19BF2N2O3 468.1457, found 468.1462.
3.2.2 探针BODIPY-Carboxylate-1的合成及表征
将BODIPY-Fla-1(20 mg, 0.04 mmol)溶于1 mL二甲基亚砜(DMSO)中, 将溶解的化合物母液加入至20 mL的PBS中, 在绿色LED灯的照射下搅拌反应6 h. 反应完毕后, 使用二氯甲烷(DCM)萃取(20 mL×3), 合并有机相, 无水硫酸钠干燥、过滤并浓缩, 粗产物经快速柱层析纯化得目标产物BODIPY-Carboxylate-1 5 mg, 产率25%, 紫色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 13.05 (br, 1H), 8.20 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.99 (dd, J=7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.90 (d, J=16.5 Hz, 1H), 7.85~7.81 (m, 3H), 7.71 (td, J=7.9, 1.5 Hz, 1H), 7.59 (d, J=16.4 Hz, 1H), 7.45 (t, J=7.6 Hz, 1H), 7.39 (d, J=7.7 Hz, 1H), 7.21~7.18 (m, 2H), 6.58 (dd, J=3.9, 2.0 Hz, 1H), 2.37 (s, 3H); ESI-HRMS calcd for C26H20BF2N2O4 471.1333, found 471.1318.
3.2.3 探针BODIPY-Fla-1的光谱测试
荧光光谱数据由HoribaScientific公司生产的型号为Fluoromax-4的荧光仪测得. 吸收光谱由岛津公司生产的型号为UV-1800型紫外分光光度器测得. 将CO给体分子BODIPY-Fla-1溶于DMSO中, 制备浓度为10 mmol/L的母液备用. CO给体分子荧光测试所用溶剂均为PBS缓冲液(10 mmol/L, pH=7.4), CORMs的浓度为10 µmol/L, 狭缝宽度设置为1 nm.
3.2.4 通过血红蛋白法测定探针BODIPY-Fla-1释放CO
通过紫外分光光度计测试PBS中Hb到HbCO的转化率以确定CO的释放量. 首先将牛红细胞血红蛋白完全溶解于PBS (10 mmol/L, pH=7.4)中, 最终浓度为4.2 μmol/L, 然后在N2氛围下中加入连二亚硫酸钠还原血红蛋白. 在比色皿中加入配置好的Hb的PBS溶液和不同的CO给体分子母液, 使其最终浓度为50 μmol/L, 将比色皿密封, 然后使用不同的光源照射以诱导CO释放并测试其紫外吸收, 根据特征吸收峰判断CO的释放或对释放的CO进行定量.
3.2.5 探针BODIPY-Fla-1释放CO的光激发条件
探针BODIPY-Fla-1的体外测试使用的光反应器为自制的绿光LED反应器, 使用时控制功率为15 W, 比色皿置于光反应器中间位置. 在进行细胞实验时, 使用的JAXMAN公司生产的型号为E2L的绿光LED手电筒, 照射功率为7 W, 光源在距离细胞培养液12 cm的位置进行照射.
3.2.6 探针BODIPY-Fla-1的细胞毒性实验
将HeLa细胞接种在含体积分数为10%胎牛血清和体积分数为1%谷氨酰胺的含酚红的T-25细胞培养瓶中, 于37 ℃下培养至对数生长期后, 在96孔板中接种细胞悬液(100 μL/孔), 并将培养板放在培养箱中预培养过夜. 而后将预稀释至相应浓度的给体分子加到实验孔中, 使其终浓度分别为20、50、100 μmol/L, 每个浓度重复六组实验孔. 将孔板于37 ℃、体积分数为5% CO2孵育8 h后, 向每孔加入10 μL CCK-8溶液, 将培养板在培养箱内孵育8 h, 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度. 细胞存活率的计算公式为: Cell viability (% of control)=(ODEG－ODZG)/(ODCG－ODZG)×100%.
3.2.7 探针BODIPY-Fla-1的细胞荧光成像实验
将Raw 264.7细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清和体积分数为1%谷氨酰胺的含酚红的T-25细胞培养瓶中, 在37 ℃下培养48 h, 实验前一天将细胞转移到6孔板(ThermoScience)上, 使细胞贴壁. 将BODIPY-Fla- 1配制成100 mmol/L的储备液, 稀释后加到每实验孔中使其终浓度为10或50 μmol/L, 实验孔与对照孔均于37 ℃、避光孵育10 min, 随后光照组使用绿光照射30 min, 而后所有组弃去原培养基, 并用PBS缓冲液洗涤两次, 加入新鲜培养基, 在NikonEclipseTi-S显微镜(Ex515-560)上以20倍物镜在500 ms曝光时间下拍摄图像.
3.2.8 探针BODIPY-Fla-1释放CO对氧化应激的影响
将处于对数生长期的A549细胞接种于六孔板中, 在37 ℃、体积分数为5% CO2的细胞培养箱中培养过夜, 而后将10 μmol/L的H2O2及预稀释至相应浓度的BODIPY-Fla-1或BODIPY-Carboxylate-1加到实验孔中, 使其终浓度分别为10或50 μmol/L. 随后实验组光照30 min, 37 ℃避光孵育4 h后, 去除原培养基, 向每孔加入PBS稀释的5 μmol/L探针DHE, 将培养板在培养箱内孵育30 min, 用PBS (2 mL×3)洗涤细胞, 以充分去除未进入细胞内的DHE, 随后用PBS吹打重悬各组细胞至黑色96孔板中. 由于DHE与活性氧(ROS)反应脱氢后的发射与给体释放CO后的荧光有重叠, 故测定DHE脱氢前的荧光强度(激发: 370 nm, 发射: 420 nm), 计算时用5 μmol/L DHE本底荧光强度减去各组荧光强度, 相应差值即视为对应各组细胞内ROS含量.
辅助材料(Supporting Information) 探针分子BODI- PY-Fla-1的荧光激发发射谱图, 探针分子BODIPY- Fla-1光解60 min后与产物BODIPY-Carboxylate-1的荧光归一化谱图, 探针分子BODIPY-Fla-1在不同照射时间下的LC-MS谱图, 探针分子BODIPY-Fla-1在光照前后的动态散射分析图, 以及探针分子BODIPY-Fla-1结构表征的1H NMR、13C NMR和质谱图. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.
(Cheng, F.)