酰氨基硫脲类化合物中均含有N、S和O等杂原子, 这些富电子的杂原子具有形成优质氢键的能力[1], 易与一些酶或受体等大分子间形成氢键结合, 从而具有广泛的生物活性. 一直以来, 酰氨基硫脲类化合物主要应用于农业领域, 作为抗病毒剂、抗植物菌剂[2]、除草剂、植物生长调节剂和杀虫剂[3]. 然而, 近年来的研究表明, 酰氨基硫脲类化合物还具有抗癌、抗疟疾、抑酶、降血压和抗HIV等活性[4-5], 进一步拓展了酰氨基硫脲类化合物的应用范围. 在药物开发领域, 酰氨基硫脲类化合物显示出巨大的潜力, 具有良好的应用前景.
天然产物的结构种类丰富, 且显示出多样的药理活性, 为药物开发提供了宝贵的先导化合物[6-7]. 目前, 许多临床药物的结构来源都与天然产物密切相关[8], 在抗癌、抗感染、抗疟和免疫系统等药物领域中显示出重要作用[9-10]. 二萜化合物广泛存在于自然界的多种植物中, 并表现出抗真菌、抗炎、抗氧化、降血糖、抗血小板凝集、抗癌和抗病毒等多种药理作用[11-14]. 异海松酸是一种珍贵的天然产物, 源自林化资源松香, 其化学结构也属于二萜类型, 且包含一个氢化菲环、两个非共轭双键和一个羧基等官能团. 这种有别于其他具有共轭双键的二萜化合物结构, 使得异海松酸具有广泛的抗癌、杀虫、抗菌、抑酶和K＋通道开启活性及抗结核杆菌活性[15]. 近年来有研究发现, 异海松酸还具有抗癫痫作用和促进水稻生长的活性[16-17]. 然而, 关于异海松酸衍生化合物在生物活性方面的研究仍然较为有限, 相关报道较少, 其潜力亟待进一步探索.
1 结果与讨论
1.1 目标化合物的合成
目标化合物的合成路线如Scheme 2所示. 异海松酸的羧基受到位阻的影响, 反应活性较弱. 因此, 为了提高异海松酸羧基的反应活性, 首先将异海松酸转化成异海松酰氯, 酰氯化试剂选择反应条件比较温和的草酰氯[(COCl)2]. 常温下, 异海松酸与稍过量草酰氯反应3 h, 经过减压蒸除过量的草酰氯和溶剂即可得到高活性的异海松酰氯(1), 转化率达97.8%; 然后, 中间体1与硫氰化钾(KSCN)在乙腈溶剂中回流反应2 h, 反应完成后过滤除去盐, 得到的滤液即为含异海松酰基异硫氰酸酯(2)的溶液, 不需进一步处理, 可直接用于下一步反应; 最后, 中间体2与各种芳基酰肼进行缩合反应, 得到目标产物3a~3i.
1.2 生物活性评价
采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测试了所合成的目标化合物对人源肝癌(HepG2)、白血病(K562)、乳腺癌(MCF-7)、前列腺癌(PC-3)以及正常肝细胞(LO2)的细胞毒性, 并通过抑制率计算得到IC50值(表1); 5-氟尿嘧啶(5-FU)作为临床常用的广谱抗癌药物, 对多种肿瘤细胞具有治疗作用, 因此被选作阳性对照药物. 所有待测样品和阳性对照均设置有3个复孔, 抑制率为3次实验的平均值. 从测试结果可以看出, 目标化合物对HepG2和K562细胞均表现出了中等程度的抑制活性, IC50值在(26.1±2.2)~(67.3±2.6) μmol/L之间; 而部分化合物对MCF-7和PC-3表现出强烈的抗增殖活性, 如化合物3a和3d对MCF-7细胞以及化合物3c和3d对PC-3细胞的IC50值均在20 μmol/L以下, 低于阳性对照药物5-FU的IC50值. 其中化合物3d对两种细胞均显示出最强的抗增殖作用, IC50值分别为(8.3±2.2)和(9.1±1.5) μmol/L. 对比目标化合物对4种测试肿瘤细胞的抑制效果可知, 其对MCF-7和PC-3细胞的选择性优于对HepG2和K562细胞. 对正常细胞的毒性测试显示, 除化合物3f外, 其余目标化合物对LO2细胞具有普遍较低的毒性, 由此表明本研究中的化合物具有开发为候选化合物的潜力. 另外, 为了验证我们当前活性分子设计思路的可行性, 还对比测试了前期合成的两个代表性化合物P1和P2[18]对PC-3细胞的抗肿瘤活性(表1). 结果发现, P1对PC-3的抗增殖作用明显低于本研究所设计合成的目标化合物, 且对正常细胞LO2显示出较强的细胞毒性; P2对PC-3的抑制效果也普遍不如目标化合物. 上述结果表明, 本研究中对异海松酸基酰基硫脲类衍生物的结构优化, 有助于提高该类化合物的抗肿瘤生物活性.
表1 化合物3a~3i的抗肿瘤活性Table 1 Antitumor activity of compounds 3a~3i |
| Compound | IC50/(μmol•L－1) | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| HepG2 | K562 | MCF-7 | PC-3 | LO2 | |
| 3a | 34.5±2.7 | 67.3±2.6 | 10.4±2.1 | 16.2±1.6 | 63.37±2.3 |
| 3b | 54.4±1.6 | 42.1±2.2 | 38.8±2.5 | 36.4±2.3 | 109.24±1.2 |
| 3c | 62.3±1.3 | 54.2 ±1.7 | 20.1±1.6 | 17.5±2.4 | 80.84±3.1 |
| 3d | 26.1±2.2 | 40.5±1.2 | 8.3±2.2 | 9.1±1.5 | 73.48±1.7 |
| 3e | 30.7±1.8 | 76.7±2.6 | 41.5±2.4 | 38.3±1.8 | 93.86±1.4 |
| 3f | 43.5±2.3 | 33.4±2.4 | 23.2±3.0 | 23.2±3.4 | 39.46 ±2.8 |
| 3g | 36.4±1.5 | 27.2±1.5 | 26.4±1.9 | 32.6±1.2 | 71.51±1.3 |
| 3h | 35.2±1.2 | 43.7±3.2 | 23.5±2.4 | 27.3±1.4 | 102.38±2.2 |
| 3i | 32.8±2.7 | 35.3±3.4 | 44.2±1.7 | 37.8±3.4 | 86.43±2.7 |
| P1 | NT | NT | NT | 67.65±2.5 | 48.73±2.3 |
| P2 | NT | NT | NT | 33.67±1.9 | 96.82±1.7 |
| 5-FU | 31.4±1.3 | 26.3±2.1 | 32.2±1.4 | 36.3±1.7 | 68.01±1.4 |
a NT: No test. |
初步构效关系分析表明, 除白血病细胞K562外, 苯环间位引入CH3 (3b)和Br (3c)未能有效提高化合物3a对其余几种癌细胞的抗增殖活性; 而苯环对位引入OH (3d)则提高了化合物对4种肿瘤细胞的抑制作用. 杂环结构广泛存在于许多具有生物活性的化合物中, 常被选做活性母核. 研究显示, 超过90%的新药分子结构中含有杂环[19]. 与苯环相比, 杂环更容易与生物大分子如DNA、核酸和蛋白质等发生相互作用, 从而增强药物的靶向性. 在药物设计过程中, 引入杂环结构不仅能够提供多样化的结构单元, 通常还会增强化合物的生物活性, 这在HepG2和K562细胞中能大部分体现出来, 即杂环取代化合物3e~3i的抗癌活性普遍高于苯环取代化合物3b和3c(对HepG2细胞), 化合物3f~3i的活性高于化合物3a~3c(对K562细胞). 然而, 在MCF-7和PC-3细胞中, 当苯基被杂环取代时, 并没能有效地改善化合物的抗癌活性, 活性反而降低了, 如化合物3e~3i的活性普遍低于化合物3a、3c和3d; 尤其是化合物3i, 其活性在所有化合物中最低. 这一结果与我们最初的设想相悖, 对此我们正在尝试找出可能的原因. 对比前期合成的两个代表性化合物P1和P2对PC-3细胞的抑制活性可知, 本研究中所设计合成的目标化合物在活性上普遍优于前期化合物, 这一结果进一步验证了基于官能团拼合原理进行活性分子设计的可行性和生物效果的可预期性.
1.3 分子对接
为了进一步探讨目标化合物与受体的结合模式, 并试图找出杂环化合物活性较低的潜在原因, 本研究选取对目标化合物表现出良好选择性的MCF-7和PC-3肿瘤细胞为研究对象, 开展了分子对接实验研究. 同时, 将前期合成的代表性分子P1和P2纳入分子对接分析, 以揭示目标化合物活性普遍较高的原因. 聚(核苷酸二磷酸腺苷-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂是肿瘤内科靶向治疗领域中最成功的临床转化范例之一[20], 自首个PARP抑制剂olaparib(奥拉帕尼)[21]获批用于乳腺癌易感基因(BRCA)突变的乳腺癌患者以后, PARP-1作为乳腺癌治疗的靶点受到了广泛关注. 此外, 相关研究表明, PARP- 1在前列腺癌组织中高度表达, 与前列腺癌的发生和发展密切相关[22], PARA抑制剂对前列腺癌同样具有巨大的治疗潜力. 最近, PARP抑制剂被批准用于前列腺癌治疗, 为前列腺癌治疗研究开辟了新的途径[23]. 因此, 本研究选择PARP-1 (PDB: 5ds3)作为靶点蛋白, 与目标化合物进行分子对接(表2).
表2 目标化合物与5ds3蛋白的对接结果Table 2 Docking results of target compounds and 5ds3 protein |
| Compd. | Docking score | Hydrogen bond | Hydrophobic interaction | Π-stacking |
|---|---|---|---|---|
| 3a | －43.5 | GLY863 | LEU877, TYR889, ILE895, TYR896, TYR907 | — |
| 3b | －40.6 | — | LEU877, ALA880, TYR896, ALA898, TYR907 | TYR907 |
| 3c | －39.7 | GLY863 | LEU877, ALA880, TYR889, TYR896, TYR907, GLU988 | — |
| 3d | －39.3 | GLY863, TYR907 | ALA880, TYR889, TYR896, TYR907 | TYR907 |
| 3e | －37.2 | — | LEU877, ALA880, TYR896, TYR907 | — |
| 3f | －33.9 | ALA880, TYR889 | TYR896, TYR907 | — |
| 3g | －37.7 | GLY863 | TYR896, TYR896, TYR907 | TYR907 |
| 3h | －33.1 | HIS862, SER864, ASN868 | LEU877, TYR889, TYR896, TYR907 | — |
| 3i | －32.2 | ASN868 | LEU877, ALA880, TYR889, ILE895, TYR896, TYR907 | — |
| P1 | －32.6 | GLY888 | TYR889, TYR896, TYR907 | — |
| P2 | －34.3 | GLY888, TYP889 | LEU877, TYR889, MET890, TYR896 | — |
氢键和疏水作用是稳定蛋白-配体复合物的关键因素[24]. 根据分子对接结果, 目标化合物与PARP-1蛋白主要通过氢键和疏水相互作用形成复合物, 其中化合物3b、3d和3g与蛋白之间还发生了π-堆叠作用. 它们的结合能介于－43.5~－32.2 kJ•mol－1之间, 表明目标化合物与蛋白之间形成了稳定的结合力. 通常情况下, 化合物的对接打分越低, 结合能越高, 表明化合物的活性越强. 从对接结果看, 目标化合物的结合能顺序为: 3a>3b>3c>3d>3g>3e>3f>3h>3i. 然而, 细胞实验结果并未完全按照这一趋势. 例如, 化合物3a的对接打分高于化合物3d, 但生物活性实验表明, 化合物3d对两种肿瘤细胞的抑制作用均优于化合物3a; 同时, 尽管化合物3h的对接打分较低, 但却表现出中等程度的抗肿瘤活性. 分析发现, 化合物3d和3h分别与靶蛋白均形成了两个以上的氢键, 而氢键在蛋白质-配体相互作用中对蛋白质-配体复合物的稳定性起着重要作 用[25]. 此外, 配体与蛋白间还形成多个疏水相互作用, 这可能是导致3d和3h具有较强抗肿瘤活性的关键因素. 分析前期合成化合物P1和P2与5ds3的分子对接情况发现, P1仅与5ds3形成一个氢键, 且疏水相互作用较少, 因此表现出较弱的抗癌活性; 相比之下, P2与5ds3之间形成了两个氢键, 并具有更多的疏水作用, 因而其抗癌活性相对较强.
为了更清晰地展示目标化合物与靶蛋白的结合方式及相互作用, 本研究以高活性的化合物3a、3c和3d, 以及活性较低的化合物3i为代表, 并对比前期合成的两个化合物P1和P2, 使用PyMOL软件对其分子对接结果进行了可视化分析(图1). 通过可视化分析可知, 高活性的化合物3a、3c和3d均结合在蛋白的活性口袋中, 且它们与靶点的结合构型具有较高的相似性, 即芳基一侧深入活性口袋的核心区域(凹槽), 靠近芳基一侧的C=O和NH与甘氨酸(GLY)863残基中的NH和C=O形成两个氢键. 相比之下, 异海松酸母核体积较大, 位于活性口袋的凹槽外部, 且结构上缺乏富电子基团或原子, 因此主要通过疏水作用与5ds3上的多个残基相互作用, 涉及的残基包括LEU877、TYR889、ILE895、TYR896和ALA880等. 进一步分析表明, 化合物3a和3c都与甘氨酸(GLY863)残基形成了两个氢键, 但3a形成的氢键键长分别为0.19 和0.30 nm, 而3c的氢键键长则为0.38和0.40 nm, 这可能是3a的活性优于3c的原因. 化合物3d除了与甘氨酸形成两个氢键(键长分别为0.32和0.21 nm)外, 其4-OH还与酪氨酸(TYR907)残基中的NH形成了一个氢键(键长0.29 nm), 这个氢键可能是促使3d表现出最高活性的关键因素. 对于活性较低的化合物3i (2-呋喃), 在能量最小化过程中, 分子折叠程度较大, 异海松酸母核与杂环芳基酰胺基硫脲侧链几乎成“U”型重叠, 阻碍了芳基深入活性口袋的核心区域, 导致芳基与甘氨酸(GLY863)残基之间的距离增大, 从而无法形成氢键. 尽管3i与天冬氨酸(ASN868)残基形成了一个氢键, 但由于其与蛋白的核心区域没有相互作用, 且主要是通过较弱的疏水键与蛋白发生相互作用, 这可能是致使3i抗肿瘤活性较低的原因. 而前期合成的化合物P1和P2同样由于分子折叠程度较大, 未能充分深入至靶点活性口袋的核心区域, 因而整体活性较低. 尤其是P1, 在与5ds3的分子对接中, 仅形成一个氢键及少量疏水相互作用, 表现出最弱的抗PC-3细胞活性. 相比之下, P2的结构中对F苯基硫脲部分紧贴活性口袋上部的内壁, 能够与甘氨酸(GLY888)和酪氨酸(TYR889)形成两个氢键, 同时具有更多的疏水作用, 因而展现出略高的抗癌活性.
2 结论
本研究基于前期工作, 设计并合成了9种异海松酰基芳酰氨基硫脲衍生物, 并通过MTT法评估了它们对HepG2、K562、MCF-7和PC-3细胞的抗癌活性. 活性数据表明, 大多数化合物对HepG2和K562具有较弱至中等程度的抑制活性, 但对MCF-3和PC-3细胞具有中等至较强的活性. 尤其化合物3d对MCF-7和PC-3两种肿瘤细胞显示出显著的增殖抑制作用, 且强于阳性对照药物5-FU. 分子对接结果显示, 尽管化合物3a与靶蛋白的结合能高于化合物3d, 但其抗肿瘤活性低于化合物3d, 这一现象可能与氢键的形成有关. 该发现为我们提供了一个有价值的活性分子设计思路, 即在分子设计过程中, 考虑引入适当的基团以与配体形成氢键, 进而增强蛋白-配体复合物的稳定性, 从而提高分子的活性. 通过与前期合成化合物的活性对比及分子对接分析, 证实采用官能团拼合策略设计活性分子具有可行性.
3 实验部分
3.1 仪器与试剂
异海松酸, 实验室自制, 纯度94.7%; 草酰氯、苯甲酰肼、3-甲基苯甲酰肼溴苄、3-溴苯甲酰肼、4-羟基苯甲酰肼、2-吡啶酰肼、2-吡啶酰肼、4-吡啶酰肼、2-噻吩酰肼和2-呋喃酰肼均为分析纯, 购自安徽泽升科技股份有限公司; 二氯甲烷、四氢呋喃、三乙胺、石油醚和乙酸乙酯等均为分析纯, 购自贵阳四面体化工有限公司.
Bruker AV-300核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)、Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS质谱仪(美国Agilent公司)、RE5203型真空旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂); 上海申光仪器公司产WRS-1B型数字熔点仪(Shanghai Shenguang Instrument, China), 使用前温度未经校正.
3.2 实验方法
3.2.1 化合物1和2的合成
3.2.2 化合物3的合成
将3.0 mmol芳基酰肼混合于10 mL丙酮中, 滴加上述合成的异海松酰基异硫氰酸酯(2). 滴毕, 50 ℃回流反应, 溶液中有沉淀产生, 薄层色谱(TLC)监测反应进程, 至原料点消失, 结束反应. 反应液冷却至室温, 过滤沉淀, 丙酮洗涤得到化合物3.
异海松酰基-N'-苯甲酰氨基硫脲(3a): 白色固体, 产率85.4%. m.p. 132.2~133.6 ℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 13.56 (s, 1H, CONH), 9.95 (s, 1H, CONH), 8.56 (s, 1H, CSNH), 7.91 (d, J=25 Hz, 2H, ArH), 7.63 (t, J=7.5 Hz, 1H, ArH), 7.53 (t, J=8 Hz, 2H, ArH), 5.87 (dd, J=10.5, 17.5 Hz, 1H, C=CH), 5.34 (brd, 1H, C=CH), 4.99 (dd, J=17.5, 32.5 Hz, 2H, C=CH2), 2.21 (s, 1H), 2.08~1.89 (m, 6H), 1.85~1.80 (m, 2H), 1.71~1.60 (m, 7H), 1.42 (s, 3H, Me), 0.98 (s, 3H, Me), 0.91 (s, 3H, Me); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 179.6, 170.5, 162.6, 150.1, 136.0, 132.8, 130.7, 128.9 (2C), 127.2 (2C), 120.41, 109.4, 52.0, 47.7, 45.9, 45.7, 38.5, 37.1, 36.7, 35.9, 35.3, 25.0, 21.5, 20.1, 17.9, 17.1, 15.4; HRMS calcd for C28H36N3- O2S [M－H]＋ 478.2514, found 478.2512.
N-异海松酰基-N'-(3-甲基苯甲酰氨基)硫脲(3b): 亮灰色固体, 产率80.7%. m.p. 115.7~117.3 ℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 13.57 (s, 1H, CONH), 9.91 (s, 1H, CONH), 8.55 (s, 1H, CSNH), 7.71~7.68 (m, 2H, ArH), 7.43~7.40 (m, 2H, ArH), 5.88 (dd, J=11, 17.5 Hz, 1H, C=CH), 5.35 (brd, 1H, C=CH), 4.99 (dd, J=17.5, 32.5 Hz, 2H, C=CH2), 2.47 (s, 3H, Me), 2.09~1.89 (m, 6H), 1.86~1.81 (m, 2H), 1.72~1.53 (m, 8H), 1.43 (s, 3H, Me), 0.98 (s, 3H, Me), 0.91 (s, 3H, Me); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 179.5, 170.3, 162.4, 150.1, 138.9, 135.9, 133.5, 130.7, 128.8, 127.8, 124.2, 120.3, 109.4, 52.0, 47.7, 45.9, 45.7, 44.9, 38.5, 37.1, 36.7, 36.0, 35.2, 25.0, 21.5, 20.0, 17.9, 17.1, 15.4; HRMS calcd for C29H40N3O2S [M＋H]＋ 494.2836, found 494.2842.
N-异海松酰基-N'-(3-溴苯甲酰氨基)硫脲(3c): 淡黄色固体, 产率72.8%. m.p. 143.9~145.3 ℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 13.54 (s, 1H, CONH), 9.93 (s, 1H, CONH), 8.56 (s, 1H, CSNH), 8.05 (s, 1H, ArH), 7.82 (d, J=7.5 Hz, 1H, ArH), 7.77 (d, J=7.5 Hz, 1H, ArH), 7.42 (t, J=8 Hz, 1H, ArH), 5.88 (dd, J=10.5, 17.5 Hz, 1H, C=CH), 5.35 (brd, 1H, C=CH), 5.00 (dd, J=17.5, 32.5 Hz, 2H, C=CH2), 2.09~1.91 (m, 6H), 1.86~1.80 (m, 2H), 1.72~1.58 (m, 7H), 1.55~1.53 (m, 1H), 1.43 (s, 3H, Me), 0.99 (s, 3H, Me), 0.91 (s, 3H, Me); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 179.6, 170.9, 160.8, 150.1, 136.0, 135.7, 132.7, 130.5, 130.4, 125.6, 123.1, 120.4, 109.4, 52.0, 47.7, 45.9, 45.7, 38.4, 37.1, 36.7, 35.9, 35.2, 25.0, 21.5, 20.0, 17.9, 17.1, 15.3; HRMS calcd for C28H37BrN3O2S [M＋ H]＋ 560.1767, found 560.1769.
N-异海松酰基-N'-(4-羟基苯甲酰氨基)硫脲(3d): 白色固体, 产率57.5%. m.p. 110.6~112.2 ℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 13.55 (s, 1H, NH), 10.81 (s, 1H, NH), 9.85 (s, 1H, OH), 8.56 (s, 1H, NH), 7.80 (d, J=8.5 Hz, 2H, ArH), 6.99 (d, J=13.5 Hz, 2H, ArH), 5.87 (dd, J=11, 17.5 Hz, 1H, C=CH), 5.33 (brd, 1H, C=CH), 4.99 (dd, J=17.5, 32.5 Hz, 2H, C=CH2), 2.09 (s, 1H), 2.03~1.89 (m, 7H), 1.83~1.79 (m, 2H), 1.70~1.60 (m, 6H), 1.42 (s, 3H, Me), 0.97 (s, 3H, Me), 0.90 (s, 3H, Me); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 179.5, 170.3, 162.3, 160.5, 150.1, 135.9, 129.4 (2C), 122.4, 120.3, 115.9 (2C), 109.3, 51.9, 47.7, 45.9, 45.7, 38.4, 37.1, 36.7, 35.9, 35.2, 25.0, 21.5, 19.9, 17.9, 17.1, 15.3; HRMS calcd for C28H38N3O3S [M＋H]＋ 496.2628, found 496.2631.
N-异海松酰基-N'-(4-吡啶甲酰氨基)硫脲(3e): 黄色固体, 产率80.1%. m.p. 96.3~155.8 ℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 13.56 (s, 1H, CONH), 10.10 (s, 1H, CONH), 8.87 (d, J=7.5 Hz, 2H, ArH), 8.60 (s, 1H, CSNH), 7.74 (d, J=7.5 Hz, 2H, ArH), 5.88 (dd, J=11, 17.5 Hz, 1H, C=CH), 5.35 (brd, 1H, C=CH), 5.00 (dd, J=17.5, 32.5 Hz, 2H, C=CH2), 2.00~1.91 (m, 6H), 1.86~1.79 (m, 2H), 1.73~1.61 (m, 6H), 1.56~1.47 (m, 2H), 1.44 (s, 3H, Me), 0.99 (s, 3H, Me), 0.91 (s, 3H, Me); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 179.8, 171.5, 160.3, 150.9 (2C), 150.1, 137.9, 136.1, 120.7 (2C), 120.2, 109.4, 52.0, 47.8, 46.0, 45.7, 38.4, 37.2, 36.7, 35.9, 35.3, 25.0, 21.5, 20.0, 17.9, 17.1, 15.3; HRMS calcd for C27H37N4O2S [M＋H]＋ 481.2722, found 481.2720.
N-异海松酰基-N'-(3-吡啶甲酰氨基)硫脲(3f): 白色固体, 产率63.7%. m.p. 102.2~103.8 ℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 13.52 (s, 1H, CONH), 10.06 (s, 1H, CONH), 9.12 (s, 1H), 8.84 (d, J=7.0 Hz, 1H, ArH), 8.61 (s, 1H, CSNH), 8.21 (d, J=8.0 Hz, 1H, ArH), 7.49~7.47 (m, 1H), 5.87 (dd, J=11, 17.5 Hz, 1H, C=CH), 5.34 (brd, 1H, C=CH), 5.00 (dd, J=17.5, 32.5 Hz, 2H, C=CH2), 2.20 (s, 1H), 2.08~1.90 (m, 6H), 1.85~1.79 (m, 2H), 1.71~1.52 (m, 7H), 1.43 (s, 3H, Me), 0.98 (s, 3H, Me), 0.90 (s, 3H, Me); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 179.7, 171.5, 160.6, 153.3, 150.1, 148.2, 136.0, 135.1, 126.9, 123.7, 120.2, 109.4, 52.0, 47.7, 45.9, 45.7, 38.4, 37.1, 36.7, 35.9, 35.2, 25.0, 21.5, 20.0, 17.9, 17.1, 15.3; HRMS calcd for C27H37N4O2S [M＋H]＋ 481.2602, found 481.2609.
N-异海松酰基-N'-(2-吡啶甲酰氨基)硫脲(3g): 白色固体, 产率67.8%. m.p. 134.7~155.8 ℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 11.25 (brd, 1H, CONH), 10.73 (s, 1H, CONH), 9.02 (s, 1H, CSNH), 8.68 (d, J=4.5 Hz, 1H, ArH), 8.20 (t, J=7.5 Hz, 1H, ArH), 7.93~7.89 (m, 1H, ArH), 7.54~7.48 (m, 1H, ArH), 5.87 (dd, J=10.5, 17.5 Hz, 1H, C=CH), 5.34 (brd, 1H, C=CH), 4.99 (dd, J=18.0, 32.5 Hz, 2H, C=CH2), 2.21 (s, 1H), 2.09 (s, 1H), 1.96~1.92 (m, 4H), 1.86~1.81 (m, 3H), 1.71~1.54 (m, 7H), 1.43 (s, 3H, Me), 0.98 (s, 3H, Me), 0.90 (s, 3H, Me); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 179.5, 171.1, 159.1, 150.1, 148.8, 148.3, 137.4, 135.9, 127.0, 122.6, 120.3, 109.3, 52.0, 47.7, 45.9, 45.7, 38.4, 37.1, 36.7, 35.9, 35.2, 25.0, 21.5, 20.0, 17.9, 17.1, 15.3; HRMS calcd for C27H37N4O2S [M＋H]＋ 481.2742, found 481.2741.
N-异海松酰基-N'-(2-噻吩甲酰氨基)硫脲(3h): 灰色固体, 产率53.6%. m.p. 110.9~112.3 ℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 13.43 (s, 1H, NH), 9.76 (s, 1H, CONH), 8.64 (s, 1H, CSNH), 7.72 (d, J=5 Hz, 1H, ArH), 7.64 (d, J=5 Hz, 1H, ArH), 7.19 (t, J=5 Hz, 1H, ArH), 5.88 (dd, J=10.0, 20.0 Hz, 1H, C=CH), 5.32~5.23 (brd, 1H, C=CH), 4.98 (dd, J=17.5, 33 Hz, 2H, C=CH2), 2.09~1.89 (m, 7H), 1.85~1.79 (m, 2H), 1.72~1.50 (m, 7H), 1.42 (s, 3H, Me), 0.98 (s, 3H, Me), 0.91 (s, 3H, Me); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 179.5, 170.9, 157.3, 150.1, 135.9, 134.4, 131.6, 129.7, 128.0, 120.3, 109.4 (2C), 52.0, 47.7, 45.9, 45.7, 38.4, 37.1, 36.7, 35.9, 35.2, 25.0, 21.5, 20.0, 17.9, 17.1, 15.3; HRMS (ESI) calcd for C26H36N3O2S2 [M＋H]＋ 486.2248, found 486.2252.
N-异海松酰基-N'-(2-呋喃甲酰氨基)硫脲(3i): 淡黄色固体, 产率72.3%. m.p. 123.6~124.9 ℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 13.44 (s, 1H, NH), 9.95 (s, 1H, CONH), 8.56 (s, 1H, CSNH), 7.58 (s, 1H, ArH), 7.30~7.29 (m, 1H, ArH), 6.60~6.59 (m, 1H, ArH), 5.87 (dd, J=10.5, 17.5 Hz, 1H, C=CH), 5.34 (brd, 1H, C=CH), 4.99 (dd, J=17.5, 32.5 Hz, 2H, C=CH2), 2.08~1.89 (m, 6H), 1.84~1.79 (m, 3H), 1.71~1.60 (m, 7H), 1.42 (s, 3H, Me), 0.97 (s, 3H, 17-Me), 0.90 (s, 3H, 20-Me); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 179.5, 171.0, 153.1, 150.1, 145.2, 135.9, 120.3, 116.5, 112.4, 109.4 (2C), 52.1, 47.7, 45.9, 45.7, 38.5, 37.1, 36.7, 36.0, 35.3, 25.0, 21.5, 19.9, 17.9, 17.1, 15.3; HRMS calcd for C26H36N3O3S [M＋H]＋ 470.2472, found 470.2479.
3.2.3 抗肿瘤活性实验
参照文献方法[27], 采用MTT法测试了目标化合物对HepG-2、K562、MCF-7和PC-3肿瘤细胞处理48 h时的抗增殖活性, 以半数抑制浓度(IC50)为检测指标.
3.2.4 分子对接
采用chemdraw 20.0绘制小分子配体结构, 并通过chem 3D来获取小分子配体最低能量构型, 并保存成mol2文件格式. 选择PARP-1蛋白(PDB: 5ds3)作为研究对象, 受体蛋白从RCSB PDB (https://www.rcsb.org/)数据库下载, 并对受体蛋白进行除水和加氢等处理. 然后利用AutoDock Vina软件对处理好的蛋白与配体分子进行对接, 采用pymol软件对对接结果进行可视化分析.
辅助材料(Supporting Information) 目标化合物3a~3i的1H NMR、13C NMR和HRMS原始谱图. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.
(Zhao, C.)