天然产物因其结构多样性和易与大分子结合等特点, 在创新药物研发中具有不可替代的重要地位[1]. 近年来, 传统中药因其多组分、多靶点和低毒副作用等特点, 受到越来越广泛的关注与重视. 中药山香圆为省沽油科(Staphyleaceae)山香圆属植物山香圆[Turpinia arguta (Lindl.) Seem.]的干燥叶, 是我国一种地方标准药材. 该植物多分布于江西和福建等地, 被《中国药典》(2020年版)所收载[2], 其功能与主治为清热解毒、利咽消肿和活血止痛, 民间用于治疗咽喉炎、扁桃体炎、扁桃体脓肿和气管炎等上呼吸道炎症疾病[3]. 现代药理研究表明, 山香圆叶抗上呼吸道炎症的作用机制可能与其抑制炎症细胞的活化和降低炎症介质的释放有关[4]. 基于山香圆提取物制成的片剂在临床验证中对扁桃体炎和咽喉炎等喉部炎症疗效显著[5]. 目前, 已上市的山香圆单味药材制剂主要包括山香圆颗粒[4]、山香圆分散片、山香圆含片和山香圆口服液[6]. 然而, 这些制剂均是由山香圆粗提物直接成药, 其抗炎活性的作用机制尚未明确, 物质基础有待进一步研究.
1 结果与讨论
化合物1为白色粉状物, 根据其HR-ESIMS(准分子离子峰为325.1774 [M＋Na]＋, 计算值为325.1776)和13C NMR数据, 推断它的分子式为C19H26O3. 该分子式表明化合物1的结构中有7个不饱和度. 分析其1H NMR数据, 可知1的结构中有3个单峰甲基信号(δ 2.32, s, Me-16; 1.29, s, Me-19; 0.83, s, Me-20), 2个三取代烯烃质子信号(δ 6.96, s, H-14; 5.96, s, H-7). 其13C NMR谱显示有19个碳信号, 可归属为3个甲基碳, 6个亚甲基碳, 2个次甲基碳, 以及4个sp2杂化的碳原子(δ 132.5, 135.6, 136.9和140.3)和1个羰基碳(δ 199.1)(表1). 以上数据表明化合物1和C-17降碳型松香烷型二萜15-氧代-17-去甲-松香-8,11,13-三烯-18-酸(15-oxo-17-norabieta-8,11,13- trien-18-oic acid)的结构较为相似[16], 二者的区别在于15-氧代-17-去甲-松香-8,11,13-三烯-18-酸中的Δ8和Δ11双键变为1中的Δ7双键. 该变化可以通过化合物1缺少1个不饱和度以及H-7 (5.96, br s)到C-5和C-9、H-14 (6.96, br s)到C-7和C-9的HMBC相关确认(图2). 结合其他关键HMBC相关, 可以确定化合物1的平面结构如图2所示.
表1 化合物1和2的1H NMR (400 MHz)和13C NMR (100 MHz)数据(in CDCl3)aTable 1 1H NMR (400 MHz) and 13C NMR (100 MHz) data of compounds 1 and 2 (in CDCl3) |
| No. | 1 | 2 | |||
|---|---|---|---|---|---|
| δH | δC | δH | δC | ||
| 1α | 1.20~1.16, m | 38.0 | 1.76, dt (12.8, 5.2) | 39.6 | |
| 1β | 1.92~1.88, m | 1.05, dd (12.8, 11.3) | |||
| 2α | 1.75~1.71, m | 17.9 | 1.88~1.83, m | 18.9 | |
| 2β | 1.64, br d (12.5) | 1.51~1.46, m | |||
| 3α | 1.81~1.77, m | 37.1 | 2.17~2.14, m | 37.7 | |
| 3β | 1.77~1.73, m | 1.02~1.00, m | |||
| 4 | 46.1 | 43.7 | |||
| 5 | 2.14, dd (12.3, 4.0) | 44.5 | 1.21, dd (10.9, 5.4) | 56.6 | |
| 6α | 2.19~2.15, m | 26.5 | 1.93~1.88, m | 21.9 | |
| 6β | 2.06~2.01, m | 1.83~1.78, m | |||
| 7α | 5.96, br s | 132.5 | 1.91~1.88, m | 44.5 | |
| 7β | 1.36~1.33, m | ||||
| 8 | 135.6 | 74.0 | |||
| 9 | 1.99, dd (13.5, 7.0) | 50.1 | 1.10, t (3.8) | 60.9 | |
| 10 | 34.4 | 39.8 | |||
| 11α | 1.91~1.87, m | 21.4 | 1.62~1.57, m | 24.6 | |
| 11β | 1.18~1.13, m | 1.43~1.38, m | |||
| 12α | 2.72, dq (17.7, 2.2) | 23.6 | 2.38~2.34, m | 35.0 | |
| 12β | 1.90, dd (17.0, 13.4) | 2.27~2.21, m | |||
| 13 | 136.9 | 147.3 | |||
| 14 | 6.96, br s | 140.3 | 6.35, dd (17.6, 11.4) | 138.7 | |
| 15a | 199.1 | 5.30, d (17.6) | 113.5 | ||
| 15b | 5.07, d (11.4) | ||||
| 16 | 2.32, s | 25.2 | 5.01, s | 115.7 | |
| 17 | — | 1.18, s | 23.6 | ||
| 18 | 183.2 | 1.26, s | 28.9 | ||
| 19 | 1.29, s | 16.7 | 182.3 | ||
| 20 | 0.83, s | 13.9 | 0.72, s | 13.0 | |
a Assignments were made by a combination of 1D and 2D NMR experiments. |
化合物1的相对构型可通过分析NOESY谱确定. Me-19/H-2β, H-2β/Me-20, Me-20/H-11β之间明显的NOE相关表明Me-19, Me-20和H-11β处于同一平面, 定为β构型. 同时, H-5和H-9之间明显的NOE相关则表明H-5和H-9为α构型, 最终化合物1的相对构型确定如图3(a)所示. 其绝对构型可通过圆二色谱(Electronic circular dichroism, ECD)计算得到确定. 实测CD谱图中280 nm处显示出一个由n-π电子跃迁引起的负Cotton效应, 与(4R,5R,9R,10R)-1的计算ECD曲线相吻合(图3b). 综上, 化合物1的绝对构型可确定为4R,5R,9R,10R.
化合物2为白色粉末, 高分辨质谱显示该化合物准分子离子峰为319.2282 [M－H]－, 推测其分子式为C20H32O3. 该分子式表明化合物2的结构中有5个不饱和度. 分析其1H NMR数据, 可知2的结构中有3个单峰甲基信号(δ 1.18, s, Me-17; 1.26, s, Me-18; 0.72, s, Me-20), 5个烯氢质子信号[δH 6.35, dd, (17.6, 11.4), H- 14; 5.30, d, (17.6), H-15a; 5.07, d, (11.4), H-15b; 5.01, s, Me-16]. 根据烯氢质子的裂分情况, 推测2的结构中含有1个乙烯基与1个位于末端的双键. 其13C NMR谱显示有20个碳信号, 可归属为3个甲基碳, 7个亚甲基碳, 3个次甲基碳, 以及4个sp2杂化的碳原子(δ 147.3; 138.7; 113.5和115.7)和1个羧羰基碳(δ 182.3). 以上数据表明化合物2和毒马草属植物Sideritis varol中分离得到的半日花烷型二萜8-羟基-半日花-13(16),14-二烯(8- hydroxylabda-13(16),14-diene)非常相似[17], 两者不同之处在于C-4、C-18、C-19和C-20的化学位移有明显差异, C-4 (δC 43.7 vs. δC 47.4)、C-19 (δC 182.3 vs. δC 184.2)、C-18 (δC 28.9 vs. δC 16.3)、C-20 (δC 13.0 vs. δC 15.9). 然而, 由化合物2的二维NMR相关(COSY和HMBC)确定, 其平面结构与8-羟基-半日花-13(16),14-二烯一致(图4). 因此, 推测化合物2相对构型与8-羟基-半日花- 13(16),14-二烯有所不同.
通过与文献中质谱、核磁数据和比旋光对比, 22个已知化合物分别鉴定为: 反式松柏酸(E-communic acid, 3)[18], (12Z)-半日花-8(17),12,14-三烯-18-醛[(12Z)-labd-8(17),12,14-triene-18-al, 4][19], 弥罗松酚(ferruginol, 5)[20], 12-甲氧基-松香-8,11,13-三烯-12-酮(sugiol methyl ether, 6)[21], 齐墩果酸(oleanolic acid, 7)[22], 阿儒诺酸(arjunolic acid, 8)[23], 2α,20β-二羟基-乌苏酸(isoyarumic acid, 9)[24], 2α,3β-二羟基齐墩果-12-烯-28-酸(maslinic acid, 10)[25], 3β-3-羟基-1-氧代-齐墩果-12-烯-28-酸(virgatic acid, 11)[26], 常春藤皂苷元(hederagenin, 12)[27], 6,7-脱氢弥罗松酚(6,7-dehydroferruginol, 13)[28], 白桦脂酸(betulinic acid, 14)[29], 卡西普醇(cassipourol, 15)[30], 熊果酸(ursolic acid, 16)[31], 2α,3α,19α,23-四羟基-熊果-12-烯-28-酸(2α,3α,19α,23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid, 17)[32], 2α,19α-二羟基熊果酸(tormentic acid, 18)[33], 坡模酸(pomolic acid, 19)[34], 野鸦椿酸J (euscaphic acid J, 20)[35], 冬青苷A (ilexoside A, 21)[36], 3β-顺式-对香豆酰氧基-2α,23-二羟基-齐墩果酸(3-cis-p-coumaroyloxy-2,23-dihydroxyolean-12-en-28-oicacid, 22)[37].
一氧化氮(NO)被公认为病理反应中, 尤其是急性炎症过程中的关键介质和调节因子. 促炎因子如脂多糖(LPS)可通过激活诱导型一氧化氮合酶(iNOS), 显著促进巨噬细胞中NO的生成. 为进一步验证本研究所涉及化合物的抗炎活性, 本研究以LPS刺激的RAW264.7细胞为模型, 评估了以上分离得到的部分化合物(化合物7、8、16与18因为样品已变质未进行测试)的NO抑制作用. 如表2和图6所示, 化合物19和22在LPS刺激的RAW264.7细胞中均能显著抑制过量生成的NO, 其IC50值分别为11.3和19.1 μmol/L; 在20 μmol/L浓度下, 两者的细胞存活率分别为79.6%和82.1%, 均未表现出显著的细胞毒性. 作为阳性对照, 已知的高选择性iNOS抑制剂1400W (N-[3-(氨甲基)苄基]乙脒)[38]在同一细胞模型中的IC50值为0.4 μmol/L. 此外, 化合物19与所报道文献[39]中坡模酸(pomolic acid, IC50=26.2 μmol/L)基本一致; 化合物10和17的抗炎活性则分别与已有文献报道的山楂酸(masilinic acid)[40]、2α,3α,19α,23-四羟基-熊果-12-烯-28-酸(2α,3α,19α,23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid)[41]相当, 均未表现出显著的抗炎活性.
表2 部分化合物的LPS诱导RAW264.7细胞中NO抑制活 性aTable 2 Nitric oxide inhibitory activities of compounds |
| Compd. | NO inhibition/% | IC50b/(μmol•L－1) |
|---|---|---|
| 1 | 14.9±1.6 | >50 |
| 2 | 2.1±2.9 | >50 |
| 3 | 25.4±2.9 | >50 |
| 4 | 27.5±15.1 | >50 |
| 5 | 58.8±4.1 | >20 |
| 6 | 0.5±3.1 | >50 |
| 7 | N.T.d | N.T.d |
| 8 | N.T.d | N.T.d |
| 9 | 76.9±2.3 | >20 |
| 10 | 23.8±1.9 | >50 |
| 11 | 9.5±8.0 | >50 |
| 12 | 26.2±2.2 | >50 |
| 13 | 12.6±3.1 | >50 |
| 14 | 35.9±19.6 | >50 |
| 15 | 27.5±3.8 | >50 |
| 16 | N.T.d | N.T.d |
| 17 | 24.4±9.3 | >50 |
| 18 | N.T.d | N.T.d |
| 19 | 69.5±2.2 | 11.3±2.0 |
| 20 | 24.4±9.3 | >50 |
| 21 | 20.9±1.7 | >50 |
| 22 | 81.1±1.0 | 19.1±0.8 |
| 1400Wc | 86.9±1.8 | 0.4±0.01 |
a These data are expressed as the mean±SD of triplicate experiments. b The IC50 values were determined when the inhibition rates exceeded 50% at 20 μmol/L. c Positive control. d N.T.: not test. |
为了评估所得天然产物对肿瘤细胞的抑制作用, 本研究采用CCK-8法测定了其对不同肿瘤细胞系的增殖抑制活性. 化合物9在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中显示出一定的细胞增殖抑制活性, IC50值为(17.6 ±0.04) μmol/L. 相比之下, 阳性对照药物(五氟尿嘧啶, 5-FU)对同一细胞系的IC50值为(5.2±0.01) μmol/L. 化合物19在非小细胞肺癌A549细胞中的IC50值为(21.2±0.01) μmol/L, 与先前报道的细胞毒作用基本相当(17.2 μmol/L)[42], 阳性对照药物(五氟尿嘧啶, 5-FU)对同一细胞系的IC50值为(6.2±0.01) μmol/L. 另外, 文献中亦有关于化合物10[43-44]的相关报道, 同样未表现出细胞毒作用.
2 结论
本研究从中药山香圆叶90%甲醇提取物中分离并鉴定了两个新的二萜类化合物, 它们分别是C-17降碳型松香烷型二萜(1)以及新的半日花烷型二萜(2). 此外, 一系列萜类化合物均从该植物中分离得到, 进一步丰富了山香圆植物中的萜类化学成分多样性. 对以上得到的萜类化合物进行抗炎与细胞毒活性评价, 发现骨架3β-顺式-对香豆酰氧基-2α,23-二羟基-齐墩果酸(22)在LPS诱导RAW264.7细胞中表现出NO生成的抑制作用, IC50值为19.1 μmol/L. 此外, 骨架2α,20β-二羟基-乌苏酸(9)对人乳腺癌细胞MDA-MB-231表现出一定程度的细胞毒作用, IC50值为17.6 μmol/L. 本研究为中药山香圆叶的进一步药用开发提供了物质基础, 并为开发抗炎或抗肿瘤先导化合物提供重要的参考价值.
3 实验部分
3.1 仪器与试剂
比旋光度在Rudolf Autopol IV自动旋光仪上测定; 紫外光谱在日立U-2900E双光束分光光度计上记录; ECD光谱在JASCO-810圆二色光谱仪上记录; 红外光谱在Nicolet 5700傅立叶红外光谱仪测试; NMR谱在Bruker Avance III 400 MHz核磁共振波谱仪上获取, 化学位移以δ表示, 并参考残余溶剂信号; LC-PDA-ESI- MS在岛津LSMS-2020质谱仪上测定, 并配备SPD-M40光二极管阵列检测器(PDA); HRESIMS在AB SCIEX Triple TOF 5600质谱仪上测定; 半制备HPLC在Waters e2695系统上进行, 配备2998光二极管阵列检测器(PAD)、2424蒸发光散射检测器(ELSD), 使用ODS色谱柱(SunFire, 5 μm, 250 mm×10 mm; X-bridge, 5 μm, 250 mm×10 mm). 柱色谱(CC)使用硅胶(青岛海洋化工有限公司, 中国青岛)、MCI CHP20P胶(75~150 μm, 日本三菱化学工业株式会社, 东京, 日本)和Sephadex LH-20 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, 乌普萨拉, 瑞典). 薄层色谱(TLC)使用预涂硅胶板(GF254, 0.25 mm, 烟台江友硅胶发展有限公司, 中国烟台). 斑点通过紫外光(254 nm)照射可见, 并通过喷洒H₂SO4/EtOH (V∶V=0.15)溶液后加热至120 ℃进行显色.
3.2 植物来源
山香圆Turpinia arguta叶于2023年6月购自江西和泽生物科技有限公司. 该植物由江西和泽生物科技有限公司陈翔老师鉴定. 标本保存于台州学院药学院, 标本编号为No.20230623.
3.3 提取与分离
山香圆叶(2.56 kg)经粉碎后用体积分数为90%的甲醇室温冷浸, 在室温下每次使用2 L溶剂提取48 h. 过滤后, 在真空条件下除去溶剂, 得到粗提物(363.8 g), 然后将其悬浮于水(1 L)中, 并依次用石油醚(1 L×3)、乙酸乙酯(EtOAc, 1 L×4)和正丁醇(n-BuOH, 1 L×3)进行分配, 所得石油醚提取物(15.0 g)、乙酸乙酯提取物(90.0 g)以及正丁醇提取物(37.8 g). 所得石油醚提取物(15.0 g)经MCI胶柱色谱分离, 使用甲醇-水(V∶V=50∶50~100∶0)梯度洗脱, 得到5个组分(Fr.1~Fr.5), 每个组分进一步经半制备高效液相色谱(HPLC)纯化. 组分Fr.2 (1.5 g)经半制备型HPLC进一步分离, 用半制备型液相色谱(X-Bridge, MeOH-H2O, V∶V=90∶10, 3 mL/min)处理, 得到化合物3 (1.06 mg, tR=19.2 min)、5 (3.93 mg, tR=20.0 min)和13 (0.29 mg, tR=19.5 min). 组分Fr.3.B (0.2 g)经半制备型HPLC进一步分离, 用半制备型液相色谱(MeOH-H2O, V∶V=95∶5, 3 mL/min)处理, 得到化合物15 (8.06 mg, tR=16.7 min). 组分Fr.3.G (1.3 g)用半制备型液相色谱(MeOH-H2O, V∶V=91∶9, 3 mL/ min)处理, 得到化合物2 (0.73 mg, tR=11.8 min)、4 (1.68 mg, tR=15.2 min)以及组分Fr.3.G.2 (5.58 mg, tR=11.8 min). 组分Fr.3.G-2 (5.58 mg)再次使用半制备型液相色谱(MeCN-H2O, V∶V=83∶17, 3 mL/min)处理, 得到化合物6 (0.31 mg, tR=18.3 min)、14 (0.91 mg, tR=14.7 min)和1 (1.17 mg, tR=21.8 min).
将乙酸乙酯提取物(90.0 g)使用硅胶(100~200目)柱色谱, 并用石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱(V∶V=15∶1~1∶2)进行分离, 得到7个组分(Fr.1~Fr.7). Fr.2 (2.1 g)通过经MCI柱色谱(300 g, 18 cm×50 cm)分离、纯 MeOH洗脱、TLC检测合样, 进一步分离为5个组分Fr.2.1~Fr.2.5. Fr.2.2通过半制备HPLC分离、使用(MeOH-H2O, V∶V=84∶16, 3 mL/min)洗脱, 得到化合物7 (2.02 mg, tR=14.9 min)、16 (3.39 mg, tR=15.6 min); Fr.2.3通过半制备HPLC分离、使用(MeOH-H2O, V∶V=75∶25, 3 mL/min)洗脱, 得到化合物8 (1.33 mg, tR=16.5 min); Fr.2.4通过半制备HPLC分离、使用(MeCN- H2O, V∶V=52∶48, 3 mL/min)洗脱, 得到化合物17 (2.81 mg, tR=12.7 min)和18 (1.03 mg, tR=13.8 min). 组分Fr.3 (4.1 g)通过经MCI柱色谱(200 g, 8 cm×30 cm)分离、纯MeOH洗脱、TLC检测合样, 进一步分离为4个组分Fr.3.1~Fr.3.4. 随后Fr.3.2通过半制备HPLC分离、使用(MeOH-H2O, V∶V=79∶21, 3 mL/min)洗脱, 得到化合物19 (12.3 mg, tR=16.9 min); Fr.3.3通过半制备HPLC分离、使用(MeOH-H2O, V∶V=82∶18, 3 mL/ min)洗脱, 得到化合物20 (0.93 mg, tR=7.7 min). Fr.4 (1.5 g)通过经MCI柱色谱(300 g, 8 cm×50 cm)分离、纯MeOH洗脱、TLC检测合样, 进一步分离为4个组分Fr.4.1~Fr.4.4. Fr.4.3通过半制备HPLC分离、使用(MeOH-H2O, V∶V=88∶12, 3 mL/min)洗脱, 得到化合物9 (1.1 mg, tR=16.2 min)、10 (1.1 mg, tR=15.0 min)和11 (1.83 mg, tR=18.6 min). 组分Fr.5 (2.9 g)通过经MCI柱色谱(300 g, 8 cm×50 cm)分离、纯MeOH洗脱、TLC检测合样, 进一步分离为4个组分Fr.5.1~Fr.5.4. Fr.5.3通过半制备HPLC分离、使用(MeOH-H2O, V∶V=82∶18, 3 mL/min)洗脱, 得到化合物21 (1.33 mg, tR=11.2 min). 组分Fr.6 (9.7 g)通过经MCI柱色谱(300 g, 8 cm×50 cm)分离、纯MeOH洗脱、TLC检测合样, 进一步分离为7个组分Fr.5.1~Fr.5.7. Fr.6.3通过半制备HPLC分离洗脱得到化合物12 (1.11 mg, tR=16.6 min); Fr.6.5通过半制备HPLC分离洗脱得到化合物22 (1.57 mg, tR=17.3 min).
山香圆甲酸(1): 白色粉状物; $[\alpha]_{\mathrm{D}}^{20}$－16.7 (c 0.01, MeOH); UV (MeOH) λmax [log ε/(L•mol－1•cm－1)]: 240 (3.94) nm; ECD (c 2.3×10－3 mol/L, MeCN) λmax [Δε/(L•mol－1•cm－1)]: 280 (－15.7); IR (KBr) νmax: 3467 (br, νOH), 2926 (νCH₂), 1705 (νC=O), 1691 (νC=O), 1624 (νC=C), 1387 (νCH), 1249 (νCO), 1145 (νCO) cm－1; 1H NMR and 13C NMR see Table 1; HR-ESI-MS calcd for C19H26O3 [M＋Na]＋ 325.1776, found 325.1774.
山香圆乙酸(2): 白色粉状物; $[\alpha]_{\mathrm{D}}^{25}$＋10.2 (c 0.05, MeOH); UV (MeOH) λmax [log ε/(L•mol－1•cm－1)]: 204 (3.69) nm; ECD (c 1.6×10－3 mol/L, MeCN) λmax [Δε/(L• mol－1•cm－1)]: 220 (＋4.9); 1H NMR and 13C NMR see Table 1; HRSIMS calcd for C20H31O3 [M－H]－ 319.2273, found 319.2282.
3.4 ECD计算
化合物采用Merck分子力场(Merck Molecular Force Field, MMFF)进行构象搜索, 主要使用Spartan's软件和Maestro软件, 选择Boltzmann分布大于4%的优势构象进行构象优化. 采用B3LYP/6-31g水平对气体中的构象进行了初步优化, MeCN(实验用溶剂)用作极化连续介质模型(Polarizable continuum model, PCM)溶剂, 使用含时密度泛函理论(TDDFT)在B3LYP/6-31＋g(d,p)水平上对所有化合物的ECD进行了理论计算. ECD光谱是使用SpecDis 1.6 (Univer偶极长度旋转强度sigma=0.3 eV的高斯带形状生成.
辅助材料(Supporting Information) 已知无生物活性化合物的化学结构、抗炎与细胞毒活性测试的实验过程及参考文献、化合物1和2的核磁谱图数据、质谱数据以及化合物1的红外光谱数据. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.
(Lu, Y.)