二氧化硫及其衍生物, 如亚硫酸氢盐(${\text{HSO}}_{3}^{－}$)和亚硫酸盐(${\text{SO}}_{3}^{2－}$), 在工业应用和生物系统中都扮演着复杂而关键的角色[1-2]. 亚硫酸氢盐作为食品添加剂被广泛应用于多种加工食品和饮料中, 其抗氧化和抗菌作用有助于防止食品腐败, 延长保质期[3-6]. 然而, 过量摄入${\text{HSO}}_{3}^{－}$或其异常表达可能引发一系列严重的健康问题, 包括神经系统疾病、心血管疾病、呼吸系统疾病等[7-9]. 鉴于此, 世界卫生组织建议每日摄入量应控制在0.7 mg/kg以下, 以降低潜在的健康风险[10]. 因此, 监测生物体系和食品样品中${\text{HSO}}_{3}^{－}$的含量, 对于理解其生理作用, 确保食品安全至关重要[11-13].
传统的${\text{HSO}}_{3}^{－}$/${\text{SO}}_{3}^{2－}$检测方法因其操作复杂、耗时且样品预处理繁琐, 在应用上受到诸多限制[14-16]. 相比之下, 荧光分析技术凭借其高灵敏度、高特异性等特点, 已成为检测微量${\text{HSO}}_{3}^{－}$/${\text{SO}}_{3}^{2－}$的有效方法[17-19]. 在所开发的荧光开启型或淬灭型探针中[20-24], 近红外(NIR)荧光探针因其具有更强的组织穿透能力、更低的自发荧光背景干扰而备受关注[25-30]. 目前, 基于苯并吡喃开发的近红外荧光探针用于检测${\text{HSO}}_{3}^{－}$/${\text{SO}}_{3}^{2－}$已有部分报 道[7-8,25,31-34]. 不同探针在响应时间、检测限和应用范围上表现各异. 例如, Cui等[8]报道了一种利用荧光共振能量转移(FRET)机制识别${\text{HSO}}_{3}^{－}$/${\text{SO}}_{3}^{2－}$的NIR荧光探针, 其最大发射波长为760 nm, 并成功应用于细胞、斑马鱼及活体小鼠内的SO2成像. Zhang等[7]开发了一种以苯并噻唑和苯并吡喃衍生物为基础的NIR荧光探针, 其发射波长为768 nm. 该探针可检测冰糖中的${\text{HSO}}_{3}^{－}$, 也能对小鼠体内炎症过程中产生的${\text{HSO}}_{3}^{－}$成像. 部分探针虽响应迅速, 但其发射波长仍较短或检测限偏高; 一些探针虽检测限较低, 却存在响应时间长等局限. 因此, 开发近红外发射、检测限低、响应时间短等多个性能均衡的荧光探针, 已成为目前研究的热点问题.
我们课题组[35]前期基于苯并吡喃开发了一种发射波长为710 nm的近红外荧光探针, 对其应用做了广泛探究, 取得了较好结果. 如Scheme 1a所示, 为进一步优化该探针性能, 本研究通过在6-(二乙氨基)-1,2-二氢环戊烯[b]苯并吡喃上引入更强吸电子能力的三氰基呋喃基团, 合成的DCA-Tcf发射波长达到809 nm, 如此长的荧光发射在已报道的小分子荧光探针中是不多见的. 此外, 探针DCA-Tcf在响应时间、检测限、斯托克斯位移等方面都有了显著提升, 同时也成功应用于实际水样和糖样中${\text{HSO}}_{3}^{－}$的检测(Scheme 1b), 并可在活细胞中对${\text{HSO}}_{3}^{－}$进行荧光成像, 在食品安全检测和生物成像领域表现出潜在的应用价值.
1 结果与讨论
1.1 DCA-Tcf对${\text{HSO}}_{3}^{－}$的选择性和抗干扰性能研究
为考察DCA-Tcf对${\text{HSO}}_{3}^{－}$的选择性, 研究了其在多种阴离子及生物硫醇存在下的荧光响应. 如图1a所示, DCA-Tcf (10 μmol/L)在乙醇/磷酸盐缓冲溶液(EtOH/ PBS, V∶V=5∶5, pH=7.4)中于809 nm处荧光发射较强. 加入${\text{HSO}}_{3}^{－}$(500 μmol/L)后, 观察到显著的荧光淬灭, 而加入其他分析物对探针荧光强度的影响均较小, 表明DCA-Tcf对${\text{HSO}}_{3}^{－}$具有优异的专一性识别能力. 该探针具有119 nm的较大斯托克斯位移, 可有效减少激发光带来的背景干扰. 为评估DCA-Tcf的实际应用潜力, 进行了抗干扰实验. 图1b中DCA-Tcf (10 μmol/L)溶液加入500 μmol/L各种分析物后, 在809 nm处的荧光均较强(红色柱). 上述溶液中继续加入500 μmol/L ${\text{HSO}}_{3}^{－}$后荧光强度均显著降低(蓝色柱). 结果表明, 共存分析物存在下不会改变DCA-Tcf的荧光强度, 也不会干扰探针对${\text{HSO}}_{3}^{－}$的识别. 综上, DCA-Tcf在识别${\text{HSO}}_{3}^{－}$时表现出卓越的选择性与抗干扰能力.
图1 (a) DCA-Tcf (10 μmol/L)在EtOH/PBS (V∶V=5∶5, pH=7.4)体系中加入500 μmol/L不同分析物(Br－、I－、$\mathrm{NO}_{2}^{-}$、$\mathrm{CO}_{3}^{2-}$、$\mathrm{HCO}_{3}^{-} 、 \mathrm{CH}_{3} \mathrm{COO}^{-} 、 \mathrm{HPO}_{4}^{2-} 、 \mathrm{~S}^{2-} 、 \mathrm{PO}_{4}^{3-} 、 \mathrm{CN}^{-} 、 \mathrm{SCN}^{-} 、 \mathrm{PPi} 、 \mathrm{SO}_{4}^{2-} 、 \mathrm{HSO}_{3}^{-} 、 \mathrm{~N}_{3}^{-} 、 \mathrm{Hcy} 、 \mathrm{GSH} 、 \mathrm{Cys} $和$\mathrm{HSO}_{4}^{-}$)后的荧光光谱变化; (b)探针加入不同分析物后继续加入${\text{HSO}}_{3}^{－}$在809 nm处的荧光强度变化(λex=690 nm)Figure 1 (a) Fluorescence spectral changes of DCA-Tcf (10 μmol/L) in EtOH/PBS solution (V∶V=5∶5, pH=7.4) addition of various analytes (Br－, I－, $\mathrm{NO}_{2}^{-}$、$\mathrm{CO}_{3}^{2-}$、$\mathrm{HCO}_{3}^{-} 、 \mathrm{CH}_{3} \mathrm{COO}^{-} 、 \mathrm{HPO}_{4}^{2-} 、 \mathrm{~S}^{2-} 、 \mathrm{PO}_{4}^{3-} 、 \mathrm{CN}^{-} 、 \mathrm{SCN}^{-} 、 \mathrm{PPi} 、 \mathrm{SO}_{4}^{2-} 、 \mathrm{HSO}_{3}^{-} 、 \mathrm{~N}_{3}^{-} 、 \mathrm{Hcy} 、 \mathrm{GSH} 、 \mathrm{Cys} $ and $\mathrm{HSO}_{4}^{-}$, 500 μmol/L); (b) Fluorescence intensity changes at 809 nm of DCA-Tcf (10 μmol/L) solution addition of various analytes and further adding ${\text{HSO}}_{3}^{－}$ (λex=690 nm) |
1.2 DCA-Tcf检测${\text{HSO}}_{3}^{－}$的影响因素
为验证DCA-Tcf的检测性能, 完成了荧光滴定实验. 如图2a所示, 随着${\text{HSO}}_{3}^{－}$浓度从0 μmol/L增至500 μmol/L, 探针在809 nm处的荧光强度逐渐减弱, 继续增加${\text{HSO}}_{3}^{－}$浓度则未观察到荧光强度的显著变化. 数据显示, 在1~10 μmol/L ${\text{HSO}}_{3}^{－}$浓度范围内, 探针荧光强度与${\text{HSO}}_{3}^{－}$浓度呈现良好的线性关系(R2>0.99), 计算得检测限为0.509 μmol/L. 此外, 荧光响应时间实验表明, 探针加入500 μmol/L ${\text{HSO}}_{3}^{－}$后, 约在40 s达到稳定(图2b), 说明探针具有快速响应性能. 为了考察探针的实用性, 探究了pH对DCA-Tcf识别${\text{HSO}}_{3}^{－}$的影响, DCA- Tcf自身在pH为3~11范围内均能保持较强的荧光发射, 显示出良好的荧光稳定性. 当体系中加入${\text{HSO}}_{3}^{－}$后, DCA-Tcf的荧光在pH为7~11范围内表现出显著的降低, 表明探针在中性和弱碱性条件下可有效识别${\text{HSO}}_{3}^{－}$, 结果也表明DCA-Tcf能够在维持细胞正常生理状态的pH条件下有效检测${\text{HSO}}_{3}^{－}$, 为其应用于活细胞内${\text{HSO}}_{3}^{－}$的荧光成像提供了基础.
图2 (a) DCA-Tcf (10 μmol/L)的EtOH/PBS (V∶V=5∶5, pH=7.4)溶液随${\text{HSO}}_{3}^{－}$浓度增加(0~500 μmol/L)的荧光光谱变化; (b)加入500 μmol/L ${\text{HSO}}_{3}^{－}$后DCA-Tcf溶液在809 nm处的荧光强度随时间变化曲线(λex=690 nm)Figure 2 (a) Fluorescence spectral changes of DCA-Tcf (10 μmol/L) in EtOH/PBS solution (V∶V=5∶5, pH=7.4) upon the addition of varying concentrations of ${\text{HSO}}_{3}^{－}$ (0~500 μmol/L); (b) Time-dependent fluorescence intensity curve of DCA-Tcf solution at 809 nm after the addition of 500 μmol/L ${\text{HSO}}_{3}^{－}$ (λex=690 nm) |
1.3 DCA-Tcf识别${\text{HSO}}_{3}^{－}$的机理
基于探针识别${\text{HSO}}_{3}^{－}$后褪色和荧光猝灭, 推测${\text{HSO}}_{3}^{－}$与探针DCA-Tcf发生了亲核加成反应(图3a). 强吸电子基三氰基呋喃基团的引入活化了与其相连的C=C双键, 而具有亲核性能的${\text{HSO}}_{3}^{－}$与该双键反应破坏了探针分子的π共轭体系, 进而导致识别后探针溶液褪色和荧光猝灭. 利用高分辨质谱(HRMS)测得的质核比(701.4814)与推测生成加合物计算的理论值高度吻合, 有力地支持了我们的猜想, 也与我们[35]之前报道的相似结构荧光探针的结果一致. 三氰基呋喃的引入不仅明显延长的发射波长, 同时使反应速度、斯托克斯位移以及检测限都有大幅度提升, 可见, 构建这种供体-π-受体结构的探针分子时, 改变受体的吸电子能力是调控探针发射性能的有效手段之一.
图3 (a) DCA-Tcf对${\text{HSO}}_{3}^{－}$的识别机制; (b) DCA-Tcf及DCA-Tcf-${\text{HSO}}_{3}^{－}$在S1态下的优化构型及前沿分子轨道电子跃迁示意图Figure 3 (a) Recognition mechanism of DCA-Tcf for ${\text{HSO}}_{3}^{－}$; (b) Optimized configurations and schematic diagrams of the frontier molecular orbital electronic transitions of DCA-Tcf and DCA-Tcf-${\text{HSO}}_{3}^{－}$ in the S1 state |
为了探究探针识别${\text{HSO}}_{3}^{－}$前后为什么会发生明显荧光变化, 利用密度泛函理论(DFT)和时间依赖密度泛函理论(TD-DFT)方法, 基于CAM-B3LYP/TZVP算法, 分别优化了DCA-Tcf及其加成产物DCA-Tcf-${\text{HSO}}_{3}^{－}$在基态(S0)和激发态(S1)的几何构型, 以及相应的前沿分子轨道(FMO)跃迁模式. 如图3b所示, 探针DCA-Tcf分子整体呈现共平面, 其最低未占据分子轨道(LUMO)和最高占据分子轨道(HOMO)上的电子均分布在分子骨架中心局域, 并呈现部分分子内电荷转移(ICT)特性. 因此, 激发态电子可通过LUMO至HOMO的辐射衰减过程直接返回HOMO轨道, 进而引发荧光发射. 然而, DCA-Tcf-${\text{HSO}}_{3}^{－}$在S1态的FMO跃迁模式与DCA-Tcf显著不同. 在DCA-Tcf-${\text{HSO}}_{3}^{－}$中, HOMO轨道上的电子云主要集中在苯并吡喃环, 而LUMO轨道上电子云主要集中在三氰基呋喃部分. 激发态下电子从LUMO向HOMO跃迁, 伴随着电子从三氰基呋喃单元向苯并吡喃环的完全电荷转移，即光诱导电子转移(PET)过程. 该过程为非辐射跃迁提供了有效途径，最终导致荧光猝灭. 由此可知, 探针本身通过ICT机制产生荧光, 而与${\text{HSO}}_{3}^{－}$形成加成物后, 则通过PET机制使荧光猝灭. 该机制的阐释对深入理解探针发光特性具有一定的指导意义.
1.4 DCA-Tcf在食品样品和实际水样中检测${\text{HSO}}_{3}^{－}$
鉴于${\text{HSO}}_{3}^{－}$作为抗氧化剂和防腐剂在食品中的广泛应用以及在环境中的残留, 为评估荧光探针DCA-Tcf用于实际样品中${\text{HSO}}_{3}^{－}$浓度检测的实用性, 选取了两种市售白砂糖和环境水样作为样本, 考察了DCA-Tcf检测${\text{HSO}}_{3}^{－}$浓度的性能. 检测结果如表1所示, 白砂糖样品中${\text{HSO}}_{3}^{－}$的加标回收率范围为97.6%~103.83%. 这一回收率区间表明, 该探针能够以误差较小的精度实现对食品样品中${\text{HSO}}_{3}^{－}$浓度的准确检测. 同时, 采用标准加入法对三种实际水样测得的回收率范围为98.81%~107.17%, 也证明该探针可准确检测环境水样中的${\text{HSO}}_{3}^{－}$浓度. 可见, 该探针可用于食品样品和环境领域中${\text{HSO}}_{3}^{－}$的高灵敏、特异性检测, 具有良好的可靠性与有效性.
表1 DCA-Tcf检测白砂糖、自来水、湖水和河水中${\text{HSO}}_{3}^{－}$浓度的结果aTable 1 Results of DCA-Tcf detection of ${\text{HSO}}_{3}^{－}$ concentration in white sugar, tap water, lake water, and river water |
| Sample | c/(μmol•L－1) | Recovery/% | RSD/% (n=3) | |
|---|---|---|---|---|
| Added | Found | |||
| Granulated sugar 1 | 5 | 5.12 | 102.41 | 0.18 |
| 6 | 6.09 | 101.50 | 0.06 | |
| 7 | 6.97 | 99.57 | 0.08 | |
| Granulated sugar 2 | 5 | 4.88 | 97.60 | 0.09 |
| 6 | 6.23 | 103.83 | 0.09 | |
| 7 | 7.19 | 102.71 | 0.15 | |
| Tap water | 5 | 5.23 | 104.58 | 0.23 |
| 6 | 6.43 | 107.17 | 0.40 | |
| 7 | 7.19 | 102.67 | 0.31 | |
| Lake water | 5 | 4.94 | 98.81 | 0.30 |
| 6 | 6.09 | 101.55 | 0.45 | |
| 7 | 7.14 | 101.97 | 0.15 | |
| River water | 5 | 5.22 | 104.40 | 0.39 |
| 6 | 6.14 | 102.27 | 0.18 | |
| 7 | 6.95 | 99.31 | 0.13 | |
a Data are representative of three independent experiments. |
1.5 DCA-Tcf对活细胞中${\text{HSO}}_{3}^{－}$成像
基于上述光学研究结果, 进一步探索了DCA-Tcf用于活细胞内对${\text{HSO}}_{3}^{－}$的检测潜力. 首先, 利用CCK-8法评估了DCA-Tcf对细胞活力的影响. 结果显示, DCA-Tcf即使在高达50 μmol/L的浓度下, MCF-7细胞存活率仍保持在97%以上, 说明探针本身几乎无毒. 为进一步开展活细胞荧光成像实验, 将MCF-7细胞与10 μmol/L的DCA-Tcf在37 ℃孵育30 min, 在暗场下可看到清晰的细胞轮廓及明亮的红色荧光. 随后, 探针溶液中分别加入不同浓度的${\text{HSO}}_{3}^{－}$ (10、50、100和500 μmol/L)并继续孵育30 min, 可发现, 随着${\text{HSO}}_{3}^{－}$浓度的增加, 细胞内红色荧光明显减弱(图4e, 4h, 4k, 4n). 荧光半定量统计结果表明, 细胞的荧光强度随${\text{HSO}}_{3}^{－}$浓度的增加(0~500 μmol/L)呈现显著下降, 进一步表明荧光强度与${\text{HSO}}_{3}^{－}$呈现剂量依赖性衰减. 细胞成像实验证实该探针具有良好的生物相容性, 荧光信号强度与${\text{HSO}}_{3}^{－}$浓度之间呈现显著的负相关, 进一步验证了该探针在实时监测活细胞内${\text{HSO}}_{3}^{－}$动态变化方面的高灵敏度与可靠性. 同时, 近红外红色发射对于深入研究${\text{HSO}}_{3}^{－}$的生物学功能更具有优势.
图4 MCF-7细胞在37 ℃下加入DCA-Tcf (10 μmol/L), 再加入不同浓度${\text{HSO}}_{3}^{－}$孵育后的荧光图Figure 4 Fluorescence images of MCF-7 cells incubated with DCA-Tcf (10 μmol/L) and various concentrations of ${\text{HSO}}_{3}^{－}$at 37 ℃ Bright-field (a, d, g, j, m), dark-field (b, e, h, k, n), and overlay images (c, f, i, l, o). |
2 结论
开发了一种近红外荧光探针DCA-Tcf, 实现了对${\text{HSO}}_{3}^{－}$/${\text{SO}}_{3}^{2－}$的快速检测. 探针的最大发射波长位于809 nm, 兼具高灵敏度、快速响应及大斯托克斯位移等优势. DCA-Tcf的实际应用潜力已在水样与糖样等真实样品检测中得到验证. 同时, 该探针具有良好的生物相容性, 可实现活细胞中${\text{HSO}}_{3}^{－}$/${\text{SO}}_{3}^{2－}$的荧光成像, 进一步拓展了其生物应用潜力. 该研究为食品安全与生物医学领域提供了一类新型高效的分析检测工具.
3 实验部分
3.1 仪器与试剂
循环水式多用真空泵(SHB-IIIS, 郑州长城科工贸有限公司), 电子天平(JY12001, 赛多利斯科学仪器有限公司), 玻璃仪器气流烘干器(C型, 上海析牛莱伯仪器有限公司), 恒温加热磁力搅拌器(CL-2, 郑州长城科工贸有限公司), 数字熔点仪(WRS-1B, 上海优浦科学仪器有限公司), 旋转蒸发仪(R-1001VN, 郑州长城科工贸有限公司), 移液器(德国艾本德股份公司), 酸度计(S-25B, 上海大埔仪器有限公司), 400 MHz核磁共振仪(美国Agilent仪器公司), 荧光分光光度计(FL-4700, 日本日立高新技术科学那柯事业所), 紫外分光光度计(U-T1810DS, 屹谱仪器制造有限公司). 三溴化磷、环戊酮、碳酸铯、4-二乙氨基水杨醛、丙二腈、3-羟基-3-甲基-2-丁酮等均购买于安耐吉试剂公司, 不用纯化直接使用, 实验用水为去离子水. 白糖购自锦州超市.
3.2 DCA-Tcf的合成
称量269 mg 6-(二乙氨基)-1,2-二氢环戊[b]色烯-3-甲醛(1 mmol)溶解于干燥的无水乙醇(10 mL)中, 将三氰基呋喃(398 mg, 2 mmol)溶于5 mL干燥无水乙醇, 将两种溶液混合, 滴入0.5 mL哌啶, 回流加热. 薄层色谱跟踪反应进程, 当溶液由橙黄色变为黄绿色后停止反应, 冷却, 有黄绿色固体析出. 过滤, 固体用乙醇重结晶得到DCA-Tcf (454 mg, 82%). m.p. 280.4~282.8 ℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.97 (d, J=13.7 Hz, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.44 (d, J=8.6 Hz, 1H), 6.86 (d, J=8.6 Hz, 1H), 6.63 (s, 1H), 5.85 (d, J=11.4 Hz, 1H), 3.52~3.44 (m, 4H), 2.89 (s, 2H), 2.79 (s, 2H), 1.67 (s, 6H), 1.15 (t, J=6.3 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 172.9, 165.9, 157.3, 155.2, 150.8, 144.2, 133.8, 133.4, 130.5, 129.5, 115.5, 113.7, 112.6, 111.2, 110.5, 102.7, 97.7, 50.1, 44.5, 27.8, 24.5, 12.9; HRMS (ESI＋) calcd for C28H26N4- NaO2 [M＋Na]＋ 473.1948, found 473.1977.
3.3 糖样的处理与制备
将0.5g白糖用EtOH/PBS (V∶V=5∶5, pH=7.4)溶液10 mL溶解, 加入250 μL探针后定容于25 mL容量瓶中即为测试液. 然后, 向食品样品中添加相同体积不同浓度的${\text{HSO}}_{3}^{－}$, 并记录809 nm处的发射强度. 测试液中DCA-Tcf浓度均为10 μmol/L.
3.4 实际水样的处理与制备
采集锦州市女儿河水、渤海大学听林湖水和实验室自来水, 以评估DCA-Tcf在实际水样中的检测效果. 水样过滤除去可见悬浮物, 澄清水样用于配制50 mmol的${\text{HSO}}_{3}^{－}$溶液和PBS缓冲溶液. 用上述PBS缓冲溶液配制EtOH/PBS (V∶V=5∶5, pH=7.4)溶液, 再加入250 μL探针并定容于25 mL容量瓶中, 即为测试液. 然后, 向实际水样中添加相同体积不同浓度的${\text{HSO}}_{3}^{－}$, 并记录809 nm处的发射强度. 测试液中DCA-Tcf浓度均为10 μmol/L.
辅助材料(Supporting Information) 探针DCA-Tcf的合成方法、表征数据(核磁氢谱、核磁碳谱和高分辨质谱), DCA-Tcf的细胞毒性数据及识别部分光谱数据等. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.
(Cheng, F.)