1 引言
细胞外基质(ECM)中复杂的生化和生物物理信号共同调控着从胚胎发育到组织再生乃至疾病发生发展的过程[1-3]. 尽管长期以来细胞因子与生长因子等化学信号被认为是指导正常生理和病理过程的关键因素, 但越来越多的证据表明, ECM的力学特性也会对这些过程产生重大影响[4-5]. 已有研究表明, 基质的黏弹性特性能够显著影响细胞的黏附[6]、迁移[7]、增殖[8]以及干细胞命运[9]. 值得注意的是, ECM的力学特性不仅在不同组织间存在显著差异, 在同一组织内部也呈现出明显的空间异质性. 这种力学梯度的存在为细胞提供了重要的微环境线索, 引导其在局部组织中的特异性行为. 例如, 损伤后的组织硬化过程会产生远离伤口部位的刚度梯度, 这能够促进成纤维细胞的募集从而促进组织修复[10]. 肿瘤微环境中ECM刚度的增加与癌症细胞侵袭性的增加密切相关[11]. 此外, 某些生理性组织(如骨-肌腱连接处)也存在天然的ECM力学梯度[12-13], 这种精妙的力学分布对于维持组织的结构和功能至关重要.
为了探究空间基质黏弹性变化对局部细胞行为的调控机制, 已经开发了多种体外构建黏弹性梯度水凝胶的体系. 例如, 基于扩散的制备系统[14], 使用梯度或滑动光掩模的受控紫外光聚合[15-16], 微流控梯度制备装置[17], 在软基片中嵌入刚性基片的方法[18]以及不同前体溶液组成的微凝胶组装法[19]. 然而, 现有的大多数方法存在一定的局限性, 如操作流程复杂、重复性欠佳, 且大多仅适用于特定类型的水凝胶交联体系[20-21]. 其中, 基于光掩膜的技术虽因其操作简便而受到广泛关注, 但该方法难以实现大范围的黏弹性梯度调控, 并且残留在水凝胶内部的光引发剂存在潜在的细胞毒性问题[22]. 因此, 有必要开发一种生物相容、适用性广泛, 同时具有精确的梯度调控能力的梯度水凝胶制备策略, 为深入研究细胞-ECM力学相互作用提供更可靠的技术平台.
希夫碱反应因具有良好的生物相容性、温和的反应条件以及易于调控的动态性等优势被广泛应用于黏弹性水凝胶的构建[23-27]. 透明质酸(HA)是一种天然存在于人体组织中的多糖, 具有良好的生物相容性[28-29]. gelatin作为胶原蛋白的水解产物, 其结构与ECM高度相似, 同时明胶分子中含有的细胞结合位点(RGD序列)能够有效促进细胞黏附[30]. 基于这些特性, 透明质酸和明胶成为构建黏弹性梯度水凝胶的理想原料. 氧化透明质酸(oxi-HA)是透明质酸经高碘酸钠(NaIO4)氧化后的产物, 其骨架上的醛基能够与明胶分子上的氨基形成亚胺键交联从而形成水凝胶(oHG). 通过对水凝胶化学组成的精确调节, 可以控制亚胺键的形成数量, 从而实现对水凝胶交联密度的有效调控, 这一调控机制为构建梯度黏弹性水凝胶提供了可能性.
在这里, 我们开发了一种基于可编程注射泵系统(PSPS)的黏弹性梯度水凝胶制备平台. 该系统主要由三个独立控制的注射单元、精密设计的流体汇流连接器和数控中心模块组成. 通过实时调节不同注射单元中水凝胶前体溶液的流速, 可以便捷地制备梯度黏弹性水凝胶(GoHG). 利用该PSPS平台, 我们制备了600 μm×300 μm规格的具有连续黏弹性梯度水凝胶, 并证明该黏性梯度水凝胶的刚度与应力松弛梯度具有100 μm的空间分辨率. 水凝胶表现出了良好的细胞相容性, 此外, 附着于梯度黏弹性水凝胶表面不同力学区域中的小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH-3T3)和小鼠成肌细胞系(C2C12)均表现出了显著的铺展行为差异. 该方法为体外研究细胞-ECM相互作用机制提供了新的技术手段, 在组织工程和再生医学领域具有重要的应用价值.
2 结果与讨论
2.1 天然聚合物改性及oHG水凝胶黏弹性调控
首先, 根据先前报道的方法[31-32], 使用NaIO4对分子量为90 kDa的HA进行了氧化, 并评估了oxi-HA的氧化度(OD). 不同于HA的吸收曲线, oxi-HA的吸收曲线在λmax (325 nm)处的吸收值出现了明显的降低, 这代表着对HA的成功氧化(支持信息, 图S1). 将HA与oxi-HA在325 nm处的吸收值带入至图2a的标准曲线中, 通过公式可计算得到oxi-HA的修饰率为57.0%. 由傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析可知(图2b), 1621, 1415 cm－1处的峰代表着聚合物链段中羧酸盐离子(—COO－)的反对称伸缩振动和对称伸缩振动, 1045 cm－1处为C—O—C的伸缩振动吸收峰. 相比于HA的红外吸收曲线, oxi-HA的红外吸收曲线中1726 cm－1处出现的新的吸收峰为醛基(—C=O)的伸缩振动吸收峰. 此外, FT-IR分析证实了oHG水凝胶的成功形成, 其中位于1646和1544 cm－1特征峰, 证实了oxi-HA中的醛基(—CHO)和明胶的氨基(—NH2)之间通过交联形成的C=N键.
图2 (a) t-BC (0~30 mmol/L)和TNBS (0.1% V/V)的标准曲线. (b) HA, oxi-HA和oHG水凝胶的FT-IR图谱. (c) oHG水凝胶的储存模量(每组n=3)的流变测试(strain=0.1%). (d) oHG水凝胶的应力松弛时间(每组n=3)的流变测试(strain=0.08%)Figure 2 (a) The standard calibration curve of t-BC (0~30 mmol/L) and TNBS (0.1% V/V). (b) FT-IR spectra of HA, oxi-HA and oHG hydrogels. (c) Rheological test of storage modulus (n=3 for each group) of oHG hydrogels (strain=0.1%). (d) Rheological test of stress relaxation time (n=3 for each group) of oHG hydrogels (strain=0.08%) |
通过固定gelatin的流速和设置不同的PBS与oxi-HA的流速, 利用PSPS装置制备了六组不同组分的oHG水凝胶(具体参数如表1所示), 其中oHG1有着最小的oxi-HA浓度, 而oHG6有着最大的oxi-HA浓度. 接着, 通过流变分析对水凝胶的黏弹性进行了详细表征. oHG水凝胶的线性黏弹区应变范围为0.01%~10%, 因此选择该范围内的应变值作为参数对刚度与应力松弛时间进行测试(支持信息, 图S2). 结果表明, oHG1有着最小的刚度(G'=227 Pa)和最快的应力松弛时间(τ1/2=33 s), oHG6的刚度最大, 为1973 Pa, 应力松弛时间最慢, 为193 s. 同时, 随着oHG水凝胶内oxi-HA含量的增加, oHG水凝胶的刚度与应力松弛时间均增加(图2c和2d)(支持信息, 图S3和图S4). 这是因为在固定gelatin浓度的条件下, oxi-HA含量的增加使oHG水凝胶内部形成了更多的亚胺键, 导致oHG水凝胶交联密度的增加, 从而赋予了水凝胶更高的刚度和更慢的应力松弛特性.
表1 oHG水凝胶的制备参数aTable 1 Process parameters for oHG hydrogels |
| woxi-HA/% | wgelatin /% | νoxi-HA/ (mL•min－1) | νPBS/ (mL•min－1) | νgelatin / (mL•min－1) | |
|---|---|---|---|---|---|
| oHG1 | 20.0 | 10.0 | 0.05 | 0.55 | 0.60 |
| oHG2 | 20.0 | 10.0 | 0.10 | 0.50 | 0.60 |
| oHG3 | 20.0 | 10.0 | 0.15 | 0.45 | 0.60 |
| oHG4 | 20.0 | 10.0 | 0.20 | 0.40 | 0.60 |
| oHG5 | 20.0 | 10.0 | 0.25 | 0.35 | 0.60 |
| oHG6 | 20.0 | 10.0 | 0.30 | 0.30 | 0.60 |
a Where w represents the mass fraction of the solution, and ν represents the flow rate of the solution. |
接着通过溶胀实验评估了oHG水凝胶的溶胀动力学(支持信息, 图S5). 在杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified eagle medium, DMEM)中浸泡24 h后, 所有组别的oHG水凝胶均达到溶胀平衡, 且具有更高刚度的水凝胶呈现出更小的溶胀比, 这表明高交联密度网络对溶剂渗透具有更强的抵抗能力. 同时, 进一步表征了达到溶胀平衡后oHG水凝胶的黏弹性(支持信息, 图S6和图S7). 结果表明, 溶胀导致了oHG水凝胶刚度与应力松弛时间的轻微降低. 这是由于溶胀降低了水凝胶的交联密度, 从而使水凝胶表现出更低的刚度. 同时为聚合物链段的运动提供了更多的空间, 从而降低了水凝胶的应力松弛时间. 值得注意的是溶胀后不同组分的水凝胶仍保留有刚度与应力松弛时间上的差异, 这为后续的细胞行为响应研究提供了关键的实验基础.
2.2 GoHG水凝胶的制备与黏弹性梯度表征
在成功调控了oHG水凝胶的黏弹性后, 利用PSPS装置, 在单个水凝胶内制造了高分辨的黏弹性梯度. 具体而言, 根据表1中的oHG水凝胶制备参数, 通过数控中心将20.0%质量分数的oxi-HA溶液的流速设置为0.05至0.30 mL/min的递增模式, 将PBS缓冲溶液的流速设置为0.55至0.30 mL/min的递减模式, 而10.0%质量分数的gelatin溶液的流速始终固定为0.60 mL/min, 从而在保证总注射体积不变的情况下, 改变oHG的化学组成和黏弹性. 根据这一策略, 我们利用PSPS装置制备了规格为600 μm×300 μm且在水平方向上具备黏弹性梯度的水凝胶(图3a), 并通过纳米压痕技术对其黏弹性梯度进行了表征(由于纳米压痕仪与流变仪不同的应力松弛测试机制, 两种方法测得的τ1/2不同). 由图3b和3c可知, 梯度黏弹性水凝胶GoHG在水平方向上具有连续的刚度梯度与应力松弛时间梯度, 其有效杨氏模量(Eff. Y. mod)和τ1/2具有100 μm的空间分辨率, 其中, Eff. Y. mod从19 kPa增加至47 kPa, τ1/2从6 s增加至62 s. 而在垂直方向上, 水凝胶的黏弹性具有稳定性, 其Eff. Y. mod和τ1/2表现出相似的数值. 重要的是, 在我们的制造过程中, 严格保持了恒定的明胶浓度, 有效减轻了通过整合素结合的配体(如RGD)对细胞行为的任何潜在影响.
图3 GoHG水凝胶的黏弹性梯度的表征. (a) GoHG水凝胶的实物图. (b) GoHG水凝胶刚度梯度的纳米压痕表征. (c) GoHG水凝胶应力松弛梯度的纳米压痕表征Figure 3 Characterization of the viscoelastic gradient of GoHG hydrogel. (a) Picture of GoHG hydrogel. (b) Nanoindentation characterization of stiffness gradient of GoHG hydrogel. (c) Nanoindentation characterization of stress relaxation gradient of GoHG hydrogel |
2.3 oHG水凝胶黏弹性变化影响细胞行为
2.3.1 oHG水凝胶的生物相容性
应用于细胞行为研究的梯度水凝胶材料应具备良好的生物相容性. 在这项研究中, 对NIH-3T3和C2C12进行了体外细胞实验, 以初步评估不同黏弹性的oHG水凝胶的生物相容性. 结果表明, 接种至oHG水凝胶表面的NIH-3T3细胞(图4a)和C2C12细胞(图4b)在赋予72 h后细胞活力均保持在95%以上, 这表明, oHG水凝胶对细胞生长无明显的抑制作用, 是一种生物相容的水凝胶材料. 接着我们将NIH-3T3细胞和C2C12细胞分别接种至具有连续黏弹性梯度的GoHG水凝胶上并培养72 h. 活/死细胞染色结果表明, 在GoHG水凝胶表面和对照组DMEM中培养的NIH-3T3细胞(图4c)和C2C12细胞(图4d)均具有良好的细胞活力, 没有观察到明显的细胞死亡现象.
图4 oHG水凝胶的生物相容性. (a) NIH-3T3细胞和(b) C2C12细胞暴露于oHG水凝胶提取物72 h后的细胞存活率. 活/死细胞染色检测培养在DMEM和GoHG水凝胶中的(c) NIH-3T3细胞和(d) C2C12细胞的活性. 比例尺为100 μm. 绿色: 活细胞. 红色: 死细胞Figure 4 Biocompatibility of oHG hydrogel. Cell viability of (a) NIH-3T3 cells and (b) C2C12 cells exposed to oHG hydrogel extract for 72 h. Live/dead cells detected to show the viability of (c) NIH-3T3 cells and (d) C2C12 cells cultured in DMEM and GoHG hydrogel. Scale bar=100 μm. Green: live cells. Red: dead cells |
2.3.2 oHG黏弹性影响细胞铺展行为
细胞通过整合素结合配体与细胞外基质相互作用, 并感知基质的力学环境从而指导自身的生命行为. 在这里, 我们探究了处于不同黏弹性环境中的NIH-3T3细胞和C2C12细胞的铺展行为, 以评估基质黏弹性对细胞行为的指导作用. 我们将NIH-3T3细胞和C2C12细胞分别接种至GoHG水凝胶中, 经过48 h的孵育, 待细胞完全铺展后对处于GoHG水凝胶不同黏弹性区域中的NIH-3T3细胞和C2C12细胞的细胞圆度(Circularity)和铺展面积进行了定量分析. 通过对细胞圆度的定量分析结果可知, 不同黏弹性区域中的NIH-3T3细胞和C2C12细胞的细胞圆度均没有表现出显著性差异(图5a和5b), 这表明基质黏弹性的不同在细胞铺展48 h时的时间节点并不会对细胞的铺展程度产生明显影响. 有趣的是,对细胞铺展面积的定量分析结果表明, NIH-3T3细胞在oHG4黏弹性区域有着最大的铺展面积, 而处于oHG3黏弹性区域中的C2C12细胞表现出最大的铺展面积. 这一结果代表着处于oHG4黏弹性区域中的NIH-3T3细胞和处于oHG3黏弹性区域中的C2C12细胞与水凝胶基质有着最大的细胞-ECM相互作用, 并且, 由于细胞类型的不同, NIH-3T3细胞和C2C12细胞对基质的力学环境的感知程度表现出差异.
图5 NIH-3T3细胞和C2C12细胞在不同黏弹性环境中的铺展行为. (a) NIH-3T3细胞和(b) C2C12细胞在GoHG水凝胶中培养48 h的细胞圆度定量分析. 数据分析采用普通单因素方差分析: ns, 不显著; n=15个细胞. (c) NIH-3T3细胞和(d) C2C12细胞在GoHG水凝胶中培养48 h的铺展面积定量分析. 数据分析采用普通单因素方差分析: ns, 不显著, *p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001; n=15个细胞Figure 5 Spreading behavior of NIH-3T3 cells and C2C12 cells in different viscoelastic environments. Quantitative analysis of (a) NIH-3T3 cells and (b) C2C12 cells circularity at 48 h culture in GoHG hydrogel. Ordinary one-way ANOVA was used for analysis of the data: ns, not significant; n=15 cells. Quantitative analysis of (c) NIH-3T3 cells and (d) C2C12 cells spreading area at 48 h culture in GoHG hydrogel. Ordinary one-way ANOVA was used for analysis of the data: ns, not significant, *p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001; n=15 cells |
3 结论
本研究设计了一种新型可编程注射泵系统用于精确制备具有空间连续黏弹性梯度且生物相容性良好的水凝胶. 水凝胶的机械性能主要来源于oxi-HA与gelatin聚合物链段间形成的动态亚胺键, 这种交联网络赋予材料优异的机械强度和可控的应力松弛特性, 同时, 聚合物链段的动态缠结/解缠结以及氢键的可逆形成/断裂机制显著提高了水凝胶的能量耗散能力. 值得注意的是, 通过简单调节水凝胶的化学组分比例, 即可实现对材料黏弹性的精确调控. 基于PSPS系统的多通道精确控制功能, 我们成功制备了600 μm×300 μm规格的梯度黏弹性水凝胶GoHG. 体外细胞实验表明, 水凝胶对NIH-3T3细胞和C2C12细胞均表现出良好的生物相容性. 且两种细胞在梯度水凝胶GoHG中的铺展行为表现出不同的黏弹性趋向性, NIH-3T3细胞和C2C12细胞分别在特定的黏弹性区域展现出最大铺展面积. 本研究设计的基于PSPS的梯度水凝胶制备策略, 因其操作简便、参数可控性强等特点, 在智能生物材料开发、细胞力学微环境研究以及组织工程构建等领域具有广阔的应用前景.
4 实验部分
实验试剂和仪器、水凝胶微观结构表征及细胞培养方法见支持信息.
4.1 oxi-HA的制备
取250 mL烧杯, 加入50 mL去离子水, 称取0.6 g 透明质酸(HA) (90 kDa)并加入到50 mL去离子水中. 称取1.34 g高碘酸钠(NaIO4)并溶解在8 mL去离子水中, 待HA完全溶解后, 将NaIO4溶液缓慢加入HA溶液中. 将混合物在室温下避光搅拌24 h. 反应结束后, 向反应溶液中加入0.6 mL乙二醇淬灭残留的NaIO4 (30 min). 之后将溶液装入透析袋中(MWCO=14 kDa), 用去离子水透析7 d. 最后, 将透析溶液冻干, 得到白色蓬松的聚合物固体.
4.2 oxi-HA氧化度表征
通过二碳酸二叔丁酯(t-BC)和2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)测量oxi-HA中醛基官能团的数量来量化oxi-HA的氧化度(OD). 将0.3 mL oxi-HA (0.6% w/V)和0.25 mL t-BC (30 mmol/L)在1%三氯乙酸水溶液中充分混合, 在室温下反应24 h. 反应结束后使用0.1 mol/L硼酸盐缓冲液稀释反应混合物(1∶100), 将0.3 mL 0.1% (V/V)的TNBS和0.3 mL稀释后的反应物混合, 在37 ℃下反应4 h. 然后, 用盐酸(0.5 mol/L)稀释溶液, 在325 nm处测量溶液的吸光度. 使用0至30 mmol/L的t-BC溶液获得标准校准曲线(Eq. 1), 以确定未反应的t-BC的量并计算OD (Eq. 2). 标准曲线拟合结果为:
y=0.0182x＋0.3204; R2=0.9974
其中, x是t-BC的浓度, y是吸收值.
$\mathrm{OD}(\%)=\frac{n_{0}-n_{1}}{n_{0}} \times 100$
其中, n0和n1分别是t-BC的初始和最终摩尔数.
4.3 FT-IR测试
红外光谱仪型号为IR Trace-100 (Shimadzu). 仪器配备衰减全反射(ATR)附件, 测试时使用溴化钾固体作为测试载体, 采集区间为2000~800 cm－1. 使用HA、oxi-HA和冻干后的oHG水凝胶样品进行测试.
4.4 oHG水凝胶的制备
将PBS缓冲液、20% oxi-HA的PBS溶液和10% gelatin的PBS溶液分别装载至三个注射单元, 根据表1所示的参数对注射单元的流速进行设置后, 制备不同黏弹性的oHG水凝胶. 制备的oHG水凝胶在室温下放置24 h, 使其内部的亚胺键充分形成后用于细胞实验.
4.5 oHG水凝胶的黏弹性表征
使用型号为Physica MCR101的流变仪在25 ℃下对oHG水凝胶的黏弹性进行表征. 测试平板直径为40 mm, 厚度为1 mm. 振荡频率和振荡时间测试在0.1%应变下进行. 在0.08%应变下进行应力松弛测试.
4.6 oHG水凝胶的溶胀比测试
将制备好的体积为0.3 mL的oHG水凝胶称重, 并分别浸没到1.5 mL的DMEM中, 分别于1, 6, 12, 24, 48和72 h记录水凝胶的质量, 称重时使用滤纸吸干水凝胶表面的溶液. 水凝胶的溶胀比通过Eq. 3计算:
$\text { Swelling ratio }=\frac{w_{t}-w_{0}}{w_{0}}$
其中w0为水凝胶的初始重量, wt为时间t下的水凝胶质量.
4.7 GoHG水凝胶的制备
将PBS缓冲液、20% oxi-HA的PBS溶液和10% gelatin的PBS溶液分别装载至三个注射单元, 设置gelatin注射单元的注射流速为固定的0.60 mL/min, PBS注射单元的流速设置为从0.55至0.30 mL/min的越阶递减模式, 每10 s衰减0.05 mL/min, oxi-HA注射单元的流速设置为从0.05至0.30 mL/min的越阶递增模式, 每10 s增加0.05 mL/min. 制备的GoHG水凝胶在室温下放置24 h, 使其内部的亚胺键充分形成后用于细胞实验.
4.8 GoHG水凝胶的黏弹性表征
使用型号为OP1550的纳米压痕仪在25 ℃下对GoHG水凝胶的黏弹性进行表征, 探针的尖端半径为9.0 μm, 刚度为50.0 N/m, 空气中的geo factor为1.46. 在有效杨氏模量和应力松弛的测试中, 压痕深度设置为5000 nm.
4.9 细胞毒性实验
将细胞消化并重悬于含1%胎牛血清(FBS)和1%双抗的高糖DMEM培养基中, 以70000 cells/mL的密度将细胞接种至96孔板中, 每孔0.1 mL, 培养10 h使细胞贴壁. 吸去96孔板中的培养基, 加入0.1 mL水凝胶样品的培养基漂洗液(每1 mL高糖DMEM完全培养基漂洗300 μL oHG水凝胶), 对照组中加入0.1 mL高糖DMEM完全培养基. 将96孔板放回培养箱中培养72 h. 测试时吸去96孔板中的液体, 将CCK-8与培养基按1∶9的比例混合, 每孔加入0.1 mL混合溶液, 将孔板放回培养箱中孵育1~2 h, 使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度. 细胞存活率通过Eq. 4计算得出:
$\text { Cell viability }(\%)=\frac{A_{i}}{A_{0}} \times 100$
其中Ai为实验组的吸光度, A0为对照组的吸光度.
4.10 活细胞/死细胞染色
将细胞以5×10⁴ cell/mL的密度接种至12孔板和GoHG水凝胶上, 置于培养箱中培养. 孵育48 h后, 在PBS溶液中制备2 μmol/L的钙黄绿素AM (Calcein-AM)和1 μmol/L的碘化丙啶(PI)溶液备用. 从培养箱中取出细胞样品, 吸去培养基, 并用预热的PBS缓冲液洗涤细胞2~3次, 以去除残留培养基. 加入染色工作液, 将样品置于培养箱中避光孵育30 min. 孵育结束后吸去染色工作液, 用PBS缓冲液洗涤2~3次, 去除未结合的染料. 使用荧光显微镜观察细胞. 活细胞: Calcein-AM标记, 带有绿色荧光(激发波长488 nm, 发射波长515 nm); 死细胞: PI标记, 带有红色荧光(激发波长535 nm, 发射波长617 nm).
4.11 细胞铺展实验
将细胞以4×104 cell/mL的密度接种至GoHG水凝胶上, 培养48 h后进行活细胞/死细胞染色. 使用激光扫描共聚焦显微镜(STELLARIS 8)在十倍镜下拍摄荧光场的图像. 使用ImageJ (v1.8.0.112, 64位)(美国国立卫生研究院)软件对图像进行分析. 将荧光图片转换为8-bit, 设置阈值为32, 统计细胞面积与周长(不包含图片边缘处细胞). 细胞圆度可由Eq. 5计算:
$\text { Circularity }=4 \pi \times \frac{\text { Area }}{\text { Perimeter }^{2}}$
使用GraphPad Prism (v9.4.1)软件进行统计分析. 实验数据以平均值±标准差表示, 统计显著性和P值通过单因素方差分析确定.
(Lu, Y.)