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2026 , Vol. 84 >Issue 1: 109 - 118

DOI: https://doi.org/10.6023/A25090300

研究论文

8-羟基喹啉修饰的铂(II)多吡啶配合物的合成及体内外抗癌活性评价

  • 覃其品 , a, b, * ,
  • 李秋明 a ,
  • 张菊梅 a ,
  • 谭明雄 a, b ,
  • 梁宏 b
展开
  • a 玉林师范学院化学与食品科学学院 广西农产资源化学与生物技术重点实验室 广西玉林 537000
  • b 广西师范大学化学与药学学院 桂林 541004

收稿日期: 2025-09-06

  网络出版日期: 2025-10-11

基金资助

广西自然科学基金(2025GXNSFAA069961)

八桂拔尖人才(2024ZKBGQB01)

国家自然科学基金(22267020)

收起

Synthesis and Evaluation of in vitro and in vivo Anticancer Activities of 8-Hydroxyquinoline-modified Platinum(II) Polypyridyl Complexes

  • Qipin Qin , a, b, * ,
  • Qiuming Li a ,
  • Jumei Zhang a ,
  • Mingxiong Tan a, b ,
  • Hong Liang b
Expand
  • a Guangxi Key Laboratory of Agricultural Resources Chemistry and Biotechnology, College of Chemistry and Food Science, Yulin Normal University, Yulin, Guangxi 537000
  • b School of Chemistry and Pharmaceutical Sciences, Guangxi Normal University, Guilin 541004
* E-mail:

Received date: 2025-09-06

  Online published: 2025-10-11

Supported by

Natural Science Foundation of Guangxi(2025GXNSFAA069961)

Bagui Youth Top-notch Personnel Program of Guangxi(2024ZKBGQB01)

National Natural Science Foundation of China(22267020)

Fold

摘要

为了克服顺铂类药物的毒性大和选择性差问题, 本研究以5,7-二碘-8-羟基喹啉(IQ-OH)铂(II)配合物[Pt(IQ- O)(DMSO)Cl] (PtIQ)为中间体, 以2-(1H-咪唑并[4,5-f][1,10]菲咯啉-2-基)喹啉-8-醇(Py)为辅助配体, 合成新型的8-羟基喹啉修饰的铂(II)多吡啶配合物[Pt(IQ-O)(Py)]Cl (PyPt). 通过核磁共振(NMR)、紫外-可见分光光度法(UV-vis)、红外光谱(IR)和元素分析手段对配合物PyPt和PtIQ进行了结构表征. 密度泛函理论计算显示, PyPt和PtIQ的最高占据分子轨道(HOMO)与最低未占据分子轨道(LUMO)之间的能隙分别为2.3和3.2 eV, 说明PyPt与PtIQ的抗癌活性存在差异. 相对于人肺癌细胞(A549)和人肺癌顺铂耐药细胞(A549/DDP), PyPt对人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)表现出更好的抑制作用, 其IC50值为(0.05±0.04) μmol/L, 优于cis-[PtCl2(DMSO)2] (>50.0 μmol/L)、PtIQ [(9.0±0.1) μmol/L]、IQ-OH (>50.0 μmol/L)、Py (>50.0 μmol/L)和临床药物顺铂[(11.1±0.3) μmol/L]; 此外, PyPt对正常肝细胞(HL-7702)的毒性很小, 说明PyPt对MDA-MB-231癌细胞具有更好的选择性. 流式细胞术和显微镜成像显示, PyPt能明显诱导细胞凋亡[ca. (48.0±0.9)%]和衰老[积分光密度(IOD)值=(1.9±0.1)×106], 优于PtIQ [凋亡率=(44.2±0.6)%, 衰老IOD值= (1.8±0.1)×106]和空白对照组[凋亡率=(6.1±0.6)%, 衰老IOD值=(2.1±0.1)×105]. 分子对接结果表明, PyPt与端粒酶逆转录酶(hTERT)中DNA链间的结合能为–53.0 kJ/mol, 明显强于PtIQ (–30.2 kJ/mol). 彗星电泳实验、免疫荧光实验、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印迹(western blotting)实验结果显示, PyPt通过抑制hTERT表达、激活caspase3/7蛋白和引起DNA损伤来诱导MDA-MB-231癌细胞凋亡和衰老, 其诱导能力强于PtIQ. 体内实验显示, PyPt对MDA-MB-231实体瘤有很好的抑制效果, 抑制率为44.4%, 且未对小鼠的存活率(n=6)和体重造成影响. 总之, 本工作开发了一种以DNA和hTERT为靶点的新型8-羟基喹啉修饰铂(II)多吡啶抗癌金属药物.

关键词： 铂(II)配合物; 8-羟基喹啉衍生物; 抗癌活性; DNA损伤; 人端粒酶逆转录酶(hTERT)抑制

本文引用格式

覃其品 , 李秋明 , 张菊梅 , 谭明雄 , 梁宏 . 8-羟基喹啉修饰的铂(II)多吡啶配合物的合成及体内外抗癌活性评价[J]. 化学学报, 2026 , 84(1) : 109 -118 . DOI: 10.6023/A25090300

Abstract

To overcome the problems of high toxicity and poor selectivity of cisplatin-based drugs, a novel 8-hydroxyquinoline-modified platinum(II) polypyridine complex, [Pt(IQ-O)(Py)]Cl (PyPt), was synthesized using 5,7-diiodo-8-hydroxyquinoline platinum(II) complex [Pt(IQ-O)(DMSO)Cl] (PtIQ) as an intermediate and 2-(1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin-2-yl)quinolin-8-ol (Py) as an auxiliary ligand. The structures of PyPt and PtIQ were characterized by nuclear magnetic resonance (NMR), ultraviolet-visible spectrophotometry (UV-vis), infrared spectroscopy (IR) and elemental analysis. Density functional theory calculations showed that the energy gaps between the highest occupied molecular orbital (HOMO) and the lowest unoccupied molecular orbital (LUMO) of PyPt and PtIQ were 2.3 eV and 3.2 eV, respectively, indicating that there were differences in the anticancer activities of PyPt and PtIQ. Comparing with human lung cancer cells (A549) and human lung cancer cisplatin-resistant cells (A549/DDP), PyPt exhibited better inhibitory effects on human breast cancer cells (MDA-MB-231), with an IC50 value of (0.05±0.04) μmol/L, which was superior to cis-[PtCl2(DMSO)2] (>50.0 μmol/L), PtIQ [(9.0±0.1) μmol/L], IQ-OH (>50.0 μmol/L), Py (>50.0 μmol/L) and the clinical drug cisplatin [(11.1±0.3) μmol/L]. Additionally, PyPt had little toxicity to normal liver cells (HL-7702), indicating that PyPt had better selectivity for MDA-MB-231 cancer cells. Flow cytometry and microscopic imaging showed that PyPt could significantly induce apoptosis [ca. (48.0±0.9)%] and senescence [IOD value=(1.9±0.1)×106] in cells, which was superior to PtIQ [apoptosis rate=(44.2±0.6)%, senescence IOD value=(1.8±0.1)×106] and the blank control group (apoptosis rate=(6.1±0.6)%, senescence IOD value=(2.1±0.1)×105). Molecular docking results indicated that the binding energy of PyPt with the DNA strand in telomerase reverse transcriptase (hTERT) was –53.0 kJ/mol, which was significantly stronger than that of PtIQ (–30.2 kJ/mol). Comet assay, immunofluorescence assay, real time-PCR detection (RT-qPCR) and western blotting experiments showed that PyPt induced apoptosis and senescence in MDA-MB-231 cancer cells by inhibiting hTERT expression, activating caspase3/7 proteins and inducing DNA damage, and its induction ability was stronger than that of PtIQ. In vivo experiments showed that PyPt had a good inhibitory effect on MDA-MB-231 solid tumors with an inhibition rate of 44.4%, and did not affect the survival rate (n=6) and body weight of mice. In conclusion, a novel 8-hydroxyquinoline-modified platinum(II) polypyridine anticancer metal drug targeting DNA and hTERT was developed.

Key words： platinum(II) complexes; 8-hydroxyquinoline derivatives; anticancer activity; DNA damage; human telomerase reverse transcriptase (hTERT) inhibition

1 引言

至今, 顺铂及类似物卡铂、奈达铂、洛铂、奥沙利铂常用于临床治疗各种实体瘤与癌症[1-3], 基于铂类的化疗通常能取得初步的治疗成功, 但在大量肿瘤治疗过程中观察到固有或获得性耐药现象[1-3]; 铂类药物使用的另一个局限性在于其产生显著的不良副作用, 这些副作用会影响肾脏(肾毒性)、周围神经(神经毒性)、肝脏(肝毒性)以及内耳(耳毒性)[1-5]. 这些缺点促使科学家去开发更具有靶向性、高效性的铂(Pt)类抗癌药物.
此外, 大量具有抗癌活性的喹啉Pt配合物或8-羟基喹啉Pt配合物, 如2-甲基-8-羟基喹啉Pt配合物[6]、4-羟基吖啶Pt配合物[7]、5-取代-8-羟基喹啉Pt配合物[8]、2-[(5-氯吡啶-2-基)-肼甲基]-8-羟基喹啉Pt配合物[9]、5,7-二氯-8-羟基喹啉Pt配合物[10-11]、5-硝基-8-羟基喹啉Pt配合物[12]、5,7-二甲基-8-羟基喹啉酸盐Pt配合物[13]和5,7-二氨基喹啉-8-硫醇Pt配合物[14]等相继被报道, 同时它们的靶点被主要确认为DNA、caspase家族、自噬、端粒/c-myc G-四链体、诱导型NO合酶(iNOS)、p53、端粒酶、活性氧(ROS)、细胞外信号调节激酶1/2 (ERK1/2)和线粒体功能障碍等[6-18]; 然而更为遗憾的是, 喹啉Pt配合物或8-羟基喹啉Pt配合物靶向性不强, 选择性低.
此外, 文献报道经辅助配体Py修饰的2,2'-联吡啶钌(II)抗癌配合物, 可增强对A549肿瘤细胞的抗增殖能力和光动力治疗效果[19]. 受此启发, 我们首次以IQ-OH和Py为活性配体, 合成8-羟基喹啉修饰的Pt(II)多吡啶配合物PyPt; 同时, 还研究PyPt和PtIQ对MDA- MB-231癌细胞和正常细胞HL-7702的抗癌活性和毒性及其抗癌机制进行了探索, 并给出PyPt对体内MDA- MB-231实体瘤模型的抑制效果.

2 结果与讨论

2.1 PyPt和PtIQ的合成与热力学稳定性研究

按照文献[19]报道的方法进行制备, 得到黄色辅助配体Py. 此外, 在容积为15.0 mL的高温耐药管中, 加入0.1 mmol的cis-[PtCl2(DMSO)2]和1.0 equiv.的IQ-OH, 随后加入2.0 mL甲醇和0.1 mL的二甲基亚砜(DMSO), 在68 ℃下反应3 d, 冷却至室温, 过滤得到黄色产物PtIQ. 烘干后, 取0.1 mmol的固体PtIQ置于耐药管中, 称取等物质的量的Py, 并加入2.0 mL甲醇和0.2 mL丙酮, 在68.0 ℃下反应3 d, 冷却至室温, 过滤, 用三氯甲烷洗涤3次, 得到深黄色产物PyPt(图1). 通过元素分析、NMR(支持信息图S1~S3)、UV-vis(支持信息图S4)和IR(支持信息图S5、S6)等表征手段确定PyPt和PtIQ的结构, 它们的中心Pt原子为平面四边形几何构型. 支持信息图S4, PyPt在10.0 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)下, UV-vis的峰型没有改变且没有发生红移和蓝移现象, 说明PyPt在生理条件下是稳定存在的; 此外, 液相色谱实验显示, 在10.0 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)静置48.0 h后, PyPt在静置前后的化学位移并没有发生改变, 且有别于IQ-OH和Py配体, 同样也说明了PyPt在生理条件下是稳定存在的(支持信息图S7); 总之, PyPt在生理条件下是稳定存在的, 满足生物实验稳定物种的需求. 同样, 先前文献报道的PtIQ在生理条件下也是稳定存在的[10b].
图1 配合物PyPt和PtIQ的合成

Figure 1 Synthesis of PyPt and PtIQ

密度泛函理论(DFT)计算结果表明, PyPt和PtIQ的最高占据分子轨道(HOMO)与最低未占据分子轨道(LUMO)之间的能隙分别为2.3和3.2 eV, 比文献报道的氧海罂粟碱锌配合物Zn1 (1.9 eV)和Zn2 (1.6 eV)[20]具有更好的热力学稳定性(图2), 这表明PyPt和PtIQ获得了更多的配体场稳定能, 这与PyPt和PtIQ的抗癌活性差异有关.
图2 通过DFT计算PyPt和PtIQ的HOMO-LUMO之间的能隙

Figure 2 The DFT calculated HOMO-LUMO gap of PyPt and PtIQ

2.2 抗癌活性研究

众所周知, 噻唑蓝(MTT)比色法或细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)广泛应用于活细胞的检测[21]; 因此本研究应用CCK-8研究顺铂、PyPt和PtIQ对A549、A549/DDP、MDA-MB-231和HL-7702细胞的抗癌活性和毒性. 表1的实验结果显示, PyPt、cis-[PtCl2- (DMSO)2]、PtIQ、PtIQ+Py、IQ-OH、Py和顺铂对A549、A549/DDP、MDA-MB-231癌细胞有不同的作用效果, 尤其是对MDA-MB-231癌细胞的抑制效果最为明显, 其IC50值分别为(0.05±0.04)、>50.0、(9.0±0.1)、(8.8±0.4)、>50.0、>50.0和(11.1±0.3) μmol/L; 实验结果说明了, PyPt对所选癌细胞明显高于cis-[PtCl2(DMSO)2]、PtIQ、PtIQ+Py、IQ-OH、Py和临床药物顺铂, 证明在配合物PyPt中的铂离子与配体(Py、IQ-OH)产生协同效应, 实现了药物“1+1>2”的抗癌效果. 此外, PtIQ通过辅助配体Py修饰后, 形成配合物PyPt, 其对MDA-MB-231癌细胞的IC50值从(9.0±0.1) μmol/L降到(0.05±0.04) μmol/L, 说明辅助配体Py的引入, 明显增大了铂配合物对MDA-MB-231癌细胞的抑制作用. 研究还发现, PyPt对MDA-MB-231癌细胞抗癌活性明显大于文献报道的喹啉Pt配合物和8-羟基喹啉Pt配合物[6-18]. 此外, PyPt对A549/DDP耐药细胞具有很好的抑制效果, IC50值为 (0.9±0.3) μmol/L, 高于PtIQ和PtIQ+Py, 说明PyPt能克服顺铂的耐药性. 更有趣的是, 配合物PyPt对正常HL-7702细胞毒性 (>50.0 μmol/L)非常小, 其肿瘤选择性(SI)>980.4, 优于铂盐cis-[PtCl2(DMSO)2]、PtIQ、IQ-OH、Py和顺铂.
表1 顺铂、PyPt和PtIQ对MDA-MB-231和HL-7702细胞的IC50值(μmol/L)

Table 1 The IC50 values of cisplatin, PyPt and PtIQ against MDA-MB-231 and HL-7702 cells

Entrya A549 A549/DDP MDA-MB-
231		 HL-7702 SIb
Py >50.0 >50.0 >50.0 >50.0 ca. 1.0
IQ-OH >50.0 >50.0 >50.0 >50.0 ca. 1.0
cis-[PtCl2-
(DMSO)2]		 >50.0 >50.0 >50.0 >50.0 ca. 1.0
PtIQ 7.2±0.5 6.1±0.9 9.0±0.1 35.5±0.4 4.0
PyPt 1.0±0.2 0.9±0.3 0.05±0.04 >50.0 >980.4
PtIQ+Py 7.0±0.5 6.0±0.1 8.8±0.4 36.2±0.7 4.2
顺铂 13.0±0.6 >50.0 11.1±0.3 15.6±0.2 1.4

a The cells were incubated for 48 h; b Tumor selectivity (SI)=IC50 value (HL-7702)/IC50 value (MDA-MB-231).

2.3 PyPt和PtIQ诱导细胞凋亡和衰老

应流式细胞术和显微镜成像实验, 研究PyPt (0.05 μmol/L)和PtIQ (9.0 μmol/L)诱导MDA-MB-231细胞凋亡和衰老的情况. 图3是PyPt (0.05 μmol/L)和PtIQ (9.0 μmol/L)诱导MDA-MB-231细胞凋亡图; 其中Q1-UL区为自然死细胞, Q1-UR区为晚期凋亡细胞, Q1-LR区为早期凋亡细胞, Q1-LL区为活的细胞. 空白对照组(control), Q1-UR和Q1-LR区总和仅为(6.1±0.6)%, 说明MDA-MB-231细胞状态良好(图3). 而细胞经PyPt (0.05 μmol/L)和PtIQ (9.0 μmol/L)作用48.0 h后, Q1-UR和Q1-LR区凋亡细胞明显增大, 分别增大至(48.0±0.9)%和(44.2±0.6)%, 说明PyPt诱导MDA-MB-231细胞凋亡的能力明显高于PtIQ和文献报道的5,7-二碘-8-羟基喹啉铂配合物(27.8%[10b], HepG2细胞). 图4中MDA-MB-231细胞经β-半乳糖苷酶染色后, 呈蓝绿色, 说明癌细胞发生一定的衰老. 同样control组中, 细胞的蓝绿色区域较少(图4和支持信息表S1), IOD值仅仅为(2.1±0.1)×105, 而癌细胞经PyPt (0.05 μmol/L)和PtIQ (9.0 μmol/L)作用48.0 h后, MDA-MB-231中呈蓝绿色的区域明显增多, 其IOD值分别为(1.9±0.1)×106和(1.8±0.1)×106; 实验结果说明, PyPt诱导MDA-MB-231细胞衰老的能力明显高于PtIQ和文献报道的5,7-二碘-8-羟基喹啉Pt配合物(肝癌HepG2细胞)[10b]. 总之, 辅助配体Py的引入, 明显增大了铂配合物PyPt对MDA-MB- 231癌细胞的诱导细胞凋亡和衰老的能力.
图3 PyPt(0.05 μmol/L)和PtIQ (9.0 μmol/L)诱导MDA-MB-231细胞凋亡

Figure 3 Apoptosis of MDA-MB-231 cells induced by PyPt (0.05 μmol/L) and PtIQ (9.0 μmol/L)

图4 PyPt(0.05 μmol/L)和PtIQ (9.0 μmol/L)诱导MDA-MB-231细胞衰老

Figure 4 Cellular senescence of MDA-MB-231 cells induced by PyPt (0.05 μmol/L) and PtIQ (9.0 μmol/L)

Image multiple: 20 μm

2.4 DNA损伤实验

细胞中的尾部DNA (Tail DNA, %)、磷酸化组蛋白γ-H2AX和TRF2(端粒蛋白复合体)分别是DNA损伤和端粒损伤的重要指标[22-23], 它们与细胞凋亡和衰老密切相关[22-23]. 为了研究PyPt (0.05 μmol/L)和PtIQ (9.0 μmol/L)诱导MDA-MB-231癌细胞凋亡和衰老是否由DNA损伤所引发, 应用彗星电泳和免疫荧光实验研究的Tail DNA (%)、γ-H2AX和TRF2在MDA-MB-231癌细胞中的变化情况. 空白对照组(control), MDA-MB-231癌细胞的Tail DNA(%)仅为(2.5±1.5)%, 说明MDA- MB-231细胞中的DNA损伤少、细胞生长状态良好(图5和支持信息表S2). 而细胞经PyPt (0.05 μmol/L)和PtIQ (9.0 μmol/L)作用48.0 h后, 细胞中的Tail DNA(%)明显增大, 分别增大至(66.2±2.5)%和(62.4±3.5)%, 说明PyPt诱导DNA损伤的能力明显高于PtIQ. 此外, 图6和支持信息图S8~S10显示, 癌细胞孵育48.0 h后, PyPt (0.05 μmol/L)和PtIQ (9.0 μmol/L)组中的绿色荧光明显增强, 说明经PyPt和PtIQ作用后, MDA-MB-231细胞中的γ-H2AX明显增加, 而TRF2则变化很小, 进一步说明了PyPt和PtIQ通过DNA损伤来诱导MDA- MB-231细胞凋亡, 而不是通过诱导端粒DNA损伤引起的.
图5 采用彗星试验检测PyPt (0.05 μmol/L)和PtIQ (9.0 μmol/L)作用MDA-MB-231细胞48 h后DNA损伤的情况

Figure 5 Induction of DNA damage in MDA-MB-231 cells by PyPt (0.05 μmol/L) and PtIQ (9.0 μmol/L) for 48 h using neutral comet assay

Image multiple: 100 μm.

图6 免疫荧光法检测PyPt (0.05 μmol/L)和PtIQ (9.0 μmol/L)作用MDA-MB-231细胞48 h后TRF2和γ-H2AX的含量(n=3)

Figure 6 TRF2 foci and γ-H2AX quantification detected by immunofluorescence on MDA-MB-231 cells treated with PyPt (0.05 μmol/L) and PtIQ (9.0 μmol/L) for 48 h (n=3)

Image multiple: 10 μm.

2.5 分子对接与RT-qPCR实验

约85.0%癌细胞中的hTERT是过表达的, 它参与维持癌细胞的生存, 一旦被抑制, 端粒酶和端粒DNA合成均被阻断[24-25], 最终会引发细胞凋亡和衰老. 首先, 通过分子对接确定, PyPt和PtIQ与hTERT中DNA的相互结合强度与作用位点[25-26], 其中hTERT蛋白的PDB ID为6d6v[25]. 据Autodock软件[25-26]计算结果显示, PyPt和PtIQ与hTERT中DNA分子间的结合能分别为–53.0和–30.2 kJ/mol(图7), 说明PyPt和PtIQ与hTERT中DNA能稳定结合. 由图7可见, PtIQ能够稳定嵌合于hTERT DNA的B链中碱基A50(B)、A51(B)、C46(B)、C48(B)、C49(B)及C链的DT14(C)、DT15(C)、DG16(C)、DG11(C)共同构成的空腔区域; 上述相互作用主要依赖于两种非共价作用力: (1) PtIQ与DT15(C)之间形成稳定的氢键(H)相互作用, 有助于提高PtIQ与hTERT结合的选择性与特异性; (2) PtIQ的疏水性结构域与hTERT邻近的8个碱基之间存在显著的疏水相互作用, 有效减少外界水分子的干扰, 从而增强了PtIQ与hTERT的热力学稳定性. 而PyPt能够稳定地结合hTERT DNA中B链碱基A113、A115、G114、C152、U151、U153、U154、C109、A112、A111、G107和A108共同形成的空腔中. PyPt与hTERT DNA中的碱基A113间形成了氢键, 有助于增强PyPt在靶点hTERT定位的精确性; 同时, PyPt的疏水区域与该腔体内11个碱基之间存在良好的疏水相互作用(图7), 能够有效隔绝水分子, 进一步提升PyPt与hTERT结合的稳定性. 总体来看, 辅助配体Py的引入, 明显增大PyPt的平面, 增强了PyPt与hTERT的氢键与疏水协同作用(图7), 使其被牢固地结合在hTERT蛋白质内部DNA的结合位点中, 其作用明显强于PtIQ, 为其后续靶点研究提供了理论基础. 其次, 通过RT-qPCR实验探究了癌细胞经PyPt (0.05 μmol/L)和PtIQ (9.0 μmol/L)作用48.0 h后, hTERT RNA的表达情况. 相对于空白组细胞(untreated cells, 1.00±0.08), PyPt在MDA-MB-231癌细胞中能抑制hTERT RNA转录(支持信息表S3、S4和图8), 表达值均为0.39±0.05, 高于PtIQ (0.44±0.03), 说明了PyPt和PtIQ通过hTERT抑制来诱导MDA-MB-231细胞衰老和凋亡, 其诱导能力遵循PyPt>PtIQ, 与分子对接结果、免疫荧光、活性实验等结果一致.
图7 分子对接研究PyPt和PtIQ与目标蛋白hTERT中DNA

Figure 7 Molecular docking analysis of PyPt and PtIQ against the target hTERT DNA

图8 RT-qPCR实验测定PyPt (0.05 μmol/L)和PtIQ (9.0 μmol/L)作用MDA-MB-231癌细胞48 h后hTERT RNA的表达情况

Figure 8 The hTERT RNA expression in MDA-MB-231 cells treated with PyPt (0.05 μmol/L) and PtIQ (9.0 μmol/L) for 48 h was determined using RT-PCR

2.6 调控DNA损伤的相关蛋白

在肿瘤或癌症的治疗中, DNA损伤在金属类抗癌药中被广泛视为“首要且重要的靶向分子”[24,27]. 如图5和6所示, 已经证实PyPt和PtIQ能明显诱导MDA- MB-231癌细胞中的DNA损伤. 随后, 应用Western blotting检测MDA-MB-231癌细胞中的DNA损伤诱导相关蛋白和蛋白激酶p-BRCA1、p-ATR、c-PARP、p-CHK1、p-ATM和p-CHK2的表达情况, 从而明确PyPt (0.05 μmol/L)和PtIQ (9.0 μmol/L)诱导MDA-MB-231细胞DNA损伤的机制. 图9所示, 经PyPt (0.05 μmol/L)和PtIQ (9.0 μmol/L)作用48.0 h后, MDA-MB-231细胞中p-BRCA1表达明显降低, 而p-ATR、c-PARP、p-CHK1、p-ATM和p-CHK2的表达明显激活, 其诱导能力遵循PyPt>PtIQ, 说明PyPt和PtIQ通过调控DNA关键蛋白和激酶来诱导MDA-MB-231细胞的DNA损伤, 并引发凋亡.
图9 孵育48 h后, 配合物PyPt (0.05 μmol/L)和PtIQ (9.0 μmol/L)对MDA-MB-231细胞中DNA损伤和细胞凋亡通路的影响

Figure 9 Complexes PyPt (0.05 μmol/L) and PtIQ (9.0 μmol/L) triggered DNA damage and apoptosis response pathways in MDA-MB-231 cells after treatment for 48 h

2.7 激活caspase3/7蛋白

图3说明了PyPt和PtIQ能明显诱导MDA-MB-231细胞产生凋亡, 而caspase家族蛋白又与细胞凋亡密切相关[28], 为了研究PyPt (0.05 μmol/L)和PtIQ (9.0 μmol/L)与caspase家族蛋白的作用情况, 我们选择了c-caspase3和c-caspase7两种蛋白进行了研究. 图9中的实验结果说明, MDA-MB-231癌细胞经PyPt (0.05 μmol/L)和PtIQ (9.0 μmol/L)孵育48 h后, c-caspase3和c-caspase7的表达量明显高于对照组(control), 说明PyPt和PtIQ通过激活caspase3/7蛋白来诱导MDA- MB-231细胞凋亡, 且辅助配体Py的引入, 明显增大了铂配合物PyPt诱导MDA-MB-231癌细胞凋亡的能力, 与上述实验结果均一致.

2.8 PyPt体内抑瘤实验

当肿瘤MDA-MB-231生长至0.1 cm3左右时, 将动物按6只随机分3组, 加药组按PyPt (5.0 mg/kg)隔天给药, 21天后, 空白对照组(control)的肿瘤体积增长至(1.3±0.1) cm3, 而PyPt对MDA-MB-231肿瘤有明显的抑制作用(ca. 44.4%), 其肿瘤体积仅为(0.7±0.1) cm3. 如图10和支持信息表S5~S7, 加药组PyPt (5.0 mg/kg)在21天用药后, 体重为(21.2±0.5) g, 与control组的体重相当[m=(21.5±0.5) g], 且加药组PyPt (5.0 mg/kg)中的裸鼠没有死亡和食欲不振的现象, 说明PyPt的体内毒性小且对MDA-MB-231肿瘤具有很好的选择性抑制作用.
图10 在MDA-MB-231荷瘤异种移植小鼠模型中, PyPt (5.0 mg/kg every 2.0 days)的体内抗肿瘤活性

Figure 10 In vivo antitumor activity of PyPt (5.0 mg/kg every 2.0 days) in the MDA-MB-231-bearing xenograft mouse model. p value<0.05

3 结论

本研究以8-羟基喹啉IQ-OH为配体, 与铂盐cis- [PtCl2(DMSO)2]反应, 得到中间体PtIQ, 经辅助配体Py修饰, 合成出新型铂(II)多吡啶配合物PyPt. 配合物PyPt和PtIQ经NMR、UV-vis、IR和元素分析手段进行表征. PyPt和PtIQ选择性抑制MDA-MB-231癌细胞生长, 其IC50值为(0.05±0.04) μmol/L和(9.0±0.1) μmol/L, 优于配体和铂盐. PyPt通过抑制hTERT表达、激活caspase3/7蛋白、诱导DNA损伤及相关蛋白来引发MDA-MB-231癌细胞凋亡和衰老, 其诱导能力强于PtIQ. 辅助配体Py的引入, 明显增大了铂配合物PyPt的平面, 增大其与靶点的相互作用, 从而提高诱导MDA-MB-231细胞凋亡和衰老的能力. 更重要的是, PyPt具有很好的体内抗癌作用(ca. 44.4%), 毒性小, 是一种高效、低毒性以DNA和hTERT为靶点的新型8-羟基喹啉修饰铂(II)多吡啶抗癌金属药物.

4 实验部分

4.1 激活caspase家族蛋白

按照文献报道的方法制备辅助配体Py[19].
配合物PtIQ的合成: 称取0.1 mmol的IQ-OH (39.7 mg)和0.1 mmol铂盐cis-[PtCl2(DMSO)2] (42.2 mg), 加入到约为15.0 cm的厚壁耐药管中, 随后加入CH3OH (2.0 mL)和DMSO (0.1 mL), 盖上盖子后, 于68.0 ℃反应3 d, 冷却后, 过滤, 真空干燥, 得到63.0 mg黄色中间体PtIQ.
配合物PyPt的合成: 在约为15.0 cm的厚壁耐药管中, 称取0.1 mmol的PtIQ (70.4 mg)、0.1 mmol的辅助配体Py (36.3 mg), 加入甲醇(2.0 mL)和丙酮(0.2 mL)后, 盖上盖子, 于68.0 ℃反应3 d, 冷却后, 过滤, 用三氯甲烷洗涤3次, 每次10.0 mL, 真空干燥后, 得到深黄色目标产物PyPt.
配合物PyPt和PtIQ的测试数据见支持信息.

4.2 配合物的表征数据

配合物PtIQ: 黄色固体63.0 mg, 产率89.5%; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.44 (d, J=5.4 Hz, 1H), 8.54 (d, J=8.6 Hz, 1H), 8.35 (s, 1H), 7.85 (dd, J=8.6, 5.4 Hz, 1H); 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ: 166.91, 149.10, 146.33, 143.89, 131.65, 129.68, 123.93, 84.40, 79.56; IR (KBr) ν: 3430, 3091, 3063, 3028, 3010, 2923, 1983, 1745, 1629, 1587, 1567, 1500, 1460, 1444, 1423, 1400, 1383, 1372, 1316, 1293, 1251, 1235, 1207, 1199, 1129, 1062, 1035, 979, 938, 917, 891, 876, 815, 772, 765, 749, 699, 680, 653, 611, 514, 502, 454 cm–1. Anal. calcd for PtC11H10O2ClI2NS: C 18.75, H 1.43, N 1.99; found C 18.73, H 1.48, N 2.02.
配合物PyPt: 深黄色固体92.3 mg, 产率93.3 %; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 14.03 (s, 1H), 9.83 (s, 1H), 9.10 (d, J=7.5 Hz, 2H), 8.91~9.01 (m, 2H), 8.56 (d, J=8.6 Hz, 2H), 8.48 (d, J=8.5 Hz, 1H), 8.34 (d, J=11.5 Hz, 1H), 7.99~7.82 (m, 3H), 7.61~7.48 (m, 2H), 7.24 (d, J=6.9 Hz, 1H); IR (KBr) ν: 3867, 3851, 3835, 3818, 3800, 3746, 3689, 3672, 3634, 3321, 3083, 3014, 3002, 2916, 2363, 2334, 2320, 2244, 1966, 1763, 1635, 1607, 1595, 1572, 1547, 1525, 1500, 1486, 1448, 1435, 1410, 1391,1375, 1363, 1319, 1295, 1273, 1242, 1228, 1194, 1164, 1128, 1117, 1075, 1058, 1030, 982, 946, 922, 885, 851, 841, 804, 762, 742, 723, 704, 689, 673, 662, 649, 623, 584, 551, 510, 484, 462, 453 cm–1. Anal. calcd for PtC31H17O2ClI2N6: C 37.62, H 1.73, N 8.49; found C 37.64, H 1.78, N 8.47.

4.3 设备与其他实验方法

实验所用的设备与生物实验方法见支持信息.
(Cheng, F.)

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