新型氨基糖类席夫碱铜配合物的合成及抗肿瘤活性研究

高春艳; 崔馨月; 王凯月; 石雪怡; 贺卿; 赵晋忠; 岳爱琴; 杜维俊; 张永坡

doi:10.6023/A25090314

化学学报 >

2026 , Vol. 84 >Issue 3: 353 - 363

DOI: https://doi.org/10.6023/A25090314

研究论文

新型氨基糖类席夫碱铜配合物的合成及抗肿瘤活性研究

高春艳 ^a ,
崔馨月 ^a ,
王凯月 ^a ,
石雪怡 ^a ,
贺卿 ^a ,
赵晋忠 ^,^a^,^* ,
岳爱琴 ^b ,
杜维俊 ^b ,
张永坡 ^,^a^,^*

展开

^a 山西农业大学基础部晋中 030801
^b 山西农业大学农学院晋中 030801

收稿日期: 2025-09-16

网络出版日期: 2025-11-21

基金资助

项目受山西省自然科学基金(202403021221098)

项目受山西省自然科学基金(202403021221107)

山西农业大学科技创新提升项目(CXGC202413)

山西省大学生创新训练计划(20240261)

收起

Synthesis and Antitumor Activity of Novel Amino Glucose Derivative Schiff Base Copper(II) Complexes

Gao Chunyan ^a ,
Cui Xinyue ^a ,
Wang Kaiyue ^a ,
Shi Xueyi ^a ,
He Qing ^a ,
Zhao Jinzhong ^,^a^,^* ,
Yue Aiqin ^b ,
Du Weijun ^b ,
Zhang Yongpo ^,^a^,^*

Expand

^a Department of Basic Sciences, Shanxi Agricultural University, Jinzhong 030801
^b College of Agronomy, Shanxi Agricultural University, Jinzhong 030801

^*E-mail: zhaojz@sxau.edu.cn;

zhangyp@sxau.edu.cn

Received date: 2025-09-16

Online published: 2025-11-21

Supported by

Natural Science Foundation of Shanxi Province(202403021221098)

Natural Science Foundation of Shanxi Province(202403021221107)

Science and Technology Innovation Enhancement Project of Shanxi Agricultural University(CXGC202413)

Innovation training program for college students in Shanxi Province(20240261)

Fold

摘要

将生物活性相关的有机部分引入过渡金属配合物的配位领域已成为提高金属药物选择性和生物相容性的有效策略. 本工作设计并合成了2种具有叠氮乙酰化葡萄糖糖胺席夫碱结构的配体L¹和L², 进而与铜金属盐反应合成了3种新型铜配合物. 通过X射线单晶衍射技术解析了配体L¹和配合物3的单晶结构, 通过噻唑蓝(MTT)法测定了化合物对人恶性肿瘤细胞系和正常细胞系的体外细胞毒性. 其中配合物2对肝癌细胞(HepG-2)和宫颈癌细胞(HeLa)细胞表现出高的细胞毒性, 接近或优于阳性对照的值, 但对正常细胞的毒性则远低于阳性对照. 对肿瘤细胞毒性较强的配合物 2 进行了后续抗肿瘤活性研究, 包括细胞凋亡评估、细胞内活性氧生成、线粒体膜电位、细胞周期、细胞摄取、迁移和侵袭及血管生成实验, 进一步证实了其对肿瘤细胞的抑制作用机制. 由于糖骨架在配体中具有优异的水溶性, 使得配合物2表现出良好的溶解性和稳定性. 通过细胞内活性氧(ROS)产生、赫斯特(Hoechst 33342)染色实验、线粒体膜电位实验和膜联蛋白Ⅴ-红色荧光蛋白(Annexin V-mCherry)进一步证明, 配合物2能提高癌症细胞内活性氧的水平, 通过线粒体途径诱导细胞凋亡. 细胞周期实验证明配合物2可以延迟或抑制细胞周期通过S期和G2/M期的进展. 另外, 配合物2能有效抑制癌症细胞的迁移和侵袭, 且有效抑制正常细胞系脐静脉内皮细胞(HUVEC)的血管生成, 分子对接结果显示配合物2与血管内皮细胞生长因子受体2 (VEGFR-2)具有良好的结合能力.

关键词： 晶体结构; 氨基葡萄糖; 细胞凋亡; 细胞摄取; 迁移和侵袭

本文引用格式

高春艳 , 崔馨月 , 王凯月 , 石雪怡 , 贺卿 , 赵晋忠 , 岳爱琴 , 杜维俊 , 张永坡 . 新型氨基糖类席夫碱铜配合物的合成及抗肿瘤活性研究[J]. 化学学报, 2026 , 84(3) : 353 -363 . DOI: 10.6023/A25090314

Abstract

Introducing biologically active organic moieties into the coordination field of transition metal complexes has become an effective strategy for improving the selectivity and biocompatibility of metal drugs. In this paper, two ligands L¹and L² with azidoacetylated glucosamine Schiff base structure were designed and synthesized, and then reacted with copper metal salts to synthesize three novel copper complexes. The single crystal structures of ligand L¹and complex 3 were analyzed by X-ray single crystal diffraction technology, and the in vitro cytotoxicity of the compounds on human malignant tumor cell lines and normal cell lines was determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. Among them, complex 2 showed high cytotoxicity against HepG-2 and HeLa cells, approaching or exceeding the value of the positive control, but the toxicity to normal cells was much lower than that of the positive control. The subsequent anti-tumor activity studies of complex 2 with strong cytotoxicity to tumor cells, including apoptosis assessment, intracellular reactive oxygen species generation, mitochondrial membrane potential, cell cycle, cell uptake, migration and invasion, and angiogenesis experiments, further confirmed its inhibitory mechanism on tumor cells. Due to the excellent water solubility of the sugar skeleton in the ligand, complex 2 exhibited good solubility and stability. We further demonstrated through intracellular reactive oxygen species (ROS) production, Hoechst 33342 staining assay, mitochondrial membrane potential assay and Annexin V-mCherry assay that complex 2 can increase the level of ROS in cancer cells and induce apoptosis through the mitochondrial pathway. Cell cycle experiments have shown that complex 2 can delay or inhibit the progression of the cell cycle through the S and G2/M phases. The significant cell uptake results indicated that the high cytotoxicity of complex 2 might be due to its extensive accumulation in HepG-2 cells. In addition, complex 2 can effectively inhibit the migration and invasion of cancer cells, as well as the angiogenesis of normal cell line umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Molecular docking results showed that complex 2 has good binding ability with vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2).

Key words： crystal structures; glucosamine; apoptosis; cellular uptake; migration and invasion

1 引言

尽管人类在预防和治疗方面已取得了多项进展, 但癌症仍然是全球死亡的主要原因^[1-2]. 铂类抗癌药物在临床实践中得到了广泛的应用, 但具有毒副作用和耐药性, 这推动了新型金属药物的研发^[3-4]. 针对性设计的金属基药物为生物医学诊断和治疗提供了无限的可能性. 将生物活性相关的有机部分引入过渡金属配合物的配位领域已成为提高金属药物选择性和生物相容性的有效策略^[5]. 而糖缀合已成为提高细胞毒性药物选择性和药代动力学的一种有效手段^[6-7]. 葡萄糖胺作为一种糖分子, 具有分子量小、毒性低、水溶性好的优点. 研究表明, 葡萄糖胺还具有抗肿瘤、诱导肿瘤细胞分化和免疫调节等生物活性, 使其相关研究越来越受科研工作者的青睐^[8]. 氨基葡萄糖可以成为一种新的、有前景的抗癌候选制剂, 因其在抑制广泛的癌症细胞中失调分子途径方面取得了令人鼓舞的结果, 并且在正常细胞中没有毒性作用^[9]. 对于基于葡萄糖胺的金属配合物, 人们更关注此类化合物的合成或催化水解^[10], 而基于葡糖胺基金属配合物的抗肿瘤活性研究尚未得到广泛关注.

在不对称催化有机合成领域, 人们利用糖分子及其氨基衍生物的天然手性来源特性, 衍生氨基糖作为主要分子骨架, 设计合成了一系列手性配体, 如TROST型配体、SALEN型配体、RUFFO型配体等^[11-12]. 这些配体主要形成以Pd、Co、Rh、Ir、Cu、Ni、Mn等金属为中心的配合物, 在不对称催化氢化、氧化、加成等过程中表现出较高的对映选择性. 然而, 迄今为止, 还没有关于基于此类配体或类似结构的配合物的生物活性的报道. 事实上, 与手性配体在金属有机不对称催化领域的广泛应用相比, 基于手性葡糖胺配体开发抗癌金属药物的研究相对较少. 因此, 设计和开发基于葡萄糖胺配体的抗癌金属药物将具有重要的研究意义. 由于叠氮结构反应的特异性, 它作为点击反应中的反应中间体受到了研究人员的广泛关注^[13]. 叠氮化物修饰的单糖已被用于标记代谢细胞, 使用叠氮化物基团标记癌症细胞, 并通过有效的点击反应增加药物在肿瘤中的积累^[14], 或通过细胞内代谢转化结合到细胞表面, 然后特异性标记它们^[15].

席夫碱配合物在药物科学中发挥着重要的作用, 表现出丰富的结构多样性. 这些化合物通常价格低廉, 易于合成, 在各种氧化态下具有很强的金属稳定性^[16]. 席夫碱配合物已被证明在医学和药学中具有广泛的活性, 具有显著的抗癌活性. 在抗癌活性方面, 它们具有强的选择性、克服耐药性、靶向多个生物靶标及作用多种机制的潜力. 这些特性使它们成为一类有前景的抗癌药物, 具有巨大的发展潜力^[3]. 由于多齿螯合, 吡啶修饰的配体可以有利于获得稳定的分子结构, 这些分子能够与细胞中的关键靶标形成非共价加合物^[17].

在这些过渡金属配位化合物中, 铜配合物是一类有广泛应用前景的药物候选者^[18]. 铜是人体必需的微量元素, 在多种生物过程中起着至关重要的作用. 铜相关药物在癌症治疗领域引起了广泛关注. 一般来说, 目前有两种治疗与铜相关的肿瘤的共识策略: 在肿瘤内消耗铜以抑制增殖, 以及提供多余的铜以促进细胞凋亡或铜沉积^[19-20]. 铜基化疗药物作为铂基药物的替代品, 正受到越来越多的关注, 世界各地正在进行许多关于铜配合物作为潜在抗癌药物的研究^[21].

基于此, 在这项工作中, 我们设计并合成了三种新型的具有叠氮乙酰化葡萄糖糖胺席夫碱配体L¹和L²的铜配合物, 评估了它们的抗癌活性. 并通过一系列生物活性测定, 对铜配合物的抗癌作用机制进行了研究. 本文合成了手性葡萄糖胺修饰的吡啶类席夫碱配体L¹、L²及相应的三例铜配合物(图式1), 并对其结构进行了系列表征. 通过噻唑蓝(MTT)法测定了化合物对人恶性肿瘤细胞系宫颈癌细胞(HeLa)、大细胞肺癌细胞(NCI-H460)、胃腺癌细胞(BGC-823)和肝癌细胞(HepG-2)和人正常细胞系脐静脉内皮细胞(HUVEC)的体外细胞毒性. 对肿瘤细胞毒性较强的配合物2进行了后续抗肿瘤活性研究, 包括细胞凋亡评估、细胞内活性氧生成、线粒体膜电位、细胞周期、细胞摄取、迁移和侵袭及血管生成实验, 进一步证实了其对肿瘤细胞的抑制作用机制.

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图式1 配体L¹、L²和铜配合物1~3的合成路线

Scheme 1 Synthesis route of ligands L¹, L² and Cu(II) complexes 1~3

2 结果与讨论

2.1 晶体结构

配体L¹和配合物3的单晶结构已通过X射线单晶衍射技术收集并解析(图1). 精修过程的重要参数以及所选的部分键长和键角分别列于支持信息表S1和表S2中. L¹和配合物3的CCDC编号分别为2338503和2338504.

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图1 L¹和配合物3的晶体结构图. 为了清晰可见, 所有的氢原子及外界甲醇和水溶剂已省略

Figure 1 Crystal structure diagrams of L¹ and complex 3, all hydrogen atoms and external methanol and water solvents were omitted for clarity

配体L¹晶体的空间群为P2₁, 属于单斜晶系. L¹以氨基葡萄糖为骨架, 乙酰化反应后, 在C1上引入叠氮基团, 在C2的氨基上与2-吡啶甲醛发生缩合反应,形成席夫碱. 该配体利用氨基糖的天然手性来源构建手性结构.

配合物3在手性空间群P2₁2₁2₁和正交晶系中结晶. 同样, 它也表现出手性结构. Cu中心与N₂Cl₂O配位原子形成五配位构型, 其τ值计算为0.197^[22], 因此铜中心周围的几何形状可以描述为变形的四方棱锥. 一个亚胺N(1)原子、一个吡啶N(2)原子和两个Cl原子构成平面四方形, 而O(1)原子占据顶端.

2.2 MTT实验

MTT法是一种常用的测量细胞增殖和细胞毒性的方法. 用奥沙利铂作阳性对照, 检测了配合物1~3及相关化合物对系列细胞的毒性. 如表1所示, 这三种配合物对肿瘤细胞的细胞毒性比单个无机盐和配体高得多. 此外, 配合物1和2在这些化合物中表现出强的抗增殖活性, 特别是其对HeLa细胞的抑制作用远强于阳性对照. 2对HepG-2细胞也表现出很强的毒性, IC₅₀值为13.59 μmol/L, 与奥沙利铂的细胞毒性相当. 另外, 我们绘制了不同浓度和时间段下的配合物2对HeLa和HepG-2细胞的抑制率(图2), 发现随着时间的增加, 配合物2对肿瘤细胞的抑制率逐渐增加, 并且也表现出良好的浓度依赖性. 值得注意的是, 配合物2对正常细胞HUVEC的毒性远低于阳性对照的. 因此, 我们选择配合物2作用于HeLa和HepG-2细胞进行后续实验研究.

表1 化合物作用测试细胞系48 h的IC₅₀值

Table 1 IC₅₀values of the compounds against the tested cell lines for 48 h

Compound	IC₅₀^a/(μmol•L⁻¹)
Compound	HeLa	NCI-H460	BGC-823	HepG-2	HUVEC
Oxaliplatin	48.48±0.22	35.10±0.74	9.16±0.19	12.21±3.17	10.64±3.68
1	29.96±3.11	28.88±4.49	26.34±4.54	28.72±1.98	23.15±2.09
2	22.36±3.96	31.26±0.78	19.20±2.47	13.59±1.00	20.08±1.45
3	48.88±1.12	44.43±2.41	44.83±2.12	30.54±1.24	72.436
L¹	>100	>100	>100	>100	—
L²	>100	>100	>100	>100	—
CuBr₂	161.5	106.0	84.7	117.7	—
CuCl₂	142.0	106.8	88.9	102.3	—

^a Oxaliplatin was used as a positive control. Data are presented as half maximal inhibitory concentration (IC₅₀) value and 95% confidence intervals (CI 95%) from three independent experiments performed in triplicate. Malignant cell line: HeLa, NCI-H460, BGC-823, HepG-2. Non-malignant cell line: HUVEC.

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图2 作用时间分别在24、48、72 h时, 不同浓度配合物2作用HeLa (a)和HepG-2 (b)细胞毒性的影响

Figure 2 The effect of time on the cytotoxicity of the complex 2 against HeLa (a) and HepG-2 (b) cells for 24, 48 and 72 h, respectively

2.3 溶解性和稳定性

配合物均溶解在二甲基亚砜(DMSO)-H₂O混合溶剂中, 使用1.0×10⁻³mol/L(10% DMSO)的储备溶液进行抗肿瘤实验. 用高分辨质谱(HRMS)检测了配合物在水溶液相中的稳定性(支持信息图S1), 结果表明配合物1和2的质谱非常相似, 基本峰分别归属为配合物1阳离子(m/z=518.9815, [CuL¹Br]⁺)和2(m/z=517.0429, [CuL¹Cl]⁺). 配合物3的质谱特征峰为分子离子峰(m/z=588.1138, [CuL²]⁺). 另外, 紫外吸收光谱也用于测试配合物在水溶液中的稳定性. 如支持信息图S2所示, 配合物2的吸收峰值和峰形在不同时间间隔(0~96 h)没有明显变化, 也没有出现新的吸收峰, 表明配合物的结构在溶液中没有变化, 在水溶液(2% CH₃CN)中表现出良好的稳定性.

2.4 Hoechst 33342染色实验

赫斯特(Hoechst 33342)染色是一种广泛使用的检测细胞凋亡的方法, 可以清楚直观地观察细胞凋亡的存在. 凋亡细胞表现出形态变化及细胞收缩, 并增强膜通透性^[23], 其会导致更多的染料进入细胞而呈现强荧光. 如图3所示, 在对照组中, 我们观察到微弱的蓝色荧光. 配合物2与细胞孵育24 h后蓝色荧光强度均明显提高, HeLa细胞中显示出比阳性对照组更强的蓝色荧光; HepG-2细胞呈现出与阳性对照组相近强度的亮蓝色荧光. 通过Image J软件初步分析相对荧光强度, 结果显示对照组和治疗组之间存在显著差异, 阳性对照组和治疗组之间差异不显著, 表明2的抗癌活性与阳性对照组奥沙利铂相当. 实验结果初步表明配合物2通过凋亡途径导致细胞死亡, 与阳性对照组相比, 2呈现出的凋亡活性与MTT法的结果基本一致.

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图3 Hoechst 33342染色检测配合物2 (20 μmol/L)对HeLa和HepG-2细胞形态24 h的影响以及相对荧光强度的光密度值(10×10). 注: 数据表示为三组独立实验的平均值±标准差. p<0.05, p<0.01, p<0.001, ****p<0.0001, ns=非显著性差异(non-significant)

Figure 3 Hoechst 33342 staining to detect the effect of complex 2 (20 μmol/L) on the morphology of HeLa and HepG-2 cells for 24 h and the optical density value of the relative fluorescence intensity (10×10). Note: Data are expressed as mean ± standard deviation of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, ns=non-significant

2.5 细胞内ROS的产生

细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)水平的变化是细胞凋亡过程中的早期现象. 常用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针法来检测细胞内ROS浓度的变化^[24-25]. 如果被测细胞中呈现出大量绿色荧光, 则表明2',7'-二氯二氢荧光素(DCFH)已被ROS氧化为具有荧光的2',7'-二氯荧光素(DCF), 间接证明该作用过程中细胞内有大量ROS的产生. 由于配合物2对HeLa和HepG-2细胞具有很强的抑制作用, 因此我们用其验证该作用过程中是否伴随着细胞内ROS水平的增加. 图4显示了用不同浓度的配合物2处理癌症细胞, 并用DCFH-DA探针来进行检测, 发现随着药物浓度的增大, 绿色荧光越强. 运用Image J软件初步分析了绿色荧光的相对荧光强度, 治疗组呈现出远超越对照组的绿色荧光, 且具有浓度依赖性增加, 表明配合物2能提高癌症细胞内活性氧的水平. 基于上述结果, 我们推测配合物2可能通过增加细胞内ROS水平诱导细胞凋亡.

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图4 DCFH-DA探针染色, 测定配合物2对HeLa、HepG-2细胞24 h ROS产生的影响, 以及相对荧光强度的光密度值(10×10)

Figure 4 DCFH-DA probe staining to determine the effect of complex 2 on ROS production in HeLa, HepG-2 cells for 24 h, and the optical density value of the relative fluorescence intensity (10×10)

2.6 线粒体膜电位

线粒体膜电位的紊乱可导致线粒体功能障碍, 线粒体膜电位的降低有时可能是由ROS水平升高引起的,其与细胞凋亡过程密切相关. 亲脂性阳离子可以通过静电相互作用被吸引到线粒体, 并在负膜电位下积聚在线粒体基质中^[26-27]. 许多配合物均含有易解离的阴离子, 在水溶液中, 配合物的内界常以阳离子片段稳定存在, 使其更倾向于靶向线粒体^[28-30]. 在此基础上, 我们进一步评估了配合物2引起的细胞内ROS水平上调是否会影响线粒体膜电位. 我们用JC-1作为荧光探针来检测细胞内线粒体膜电位的变化. JC-1是一种常用的阳离子羰基菁染料, 以聚集体的形式存在于线粒体基质中, 当活细胞的线粒体膜电位高时会发出红色荧光. 在凋亡细胞中, 线粒体膜电位经历去极化, 导致膜电位降低, 而JC-1以单体的形式存在并发出绿色荧光^[31]. 因此, 我们可以直观地通过观察细胞红色和绿色荧光的变化来确定是否发生凋亡. 实验结果如图5所示, 对照组的HeLa和HepG-2细胞均发出大量红色荧光, 表明大多数细胞存活良好, 线粒体膜电位很高. 在治疗组中, 红色荧光以浓度依赖的方式逐渐减少, 绿色荧光逐渐增加. Image J软件用于分析红色和绿色荧光的相对荧光强度, 表明配合物2可以显著降低线粒体膜电位, 因此我们得出结论, 配合物2可能通过线粒体途径诱导细胞凋亡.

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图5 JC-1测定配合物2对HeLa、HepG-2细胞线粒体膜电位24 h的影响, 及相对荧光强度的光密度值(10×10) (a: HeLa细胞, b: HepG-2细胞)

Figure 5 The effect of complex 2 on mitochondrial membrane potentials of HeLa, HepG-2 cells for 24 h were determined with JC-1 and the optical density value of the relative fluorescence intensity (10×10) (a: HeLa cells, b: HepG-2 cells)

2.7 Annexin V-mCherry细胞凋亡

配合物2的凋亡分析采用膜联蛋白Ⅴ-红色荧光蛋白(Annexin V-mCherry)凋亡检测试剂盒检测. 在正常细胞中, 磷脂酰丝氨酸(PS)分布于细胞膜内侧, 当细胞处于凋亡早期时, 细胞膜的不对称性被破坏, PS外翻至膜外侧. 而Annexin V可选择性结合凋亡细胞膜外表面的PS^[32-33]. 因此用Annexin V-mCherry的荧光强度反映细胞凋亡程度. 从结果(图6)中可看出, 随着配合物2浓度的增加, 细胞膜红色荧光不断增强, 发生细胞凋亡的细胞不断增多, 这些发现表明, 配合物2可诱导HepG-2细胞发生凋亡.

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图6 Annexin V-mCherry染色检测配合物2诱导的HepG-2细胞凋亡

Figure 6 Annexin V-mCherry staining detects complex 2 induced apoptosis in HepG-2 cells

2.8 细胞周期阻滞分析

细胞周期阻滞可显著抑制细胞增殖, DNA在细胞周期过程中起着至关重要的作用^[34]. 为了确定配合物2对HepG-2细胞的生长抑制作用是否是由于细胞周期阻滞引起的, 我们使用流式细胞术评估了配合物作用于细胞后的肿瘤细胞周期分布, 并计算了细胞周期各阶段的百分比. 如图7所示, HepG-2细胞的细胞周期进程在S期和G2/M期受到抑制, S期百分比分别为20.77%(未处理)、27.89% (15 μmol/L)和31.90% (20 μmol/L), G2/M期百分比从5.54%增加到7.24%, G1期百分比从73.68%降低到60.85%, 并伴有药物浓度依赖性. 因此可以得出结论, 配合物2可以阻滞细胞周期的S期和G2/M期(DNA合成期和DNA合成后期)的进程, 表明细胞周期阻滞在配合物2对HepG-2细胞的抑制作用中起着重要作用.

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图7 流式细胞术检测配合物2对HepG-2细胞作用24 h细胞周期的影响

Figure 7 Flow cytometry detection of the effect of complex 2 on HepG-2 cell cycle for 24 h

2.9 细胞摄取

细胞内药物的积累对抗癌效果至关重要^[35], 提高细胞对药物的摄取可能是提高抗癌效果的关键. 因此, 我们使用电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)检测配合物2对HepG-2的细胞摄取能力. 结果如图8所示, 用配合物2处理细胞24 h后, HepG-2细胞中铜的积累明显高于对照组. 在对照组中, 每百万个细胞的铜含量约为153 ng, 而在治疗组中, 铜含量显著增加到约3340 ng. 因此我们得出结论, 通过增加细胞内铜含量的积累可以抑制细胞增殖, 配合物2的强细胞毒性可能是由于其在HepG-2细胞中的广泛积累所致.

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图8 配合物2作用HepG-2细胞24 h后铜摄取柱状图, p<0.01 (左); 铜摄取统计数据(右)**

Figure 8 Histogram of copper uptake in HepG-2 cells treated with complex 2 for 24 h, **p<0.01 (left); Statistical data of copper uptake (right)

2.10 迁移和侵袭

癌症细胞转移是由其对其他器官的侵袭引起的, 细胞迁移和侵袭是癌症患者死亡的主要原因之一. 因此, 药物抑制癌症细胞的迁移和侵袭是评价药物抗癌疗效的重要策略. Transwell小室是一种常用的体外检测肿瘤细胞侵袭能力的方法^[36-37]. 配合物2抑制HeLa和HepG-2细胞迁移和侵袭的实验结果如图9所示. 迁移实验表明, 由于下室中高浓度血清培养基的诱导, 对照组中有更多的细胞到达下室. 用配合物2处理后, 到达下室的细胞数量逐渐减少. 对通过的HeLa和HepG-2细胞进行计数, 发现与对照组相比, 约60%的细胞没有通过腔室, 表明2可以有效地抑制癌症细胞的迁移. 在侵袭实验中, 癌细胞需要分泌基质金属蛋白酶来消化上室中的基质胶, 以便从上室到达下室. 与对照组相比, 实验组到达下室的细胞数量显著减少. 因此, 我们推测2可能会抑制细胞内基质金属蛋白酶的产生, 使癌细胞无法穿透基质并最终抑制其侵袭能力. 另外, 治疗组与阳性对照组表现通过Image J软件对到达下室的细胞数量进行统计, 结果显示对照组和治疗组之间存在极显著差异, 因此, 我们推断配合物2可以有效地抑制癌细胞的迁移和侵袭.

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图9 配合物2对HeLa和HepG-2细胞迁移和侵袭的影响以及通过腔室的细胞数量(10×10). 注: 数据表示为三组独立实验的平均值±标准差. **p<0.01, ##p<0.01 (a: HeLa细胞, 20 μmol/L Oxaliplatin, 20 μmol/L 2; b: HepG-2细胞, 15 μmol/L Oxaliplatin, 15 μmol/L 2)

Figure 9 The effect of complex 2 on HeLa and HepG-2 cells migration and invasion and the number of cells passing through the chamber (10×10). Note: The data is represented as mean ± standard deviation of three independent experiments. **p<0.01, ##p<0.01 (a: HeLa cells, 20 μmol/L Oxaliplatin, 20 μmol/L 2; b: HepG-2 cells, 15 μmol/L Oxaliplatin, 15 μmol/L 2)

2.11 体外血管生成

大多数恶性肿瘤具有密集的血管生成和快速生长速度等特征. 因此, 血管生成在肿瘤的发展和转移中起着重要作用, 抑制这一过程可以显著防止肿瘤细胞的迁移和侵袭. 使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)可以有效地模拟体外肿瘤血管生成的过程^[38-40]. 如图10所示, 体外血管生成实验表明, 在配合物2作用下, HUVEC细胞原本相对完整的管腔结构在6 h后略有解体, 9 h后大量管腔结构坍塌. 然而, 对照组的毛细血管结构在9 h时仍保持相对完整. 通过Image J软件统计分析了9 h时的血管分支数量和血管总长度, 发现配合物2对血管分支数量有显著的抑制作用. 结果表明, 配合物2在体外可以抑制HUVEC细胞的血管生成.

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**图10 配合物2 (20 μmol/L)对HUVEC细胞血管生成的影响(10×4), 血管分支数量和血管总长度的统计. 注: 数据表示为三组独立实验的平均值±标准差. *p<0.05, p<0.01

Figure 10 The effect of complex 2 (20 μmol/L) on the angiogenesis of HUVEC cells and the number of vascular branches and the total length of vessels (10×4). Note: Data are expressed as mean ± standard deviation of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01

2.12 分子对接

采用AutoDock Vina 1.1.2进行半柔性对接^[41]. 血管内皮细胞生长因子受体2 (VEGFR2)是血管内皮细胞生长因子(VEGF)主要的信号受体. 尽管VEGF结合VEGFR1的亲和力高于VEGFR2, 然而多数功能活性是由VEGF与肿瘤内皮上的VEGFR2结合引起的. VEGFR2的强酪氨酸激酶和促血管生成活性对肿瘤生长的血管生成起到关键作用^[42]. 通过对配合物2与VEGFR-2(PDB ID: 2XIR)进行分子对接^[43], 结果(图11)显示其与该蛋白质活性中心的最佳结合能为－28.87 kJ/mol, 表明配合物2与VEGFR2有良好的结合能力, 配合物2与VEGFR-2中位于活化环附近的ILE1044ASP1046氨基酸形成氢键, 这可能影响激酶的构象变化和活性, 并在活性部位口袋区域显示出显著的相互作用. 与前期配合物2抑制血管形成的实验结果相契合.

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图11 配合物2与VEGFR2结合的分子对接图

Figure 11 Docking analysis visualization of VEGFR2 binding with complex 2

3 结论

本工作共合成了两例手性氨基糖修饰的吡啶类配体和三例相应的铜配合物, 并通过傅立叶变换红外光谱、核磁共振波谱、高分辨率质谱和X射线单晶衍射对其结构进行了表征. MTT法显示, 配合物2对HepG-2细胞表现出强的毒性, IC₅₀值为13.59 μmol/L, 相当于阳性对照的药效. 且配合物2在水溶液中具有良好的溶解性和稳定性. Hoechst 33342染色结果初步表明, 配合物2通过凋亡途径导致细胞死亡, 与阳性对照组相比, 2的作用与MTT法的结果基本一致. 我们通过细胞内ROS产生、线粒体膜电位和Annexin V-mCherry实验进一步证明, 配合物2诱导细胞死亡的机制是凋亡. 配合物2可以延迟或抑制细胞周期通过S期和G2/M期的进展. 细胞摄取实验表明, 配合物2的强细胞毒性可能是由于其在HepG-2细胞中的广泛积累. 此外, 2能有效抑制癌症细胞的迁移和侵袭, 在体外还能抑制HUVEC细胞的血管生成. 配合物2与VEGFR-2的分子对接结果显示最佳结合能为－28.87 kJ/mol, 表明二者有良好的结合能力. 综上所述, 配合物2是一种具有优良抗癌活性和潜在应用价值的药物.

4 实验部分

4.1 材料和测试

有关化学、生物试剂及测试仪器的来源, 请参见支持信息(Supporting Information).

4.2 配体和配合物的合成

按照图式1所示的路线合成中间体1~2、配体L¹~L²及三例相关的Cu(II)配合物1~3.

4.2.1 中间体1的合成

中间体1的合成参照文献^[12,44-45]. 将32.00 g D-氨基葡萄糖盐酸盐和150 mL乙酰溴加入250 mL烧瓶中. 将混合物在室温下避光搅拌3 d, 直至反应完全. 将母液旋干即可得棕色固体粗产物, 向粗产物中加入热的氯仿(用五氧化二磷处理过的), 直至粗产物全部溶解, 趁热将其抽滤至500 mL圆底烧瓶中去, 待溶液冷却后, 加入脱水乙醚(乙醚用活化的分子筛处理, 分子筛用马弗炉在350 ℃下活化6 h), 直至溶液中的白色沉淀全部析出, 用反应液洗涤三次, 过滤并收集固体, 得到白色溴代乙酰化氨基葡萄糖溴酸盐60.54 g, 产率91.08%.

将3.85 g溴代乙酰化氨基葡萄糖溴酸盐与二氯甲烷溶解在250 mL烧瓶中, 向反应溶液中加入1.81 mL叠氮基三甲基硅烷, 片刻后加入2.90 g相转移催化剂四丁基硫酸氢铵和30 mL饱和碳酸氢钠溶液, 充分搅拌, 室温下反应8 h. 薄层色谱(TLC)检测反应进程. 反应结束后向反应体系中加入15 mL二氯甲烷, 用40 mL蒸馏水萃取三次, 收集有机层, 无水Na₂SO₄干燥4 h. 过滤后、将反应液旋干后, 加入20 mL无水乙醇进行重结晶. 然后, 冷却以沉淀产物, 过滤并得1.24 g中间体1, 产率为40.30%. FI-IR (KBr) ν: 3380, 2112, 1747, 1382, 1238, 1105, 1041, 907, 566, 479 cm⁻¹ (支持信息图S3, 其中2112为-N₃基团伸缩振动峰, 1747为-OAc的C=O伸缩振动峰).

4.2.2 中间体2的合成

将1.0 mL水杨醛溶解在60 mL乙腈中, 缓慢加入2.52 g K₂CO₃水溶液, 连续搅拌回流40 min, 然后缓慢加入1.87 g 2-氯甲基吡啶盐酸盐. 回流3 h, 使用TLC监测反应. 滤液用二氯甲烷萃取三次, 合并有机相, 用无水Na₂SO₄干燥过夜. 过滤后, 旋转蒸发浓缩滤液, 得到黄色油状液体, 通过硅胶柱色谱进一步纯化, 得到0.95 g白色醚中间体2, 产率为45% ^[46]. FI-IR (KBr) ν: 3075, 3045, 2919, 2866, 2762, 1686, 1593, 1033, 755, 667, 525, 441 cm⁻¹ (图S3, 其中1686为醛基C=O伸缩振动峰).

4.2.3 配体L¹的合成

将1.51g中间体1加入至250 mL烧瓶中, 加入25 mL无水甲醇和45 mL无水乙醇, 搅拌至固体完全溶解. 移取0.40 mL吡啶-2-甲醛, 在冰水浴条件下搅拌, 直至烧瓶中出现大量固体沉淀. 用TLC跟踪反应, 过滤得到粗产物. 加入20 mL无水乙醇重结晶, 得到1.41 g配体L¹(图1), 收率93.48%, 熔点137.4~139.0 ℃. ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 8.67 (ddd, J=4.8, 1.7, 1.0 Hz, 1H), 8.35 (s, 1H), 7.99 (dt, J=7.9, 1.1 Hz, 1H), 7.81~7.73 (m, 1H), 7.37 (ddd, J=7.6, 4.9, 1.3 Hz, 1H), 5.42 (t, J=9.6 Hz, 1H), 5.20~5.12 (m, 1H), 5.09 (d, J=8.7 Hz, 1H), 4.37 (dd, J=12.4, 4.8 Hz, 1H), 4.21 (dd, J=12.4, 2.2 Hz, 1H), 3.95 (ddd, J=10.1, 4.7, 2.2 Hz, 1H), 3.43~3.36 (m, 1H), 2.13 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 1.91 (s, 3H) (支持信息图S4). ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 170.7, 169.7, 166.6, 153.5, 149.6, 136.8, 125.5, 121.9, 89.3, 74.1, 73.4, 72.8, 68.0, 62.0, 20.8, 20.7, 20.5 (图S4). FI-IR (KBr) ν: 2119, 1748, 1649, 1366, 1248, 1050, 1036, 609 cm⁻¹ (图S3, 其中2119为-N₃基团伸缩振动峰, 1748为-OAc的C=O伸缩振动峰, 1649为C=N伸缩振动峰). HRMS (ESI) calcd for C₁₈H₂₁N₅O₇+H⁺ 420.1514, found 420.1512.

4.2.4 配体L²的合成

烧瓶中加入2.00 g中间体1, 并将其溶解在50 mL无水甲醇中, 加入1.02 g中间体2, 在室温下搅拌, 直至沉淀完全. 1 h后, 减压过滤. 用反应液洗涤沉淀, 得到粗产物, 无水甲醇重结晶, 得到1.32 g配体L², 产率为89%, 熔点161.1~163.0 ℃. ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 8.81 (s, 1H), 8.62 (ddd, J=4.9, 1.8, 0.9 Hz, 1H), 7.91 (dd, J=7.7, 1.8 Hz, 1H), 7.76 (td, J=7.7, 1.8 Hz, 1H), 7.49 (d, J=6.0 Hz, 1H), 7.39 (td, J=7.8, 1.8 Hz, 1H), 7.30~7.24 (m, 1H), 7.01 (t, J=7.5 Hz, 1H), 6.97 (d, J=8.3 Hz, 1H), 5.40 (t, J=9.6 Hz, 1H), 5.27 (s, 2H), 5.14 (t, J=9.8 Hz, 1H), 5.07 (d, J=8.7 Hz, 1H), 4.37 (dd, J=12.3, 4.8 Hz, 1H), 4.20 (dd, J=12.3, 2.2 Hz, 1H), 3.94 (ddd, J=10.2, 4.8, 2.2 Hz, 1H), 3.36 (t, J=9.2 Hz, 1H), 2.12 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.88 (s, 3H) (图S4). ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ: 170.7, 169.8, 169.0, 161.7, 157.9, 156.6, 149.4, 137.0, 133.0, 128.0, 124.1, 122.9, 121.5, 121.1, 112.4, 80.6, 74.1, 73.9, 73.1, 71.0, 68.1, 62.0, 20.8, 20.7, 20.5 (图S4). FI-IR (KBr) ν: 3452, 2878, 2110, 1737, 1632, 1380, 1363, 1243, 1224, 1041, 759.03 cm⁻¹ (图S3, 其中2110为-N₃基团伸缩振动峰, 1737为-OAc的C=O伸缩振动峰, 1632为C=N伸缩振动峰). HRMS (ESI) calcd for C₂₅H₂₇N₅O₈+H⁺ 526.1932, found 526.1935.

4.2.5 配合物1的合成

称取0.042 g配体L¹至50 mL烧瓶中, 加入12 mL无水甲醇溶液、8 mL无水乙醇溶液和3 mL乙腈. 加入0.067 g CuBr₂并充分搅拌. 回流1 h, 搅拌至室温, 过滤并保留滤液, 缓慢蒸发, 5 d后, 沉淀出六边形紫色晶体配合物1. FI-IR (KBr) ν: 3431, 2131, 1738, 1703, 1596, 1368, 1258, 1217, 1072, 768 cm⁻¹ (图S3, 其中2131为-N₃基团伸缩振动峰, 1738、1703为-OAc的C=O伸缩振动峰, 1634为C=N伸缩振动峰). HRMS (ESI) calcd for C₁₆H₁₉BrCuN₅O₆⁺ 518.9815, found 518.9815.

4.2.6 配合物2的合成

称取0.042 g 配体L¹于50 mL烧瓶中, 加入10 mL无水甲醇溶液和10 mL无水乙醇溶液使其完全溶解, 加入0.051 g CuCl₂•2H₂O使其充分混合. 在室温下搅拌1 h, 过滤并保留滤液, 缓慢蒸发, 3 d后, 得六边形绿色晶体配合物2. FI-IR (KBr) ν: 3428, 2974, 2894, 2132, 1754, 1738, 1705, 1597, 1373, 1369, 1268, 1218, 1090, 1051, 1039, 881, 769, 645 cm⁻¹ (图S3, 其中2132为-N₃基团伸缩振动峰, 1754、1738、1705为-OAc的C=O伸缩振动峰, 1636为C=N伸缩振动峰). HRMS (ESI) calcd for C₁₈H₂₁ClCuN₅O₇⁺ 517.0426, found 517.0429.

4.2.7 配合物3的合成

称取0.050 g配体L²于50 mL烧瓶中, 加入12 mL甲醇和8 mL乙醇, 搅拌溶解, 加入0.051 g CuCl₂•2H₂O, 继续搅拌1 h, 过滤, 缓慢蒸发滤液, 7 d后得到适合X射线衍射的深蓝色棱柱状晶体配合物3 (图1). FI-IR (KBr) ν: 3380, 2124, 1745, 1618, 1383, 1241, 1044, 766 cm⁻¹ (图S3, 其中2124为-N₃基团伸缩振动峰, 1745为-OAc的C=O伸缩振动峰, 1618为C=N伸缩振动峰). HRMS (ESI) calcd for C₂₅H₂₇CuN₅O₈⁺ 588.1156, found 588.1138.

4.3 实验方法

有关X射线晶体学、MTT法、Hoechst 33342染色、细胞内ROS产生、线粒体膜电位、Annexin V-mCherry细胞凋亡、细胞周期、细胞摄取、Trans-Well、血管生成和分子对接的完整实验方法, 请参见支持信息.

(Cheng, B.)

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序

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Abstract

1 引言

图式1 配体L1、L2和铜配合物1~3的合成路线

2 结果与讨论

2.1 晶体结构

图1 L1和配合物3的晶体结构图. 为了清晰可见, 所有的氢原子及外界甲醇和水溶剂已省略

2.2 MTT实验

表1 化合物作用测试细胞系48 h的IC50值

图2 作用时间分别在24、48、72 h时, 不同浓度配合物2作用HeLa (a)和HepG-2 (b)细胞毒性的影响

2.3 溶解性和稳定性

2.4 Hoechst 33342染色实验

图3 Hoechst 33342染色检测配合物2 (20 μmol/L)对HeLa和HepG-2细胞形态24 h的影响以及相对荧光强度的光密度值(10×10). 注: 数据表示为三组独立实验的平均值±标准差. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, ns=非显著性差异(non-significant)

2.5 细胞内ROS的产生

图4 DCFH-DA探针染色, 测定配合物2对HeLa、HepG-2细胞24 h ROS产生的影响, 以及相对荧光强度的光密度值(10×10)

2.6 线粒体膜电位

图5 JC-1测定配合物2对HeLa、HepG-2细胞线粒体膜电位24 h的影响, 及相对荧光强度的光密度值(10×10) (a: HeLa细胞, b: HepG-2细胞)

2.7 Annexin V-mCherry细胞凋亡

图6 Annexin V-mCherry染色检测配合物2诱导的HepG-2细胞凋亡

2.8 细胞周期阻滞分析

图7 流式细胞术检测配合物2对HepG-2细胞作用24 h细胞周期的影响

2.9 细胞摄取

图8 配合物2作用HepG-2细胞24 h后铜摄取柱状图, **p<0.01 (左); 铜摄取统计数据(右)

2.10 迁移和侵袭

图9 配合物2对HeLa和HepG-2细胞迁移和侵袭的影响以及通过腔室的细胞数量(10×10). 注: 数据表示为三组独立实验的平均值±标准差. **p<0.01, ##p<0.01 (a: HeLa细胞, 20 μmol/L Oxaliplatin, 20 μmol/L 2; b: HepG-2细胞, 15 μmol/L Oxaliplatin, 15 μmol/L 2)

2.11 体外血管生成

图10 配合物2 (20 μmol/L)对HUVEC细胞血管生成的影响(10×4), 血管分支数量和血管总长度的统计. 注: 数据表示为三组独立实验的平均值±标准差. *p<0.05, **p<0.01

2.12 分子对接

图11 配合物2与VEGFR2结合的分子对接图

3 结论

4 实验部分

4.1 材料和测试

4.2 配体和配合物的合成

4.2.1 中间体1的合成

4.2.2 中间体2的合成

4.2.3 配体L1的合成

4.2.4 配体L2的合成

4.2.5 配合物1的合成

4.2.6 配合物2的合成

4.2.7 配合物3的合成

4.3 实验方法

参考文献

图式1 配体L¹、L²和铜配合物1~3的合成路线

图1 L¹和配合物3的晶体结构图. 为了清晰可见, 所有的氢原子及外界甲醇和水溶剂已省略

表1 化合物作用测试细胞系48 h的IC₅₀值

图3 Hoechst 33342染色检测配合物2 (20 μmol/L)对HeLa和HepG-2细胞形态24 h的影响以及相对荧光强度的光密度值(10×10). 注: 数据表示为三组独立实验的平均值±标准差. p<0.05, p<0.01, p<0.001, ****p<0.0001, ns=非显著性差异(non-significant)

图8 配合物2作用HepG-2细胞24 h后铜摄取柱状图, p<0.01 (左); 铜摄取统计数据(右)**

**图10 配合物2 (20 μmol/L)对HUVEC细胞血管生成的影响(10×4), 血管分支数量和血管总长度的统计. 注: 数据表示为三组独立实验的平均值±标准差. *p<0.05, p<0.01

4.2.3 配体L¹的合成

4.2.4 配体L²的合成