1 引言
急性疼痛作为一种保护性生理反应, 主要源于伤害性感受器受到刺激后激活瞬时受体电位通道(TRPV1/TRPA1)等离子通道, 并伴随前列腺素、缓激肽等炎症介质的快速释放. 当疼痛信号在组织损伤修复后仍持续通过外周敏化与中枢敏化途径进行传递时, 生理性疼痛将转化为病理性慢性疼痛. 此类病理状态与酸敏感离子通道(如ASIC1)、电压门控钠通道(如Nav1.7)等离子通道功能异常密切相关, 临床表现为神经病理性疼痛、炎性疼痛等多种形式, 还会诱发焦虑、抑郁等共病. 慢性疼痛是威胁人类健康的全球性问题, 根据国际疼痛协会的流行病学调查数据, 全世界约20%的人口遭受过慢性疼痛的困扰. 《中国疼痛医学发展报告(2020)》进一步显示, 我国慢性疼痛患者已突破3亿, 并呈现出发病率逐年上升和患者年轻化的趋势, 遗憾的是, 现有治疗手段对慢性疼痛的完全缓解率不足20%[1].
阿片类药物(如吗啡、芬太尼等)因其高效的镇痛效果被广泛应用于急性疼痛或中短期慢性疼痛的治疗中, 主要通过激活中枢或外周μ-阿片受体(MOR)阻断疼痛信号传递. 然而, 这类药物可以穿越血脑屏障的特性导致了呼吸抑制、恶心、成瘾性等一系列严重的中枢神经系统不良反应[2]. 美国国家药物滥用统计中心的数据显示, 2024年约10万人因药物过量死亡, 其中大部分与阿片类药物有关[3]. 相比之下, 非甾体抗炎药(NSAIDs)通过抑制环氧合酶(COX)减少前列腺素合成, 主要在外周发挥镇痛作用, 但其羧酸/烯醇酸基团对COX-1的非选择性抑制可损伤胃肠道黏膜屏障, 增加消化道出血风险, 同时还可能引发心血管事件、肾功能损害、肝毒性等不良反应[4]. 鉴于现有镇痛药物存在的显著局限性, 开发基于新型镇痛靶点、具有外周特异性并规避中枢副作用的高效镇痛剂已成为当前疼痛治疗领域急需解决的关键问题.
组织酸中毒作为多种病理条件下的常见微环境变化, 是诱发持续性疼痛的重要因素之一. 这一过程中, 在伤害性感觉神经元上表达的酸敏感离子通道(acid-sensing ion channel, ASIC)发挥着关键的疼痛感知作用. 研究表明, 在炎症或缺血等病理状态下, 长时间的组织酸化会诱导ASIC通道构象变化, 产生持续去极化电流, 引发非适应性疼痛. 作为质子门控的Na⁺/Ca²⁺通道, ASIC属于上皮钠通道(ENaC)/退化蛋白(DEG)离子通道超家族, 目前已鉴定出由基因ACCN1~4选择性剪接表达的6种亚基, 分别为ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4, 通过组成同源或者异源三聚体发挥作用[5-7]. 其中ASIC2b和ASIC4对质子刺激不敏感, 主要作为调节亚基影响异源三聚体通道的功能特性[8-9]. 从分布和功能角度来看, ASIC3在外周感觉神经元中高度表达, 在炎症性疼痛和内脏痛的发生发展过程中起核心作用[10], 与外周痛觉敏化有关; 而ASIC1a主要参与中枢神经系统疼痛敏化过程, 与神经病理性疼痛密切相关[11]. 由于ASIC在疼痛信号初始触发环节的关键作用, 且其作用机制不涉及阿片受体系统, 针对ASIC的靶向干预不仅能够有效阻断疼痛信号传导, 还能规避阿片类药物常见的中枢副作用, 因而被视为极具开发前景的新型镇痛靶点.
天然毒素肽凭借其独特的复杂二硫键网络与特异性结合基序, 已成为离子通道研究的热门分子探针, 并在临床药物开发中展现出重要价值. 典型代表是源于僧袍芋螺毒素, 靶向N型电压门控钙通道的齐考诺肽(Ziconotide), 在2004年被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗对传统全身镇痛药无效或不耐受的严重慢性疼痛患者[12]. 目前已获批准上市或处于临床研究的代表性毒素肽药物及其作用靶点可见表1. 近年来, 研究人员陆续发现了一系列对ASICs具有高亲和力的动物毒素肽, 包括特异性作用于ASIC1a的狼蛛毒素psalmotoxin 1 (PcTx1)[13], 靶向ASIC1的曼巴蛇毒Mambalgin (Mamb)[14]以及选择性结合ASIC3的海葵毒素APETx2[15]. 这些天然毒素肽因独特的靶向性和高效的通道调节能力, 被认为是开发新型镇痛药物的理想候选分子. 大量临床前研究证实了这些毒素肽的镇痛潜力, 例如在骨关节炎大鼠模型中, 关节腔内连续注射APETx2可以显著抑制继发性痛觉超敏[16]; 在偏头痛模型小鼠中, 静脉推注APETx2有效缓解了三叉神经痛相关症状[17]. 这些研究结果为基于天然毒素肽的镇痛药物开发提供了重要的实验依据.
表1 已上市或处于临床试验的毒素肽药物Table 1 Toxin-derived peptide drugs approved or under clinical trials |
| 名称 | 来源 | 用药方式 | 作用靶点/机制 | 主要适应症 | 临床状态 | 备注 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Cobratide (克痛宁) | 中华眼镜蛇 (Naja atra) | 静脉注射/口服 | 烟碱型乙酰胆碱受体阻断剂 | 慢性关节痛、坐骨神经痛、神经性 头痛 | 已上市 | 国药准字H53022101[27] |
| Ziconotide (Prialt®) | Conus magus | 鞘内注射 | Cav2.2通道 阻断剂 | 严重慢性疼痛 | 已上市 | New Drug Application (NDA): 021060[28] |
| μ-TRTX-Hhn1b (Halneuron) | Ornithoctonus hainana | 皮下注射 | 电压门控钠通道 Nav1.7抑制剂 | 化疗性神经性疼痛 | II期临床 | ClinicalTrials.gov ID: NCT06848348[29] |
| Tetrodotoxin | pufferfish | 肌内注射/皮下注射 | 电压门控钠通道 Nav阻断剂 | 中度或重度癌症疼痛、化疗性神经性疼痛 | Ⅱ/Ⅲ期临床 | ClinicalTrials.gov ID: NCT00726011/NCT00725114/NCT01655823[29] |
| ACV-1 (a-Vc1.1) | Conus victoriae | 皮下注射 | GABAB受体 激活剂 | 糖尿病性神经病变疼痛 | II期临床 | 因缺乏疗效而停止[30] |
| Contulakin-G (CGX-1160) | Conus geographus | 鞘内注射 | 神经降压素受体激活剂 | 神经病理性疼痛 | II期临床 | 因开发商公司破产而 停止[30] |
| Leconotide (ω-conotoxin CVID) | Conus catus | 鞘内注射 | Cav2.2通道 阻断剂 | 神经病理性疼痛 | Ⅰ/II期临床 | 因开发商公司破产而 停止[30] |
| Xen 2174 (c-CTX MrIA) | Conus marmoreus | 鞘内注射 | 作用于去甲肾上腺素转运体 | 术后疼痛 | II b期临床 | 已停止[30] |
毒素多肽作为重要的药理研究工具和潜在治疗药物, 其深入研究依赖于大量高纯度、结构稳定的样品获取. 天然提取方法受限于毒素来源稀缺且成分复杂、杂质组分干扰等问题, 导致生产成本高昂且产量难以满足需求. 化学合成技术为解决这一困境提供了有效途径, 通过固相合成(SPPS)或液相合成(LPPS)可以高效精准地构建短肽序列(<50个氨基酸), 并实现各种非天然修饰(如非天然氨基酸、环化结构、同位素标记等)的精确改造. 针对中等长度毒素多肽(50~100个氨基酸), 天然化学连接(NCL)、丝氨酸/苏氨酸连接(STL)以及肽酰肼连接等技术的应用显著拓展了合成范围[18-21]. 对于富含二硫键的复杂多肽, 通过正交保护基(如Acm、Trt、tBu等)、分步氧化、一锅法氧化、硒代半胱氨酸替代、氧化还原缓冲体系(如GSH/GSSG、DMSO等)以及半合成策略(如NCL结合酶法折叠等)等方式, 已实现二硫键的精准定位和高效形成[22-26]. 在此基础上, 应用分子伴侣辅助折叠或糖基化修饰以增强多肽的溶解性, 可以显著提升复杂毒素(如镜像蛋白)的合成效率[22].
随着天然毒素多肽结构的日益复杂化(>100个氨基酸), 传统化学合成方法在长链组装错误累积、折叠能垒、规模化成本等方面逐渐显现局限性. 在此背景下, 合成生物学策略展现出独特优势. 通过构建优化的异源表达系统(如大肠杆菌[31-36]、酵母[37-40]、哺乳动物细胞[41-42]等), 结合促溶标签、信号肽和翻译后修饰酶系的协同作用, 不仅显著提高了毒素多肽的表达水平, 还确保了其正确折叠和功能完整性. 这种生物合成方法具有成本可控、易于规模化的特点, 为毒素多肽的工业化生产开辟了新途径. 综合来看, 化学合成与生物合成并非相互排斥, 而是具有显著的互补性, 两者结合能够充分发挥各自优势, 共同推动毒素多肽从基础研究向临床应用转化的进程, 为新型多肽药物的开发提供强有力的技术支撑.
本文聚焦ASICs与以其为靶标的毒素肽药物, 系统梳理了该领域关于镇痛机制与生物合成技术的研究进展. 全文从分子结构特征与功能的角度出发, 深入探讨ASICs的靶向治疗价值, 详细分析靶向毒素肽的化学特性及其作用机制, 全面总结毒素肽的生物合成路线, 并对其成药性优化策略进行讨论. 通过整合国内外相关研究成果, 本文旨在为基于毒素肽的新型镇痛药物研发提供理论支撑, 推动有机化学与合成生物学的交叉创新, 助力我国原创镇痛药物的突破性发展.
2 ASICs的结构与功能
2.1 ASIC的分子结构
2007年, Jasti等[7]通过X射线晶体衍射技术成功解析了鸡源ASIC1 (cASIC1)在低pH条件下的三维结构(PDB号: 2qts, 分辨率0.19 nm), 首次揭示了ASIC通道独特的酒杯状拓扑构象. 功能性ASIC通道是由三个相同或不同ASIC亚基组成的同源/异源三聚体, 每个亚基均包含胞外结构域(extracellular domain, ECD)、跨膜结构域(transmembrane domain, TMD)及胞内结构域三大功能模块(图1 A、B). 其中, ECD为手握球状拓扑结构, 由拇指(Thumb)、手指(Finger)、指关节(Knuckle)、手掌(Palm)和β球(β-Ball)五个亚结构域构成, 是质子感知与毒素肽结合的核心区域[7]. 在拇指、手指和β球结构域之间存在一个富含酸性氨基酸残基的负电荷空腔, 被称为“酸性口袋”, 是ASIC最关键的质子传感器[7]. 除此之外, 手掌区域和TM1的前87个氨基酸同样参与质子激活调控[43]. 当质子与酸性口袋结合后, 阳离子可以通过横向开窗进入离子通道内部, 到达位于腕关节区域的细胞外前庭[44].
图1 ASIC通道的分子结构 (A)静息状态cASIC1三聚体侧面构象(PDB号: 6vtl); (B)静息状态cASIC1三聚体俯视构象; (C) cASIC1(灰色, PDB号: 6vtl)与hASIC1a(紫色, PDB号: 7cfs)单亚基结构差异对比Figure 1 Molecular structure of the ASIC channel (A) Lateral conformation of the resting state cASIC1 trimer (PDB ID: 6vtl); (B) Top view conformation of the resting state cASIC1 trimer; (C) Comparison of the structural differences between the single subunit structures of cASIC1 (grey, PDB ID: 6vtl) and hASIC1a (purple, PDB ID: 7cfs) |
腕关节(Wrist)作为ECD与TMD的关键枢纽, 其构象变化直接影响通道的开关状态, 其中拇指结构域与跨膜域的非共价作用以及手掌结构域β1、β12片层与跨膜螺旋的共价连接尤为重要[45-46]. 跨膜域中, 连续的TM1螺旋和被G-A-S带(G444、A445和S446)分隔的TM2螺旋共同组成了洞穴状三重对称离子渗透孔道. 位于跨膜域上1/3的G432~G436收缩区域形成了通道的门控结构, 而G-A-S带及其下方重入环的保守碱基H29~G30则决定了通道的离子选择性[47]. 虽然胞内域(包含N末端和C末端)已被证实与通道失活调控相关, 但其柔性结构特性导致目前尚未获得高分辨率的结构信息.
对于同一基因的不同剪接变体(如ASIC1a与1b、ASIC2a与2b), 结构差异主要集中在N端的前1/3区域, 包括胞内N端结构域、重入环、TM1(前臂和腕部区域)以及部分胞外环区域(手掌和β球的部分β片层及整个手指结构域)[44]. 目前蛋白质数据库(Protein Data Bank, PDB)中已报道的ASIC结构均为ASIC1亚型, 其他ASIC亚基的结构研究主要基于cASIC1模板进行同源建模. 未来通过更先进的实验技术直接解析这些ASIC亚型的精细结构, 将极大促进对毒素肽与ASIC通道相互作用分子机制的理解, 为阐明毒素肽在体内的药理学作用提供重要结构基础.
2.2 ASIC的门控机制
胞外质子浓度升高时, 质子与酸性口袋的羧基结合, 触发一系列构象变化. 结构分析表明, 这一过程促使α4、α5螺旋向通道核心移动, 其中α5螺旋发生12°的旋转, 将其羧基端锚定到邻近亚基的手掌结构域. 与此同时, 酸性口袋内的羧基间距缩短, 手指结构域的E239和D238分别与拇指结构域的D346和D350形成羧基-羧酸相互作用, 从而稳定了拇指、手指和手掌结构域之间的界面[7,49]. 酸性口袋的皱缩进一步激活ECD的构象重排, 表现为三个亚基围绕β球-手掌上部区域支架发生5°的逆时针协同旋转. 这一旋转运动导致手掌下部结构域向细胞膜方向弯曲, 其中β1和β12片层发生约0.4 nm的位移. 构象变化的级联效应最终传递至跨膜区域, TM1和TM2螺旋因此远离三重对称轴, 细胞外前庭随之扩大. 在此过程中, 门控区域收缩的残基同样产生偏移, 形成虹膜状开口, 为Na⁺离子从细胞外前庭通过失活门进入选择性过滤器提供了结构基础[47,50,52]. 在低pH条件下, Cl−可以结合拇指结构域以稳定酸性口袋构象, 进而调节离子通道的脱敏动力学和快速失活特性[51].
2.3 ASICs的病理功能与靶向优势
中枢神经系统(central nervous system, CNS)和外周神经系统(peripheral nervous system, PNS)在疼痛调控过程中表现出明显的组织特异性差异, 这种差异主要体现在不同ASIC亚基的组合表达模式上. 除ASIC1b外, 其余已知的ASIC亚基均在哺乳动物大脑中有不同程度的表达[57]. 同时, 各类ASIC亚基还广泛分布于血管平滑肌、椎间盘、膀胱和胃肠道等外周组织及其相关神经系统中[58-61]. 在大脑区域中, ASIC1a的表达最为丰富[62], 特别是在大脑皮层和脊髓等部位呈现高表达特征[63], 它不仅参与酸中毒诱导的神经元损伤和中枢敏化过程, 调节酸中毒引起的生理变化[64], 还在内脏器官疼痛信号传导中发挥重要作用[65-67]. 相比之下, ASIC1b主要在外周感觉神经元中选择性表达, 是外周伤害性感受的重要分子基础[68-69].
ASIC2在CNS中同样高表达[62], 其中ASIC2a的同源三聚体可以诱发微小电流并促进ASIC1a在大脑的表面运输[70-71], 而ASIC2b倾向于和其他ASIC亚基形成异源三聚体以调节通道活性[72-73]. 在PNS特别是背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)中, ASIC2与机械敏感性感觉神经元存在共定位现象, 表明其参与机械感觉和疼痛的调控过程[74-75]. ASIC3是PNS中最重要的功能表型, 主要定位于DRG中的伤害性感受神经元[76], 同时也表达于痒觉感受器、非伤害性低阈值机械感受器以及本体感受器中[77-79]. 由于ASIC3存在的初级传入伤害性神经元与皮肤、肌肉、骨骼、关节和内脏等外周器官组织形成广泛的神经连接, ASIC3成为炎性痛和肌肉痛的关键调控靶点[80-81]. ASIC4则主要定位于CNS, 作为调节亚基在异源通道中发挥作用[82-83].
近年来, 通过基因工程和药理学干预手段, ASIC通道在各种疼痛模型的病理生理学作用机制逐渐清晰. 在偏头痛、肌肉骨骼疼痛、神经病理性疼痛、内脏疼痛和炎症性疼痛等多种模型中, 不同ASIC亚基组成的通道表现出特定的功能特征[10,84-85]. 在偏头痛研究中发现, 硬脑膜应用酸性溶液可诱导实验动物脑干ASIC1a表达上调并增加挠头行为, 这些效应均可被PcTx1和阿米洛利显著抑制[86]; 同样, 在神经病理性疼痛模型中, Mamb-1的应用可明显改善坐骨神经慢性压迫损伤导致的机械痛敏和热痛敏[87], 这些结果提示ASIC1a参与了中枢神经系统中伤害性信息的传递过程, 是中枢敏化分子效应器的一部分. 在内脏疼痛模型中, 鞘内注射ASIC1a特异性抑制剂PcTx1可显著提高结肠高敏感大鼠的疼痛行为阈值[88], 说明ASIC1a在内脏疼痛信号传导过程起重要作用. 在PNS, ASIC1b特异性介导肌肉骨骼疼痛, 酸诱导的纤维肌痛模型显示, ASIC1b敲除可消除短暂痛觉过敏并显著缩短慢性痛程, 而Mamb-1能剂量依赖性地阻断该过程[89]. Walder等[10]的研究证实, ASIC1主要参与原发性肌肉痛觉过敏的发生, 而ASIC3与继发性足底痛觉过敏密切相关, 非选择性ASIC抑制剂A-317567能有效逆转肌肉炎症引起的原发性和继发性痛觉过敏.
ASIC3在肌肉酸中毒诱导的慢性痛觉过敏机制研究中受到广泛关注, 皮下注射利血平(reserpine)诱发大鼠纤维肌痛模型中, 其特异性阻断剂APETx2不仅可以逆转疼痛行为, 还能抑制DRG中ASIC3的表达[90]. 此外, ASIC3还与NO诱导的偏头痛病理过程相关, APETx2应用后有效抑制了大鼠三叉神经尾侧核神经元的过度兴奋以及NO诱发的伤害性感受[17]. 在关节炎模型中, 关节滑液pH下降引发的长时程痛觉过敏可通过关节内注射APETx2缓解, 提示ASIC3在酸诱导关节痛觉过敏形成过程中的关键作用[91]. 食道扩张内脏痛动物模型研究进一步揭示, ASIC3和降钙素基因相关肽共同介导DRG的高敏化过程, 从而导致内脏痛觉过敏的发生[92]. 这些研究结果为深入理解ASIC通道在各类疼痛中的分子机制提供了重要实验依据.
ASIC通道是疼痛病理机制中必不可缺的一环, 作为治疗靶标具有独特的优势. 从作用机制来看, 靶向ASIC可以精准阻断酸中毒诱导的疼痛信号源头, 实现病因性治疗而非单纯症状缓解. 相较于阿片类药物可能导致的呼吸抑制等中枢副作用, ASIC不参与呼吸调控通路, 从而避免相关的中枢神经系统不良反应. 而ASIC3和ASIC1b在外周神经系统特异性分布的特征, 为开发缓解外周疼痛并规避中枢副作用的新型镇痛药物提供了理想靶点. 从结构特征分析, ASIC亚基具有显著的胞外结构域优势, 其较大的胞外环为抗体、毒素肽等高特异性配体提供充分的结合空间, 目前发现的PcTx1、Mamb-1、APETx2等毒素肽均通过结合胞外域来稳定ASIC通道特定状态下的构象. 基于结构-功能关系研究, 设计靶向ECD可变区(如ASIC3的D78-E79-E81酸性簇)的小分子或肽类抑制剂, 可提高药物的ASIC亚型选择性并规避对ENaC等同源通道的脱靶效应. 鉴于疼痛信号传导通路的复杂性, ASIC抑制剂与其它离子通道如TRPV1的拮抗剂联合使用, 可能通过多靶点协同作用实现更优的镇痛效果.
3 毒素肽的化学特性与靶向机制
3.1 代表性毒素肽的化学结构
天然毒素肽作为一类具有显著结构特征的生物活性分子, 其稳定性和功能性主要依赖于分子内二硫键网络的形成. 这些毒素肽可划分为两种典型的结构模式, 胱氨酸稳定的α/β骨架(cystine stabilized α/β scaffold, CSα/β)和抑制剂胱氨酸结(inhibitor cystine knot, ICK)折叠. CSα/β由一个短α螺旋和多个反平行β片层组成, 通过三对或四对二硫键维持其空间构象[97]. ICK折叠更为复杂, 核心结构是三个二硫键形成的胱氨酸结, 其中前两个二硫键和中间的氨基酸骨架构成环状结构, 第三个二硫键贯穿其中, 同时伴随至少包含10个残基的双链或三链反平行β片层[98-99]. 这些独特的结构特征赋予毒素肽高度的结构稳定性, 使其具备优异的离子通道亚型选择性与pH依赖性调控能力, 为开发具有精确靶向性的新型镇痛药物提供结构模板.
PcTx1是首个被鉴定的ASIC通道特异性调节剂, 源自南美狼蛛千里达老虎尾Psalmopoeus cambridgei的毒液[13]. 该毒素肽由40个氨基酸组成, 含有大量碱性残基和3对二硫键, 组成四个特征性胱氨酸间环结构(图3 A、B). 核磁共振结构解析显示, PcTx1存在典型的ICK基序, 其中Cys17-Cys33二硫键贯穿由Cys3-Cys18与Cys10-Cys23二硫键及它们之间的多肽骨架形成的环状结构. 此外, PcTx1二级结构中还包含一个显著的反平行β发夹构象, 由β1 (Leu21~Trp24)和β2 (Val32~Lys35)两段β链组成, 这一结构特征与其生物活性密切相关[41,100]. Mamb包含三种亚型, 均来源于曼巴蛇属毒液, 其中Mamb-1和Mamb-2来自非洲黑曼巴蛇Dendroaspis polylepis, 而Mamb-3源自东部绿曼巴蛇Dendroaspis angusticeps. 这三种亚型均由57个氨基酸组成, 包含4个保守的二硫键(图3 A). 序列分析表明, Mamb-2(Y4F)和Mamb-3(T23I)与Mamb-1仅存在一个氨基酸的差异, 且这种差异并不影响药理学特性[14,101]. 从结构特征来看, Mamb属于典型的三指毒素家族, 由4个二硫键交联组成疏水核心, 从中延伸出三个β链环结构[102]. 具体而言, 手指I保持经典的短折叠构象, 手指II形成较长的反平行β双链并暴露于溶剂中, 手指III虽然较短但具有极大的构象灵活性, 可以形成短α螺旋转角或和主链17~21位残基经氢键作用形成短β链(图3 C)[103]. Mamb分子间可通过手指Ⅱ区域的相互作用形成二聚体, 使Pro26和 Phe27残基不受溶剂影响, 随后以Leu32为中心通过疏水相互作用进一步组装成四聚体, 这种寡聚化特性显著增强了其水溶性.
图3 (A)三种代表性毒素肽的氨基酸序列, 各肽二硫键已标出; (B~D)三种代表性毒素肽的结构, 其中青色为α螺旋, 蓝色为β折叠, 褐色为二硫键(PBD号: PcTx1-3s3x, Mamb-5dz5, APETx2-2mub)Figure 3 (A) Sequences of three representative toxin peptides, with the disulphide bond of each peptide indicated; (B~D) Structures of three representative toxin peptides, with α helices in cyan, β folds in blue and disulphide bonds in brown (PBD ID: PcTx1-3s3x, Mamb-5dz5, APETx2-2mub) |
APETx2是源于海葵Anthopleura elegantissima毒液的防御素家族成员, 由42个氨基酸组成并形成4个反平行β片层的特征性结构(图3 A)[15,104-105]. 该毒素肽通过三对二硫键(Cys4-Cys37、Cys6-Cys30和Cys20-Cys38)构建了刚性β折叠核心结构, 配合广泛的氢键网络, 使其与ASIC3结合时表现出优异的构象稳定性. 与同源肽APETx1相比, APETx2存在两个显著不同的空间簇(图3 D), 第一簇主要由中性或疏水性残基(A3、S5、N8、T39、A41)围绕中心赖氨酸(K10)组成; 第二簇则富含正电荷(Y16、R17、P18、R31和T36), 其中碱性残基R17和R31与芳香族残基Y16及非极性核心P18形成典型的“碱性芳香族二联体”, 常见于肽类毒素的相互作用界面. 在连接两个空间簇的环状结构中, APETx2第23位残基从APETx1的天冬酰胺变为了带负电荷的天冬氨酸, 这些特征被认为与其靶标识别特异性和物种区别相关[104].
3.2 代表性毒素肽与ASICs的相互作用机制
ASIC通道的配体结合位点主要集中于质子感知和通道激活的关键部位——酸性口袋区域, 其次与质子门控机制相关的拇指结构域、手掌结构域以及连接胞外域与跨膜域的手腕区域同样构成重要的配体结合位点. 部分配体可以通过空间位阻效应直接堵塞通道门控区域, 从而阻断离子渗透孔道的开发. 代表性毒素肽与ASIC通道的相互作用特点可见表2.
表2 靶向ASIC通道的代表性毒素肽Table 2 Representative toxin peptides targeting ASIC channels |
| 毒素名称 | 来源生物 | 靶向ASIC亚型 | 调节方式 | 作用特点 |
|---|---|---|---|---|
| APETx2 | 海葵 | ASIC3 | 抑制 | 可能与孔阻塞相关, 非pH依赖 |
| Hi1a | 蜘蛛 | ASIC1a | 抑制 | PcTx1的串联体, 更强效长效 |
| Mambalgin | 曼巴蛇 | ASIC1a、1b | 抑制 | 干扰亚基构象转变, pH依赖 |
| MitTx | 珊瑚蛇 | ASIC1a | 激活 | 稳定通道开放构象, 组成型激活 |
| PcTx1 | 蜘蛛 | ASIC1a | 抑制 | 稳定通道脱敏构象, pH依赖 |
3.2.1 PcTx1通过稳定脱敏态抑制ASIC1a激活
PcTx1作为ASIC通道最具代表性的特异性配体, 其调节机制具有显著的状态依赖性和动力学特征, 功能效应受多种因素影响, 包括浓度梯度、应用pH、通道的pH敏感性和种属特异性[106]. 在分子水平上, PcTx1对大鼠ASIC1a (rASIC1a, IC50=0.3~3.7 nmol/L)和hASIC1a (IC50=13 nmol/L)的同源通道表现出高亲和力抑制活性, 在更高浓度下可扩展至含有ASIC1a的异源通道如rASIC1a/2b、rASIC1a/2a、rASIC1a/3等[44,66,106-108]. 然而在弱酸性环境(pH 6.8~6.4)中, PcTx1可对rASIC1b、hASIC1a、hASIC1b、hASIC1a/2a和cASIC1等通道的电流产生增强效应, 甚至直接激活cASIC1a (EC50≈189 nmol/L)[44,106,108-110].
PcTx1不仅通过结构机制锁定酸性口袋, 更重要的是改变了ASIC1a的激活阈值、失活路径与稳态脱敏动力学, 实现对通道状态转化的精细调控. 在较高pH环境中, 通道被锁定在脱敏构象, 表现为强抑制; 而在酸性条件下, 通过稳定中间构象延缓激活-失活状态转换, 从而增强酸敏反应并延长开放时间. 这种结合诱导的构象选择机制构成了PcTx1状态依赖性调控的核心基础.
3.2.2 Mambalgin通过稳定ASIC静息态构象实现酸敏调节
与PcTx1相似, Mamb对ASIC通道也具有pH依赖性的双重调节作用. 在中性或轻度酸化环境(pH 7.4~6.4)中, 该毒素肽可以有效抑制啮齿类与人类ASIC1a同源通道、rASIC1b同源通道及它们相关的异源通道和cASIC1同源通道的电流(IC50=11~252 nmol/L)[44,101]. 对于hASIC1b和hASIC1b/3, Mamb在重度酸中毒(pH<5.75)时表现出微弱的抑制作用, 但在轻度或中度酸中毒(pH 6.8~6.4)的状态下显示出增强电流的作用[114]. 电生理研究显示, Mamb使rASIC1a和hASIC1a的pH依赖激活曲线往酸性方向移动, 降低ASIC1a质子敏感性并稳定通道的静息闭合构象, 同时引起rASIC1b稳态脱敏曲线的轻微酸性偏移[14,114-116]. 与此相反, hASIC1b的激活曲线和SSD曲线在Mamb作用下均向碱性偏移, 这种独特的调控模式导致通道在轻度酸化时稳定于开放状态并延长开放时间, 而在重度酸化时倾向于锁定脱敏构象[114]. 整体来看, Mamb通过改变激活阈值和脱敏速率, 参与调节ASIC通道在静息、开放与失活之间的状态转换动力学.
冷冻电镜结构显示, Mamb倾向结合ASIC1a在中性pH条件下的静息闭合构象, 主要与ECD的拇指结构域外侧区域相互作用而不直接干扰酸性口袋(图5)[115,117]. Mamb-1手指Ⅱ区域的尖端翻转朝向拇指结构域的α5螺旋, 其中Arg28可能与靠近的Asp347和Asp351存在盐桥作用, 同时疏水簇(Met25, Phe27, Leu32和Leu33)与Phe352存在疏水相互作用, 促使α5螺旋发生约5°的向外翻转并偏离中心轴. 这种构象变化阻碍了Asp351与β球Arg190构象偶联, 进而影响酸性口袋的皱缩. 此外, Mamb-1手指Ⅰ区域的Gln5和His6与拇指结构域的Tyr360以氢键连接, Lys8和Asp300形成盐桥, 进一步稳定毒素-通道复合物[115]. 两者结合使酸性口袋的酸性对Cα原子间距缩短(由1.39和1.56 nm变为1.33和1.20 nm), 并引起跨膜域TM1发生6°的侧向旋转和TM2a/2b的横向偏移, 导致细胞外前庭轻微扩张, 最终让hASIC1a保持在非激活、非紧凑的静息构象中, 降低其开放倾向[115].
分子动力学模拟研究表明, Mamb-1通过拇指结构域的Tyr316、Asn320、Phe350和Tyr358等残基稳定α4/α5螺旋之间的关键铰链, 维持酸性口袋的扩张构象, 以阻止通道打开[118]. 该机制亦适用于Mamb-2和Mamb-3, 因其关键结合残基高度保守, 第4位和23位残基不影响其作用机制. 综合而言, Mamb通过特异性结合ASIC静息态, 干预ECD与酸性口袋构象偶联, 在分子水平上实现对通道从静息态向激活态或失活态转换的双向调节. 这种独特的调控机制不仅能在结构上锁定通道关闭构象, 还能在动力学上影响通道起始激活阈值、失活速率与状态稳定性.
3.2.3 APETx2以非pH依赖方式阻断ASIC通道
APETx2作为ASIC3的特异性可逆抑制剂, 对ASIC3同源三聚体通道具有纳摩尔级抑制效力(IC50-rASIC3=37~87 nmol/L, IC50-hASIC3=175~344 nmol/L), 并能有效抑制多种含rASIC3的异源通道电流, 如rASIC2b/3 (IC50=117 nmol/L)、rASIC1a/3 (IC50=2 μmol/L)、rASIC1b/3 (IC50=0.9 μmol/L), 但对rASIC2a/3无影响[15,18,38,119]. 电生理研究显示, APETx2可以迅速且饱和性地阻断中性pH条件下酸诱导的ASIC3电流和碱诱导的hASIC3电流, 其抑制作用在瞬时峰值与持续窗口电流中均呈现浓度依赖性特征, 但酸性pH下诱发的ASIC3持续电流对其不敏感[15,55]. 在啮齿类动物感觉神经元中, APETx2同样以浓度依赖的方式部分抑制ASIC3样电流(IC50=216±49 nmol/L)[15,120]. 除了ASIC通道, APETx2在微摩尔浓度下还可以降低Nav1.8、Nav1.2、Nav1.6和心脏hERG等电压依赖性通道的电流幅值[105,119,121].
与PcTx1和Mamb的门控动力学调节机制不同, APETx2对ASIC3的抑制作用不改变其pH依赖激活曲线和SSD曲线, 也不影响通道状态转换的动力学特征[44]. 这一独特的“非动力学型”抑制模式提示APETx2可能通过直接阻断离子通道而非调节质子敏感性或稳定特定构象来实现功能抑制. 目前关于APETx2与ASIC3相互作用的结构基础尚不明确, 主要基于同源建模和定点突变研究的推测. 计算模拟研究预测了两个ASIC3与APETx2结合的潜在位点: 一个位于拇指结构域上部区域, 另一个位于手掌结构域与腕部交界处靠近跨膜螺旋的区域, 后者可能与孔阻塞行为有关[38]. 结构-功能分析表明, APETx2碱性芳香族二联体中的Arg17是发挥抑制活性的关键残基, 但它只和ECD下部的假定位点作用, 提示该毒素肽可能通过改变离子通道孔径或离子渗透路径发挥功能[38,122]. 除此之外, 碱性芳香族二联体中的Tyr16、Pro18以及远离主作用环的Arg24等残基也对抑制活性具有重要贡献[105]. 通过系统性的末端修饰实验证实, APETx2的N末端同样是药效基团的重要组成部分[18].
3.2.4 其他毒素肽的作用特性
近年来, 随着毒素肽研究的深入, 除PcTx1、Mamb和APETx2等经典ASIC调节阻断剂外, 也发现了若干具有独特调节机制的ASIC通道靶向毒素肽, 为深入解析ASIC通道的功能特性提供了重要的分子工具. 其中, 源自珊瑚蛇Micrurus tener tener的异源二聚体毒素MitTx由α和β两个亚基组成, 其独特之处在于能够稳定通道开放构象, 组成型激活多种ASIC同源和异源通道, 包括rASIC1a (EC50=9 nmol/L)、rASIC1b (EC50=23 nmol/L)、rASIC3 (EC50=830 nmol/L)和rASIC1a/2a (EC50=75 nmol/L)等. 在弱酸性条件(pH 6.5)下, MitTx还能增强rASIC2a通道电流, 并使其pH依赖激活曲线向碱性方向偏移, 显著提高质子敏感性. 由于MitTx在中性pH条件下即可诱导强烈的内向电流并引发显著疼痛反应, 使其成为研究ASIC介导痛觉机制的理想工具分子[56,100,123].
另一方面, 来自蜘蛛Hadronyche infensa毒素的Hi1a作为PcTx1的结构类似物, 由两个PcTx1样基序串联构成, 展现出更强的ASIC1a抑制活性和更持久的作用时间. 该毒素在较低的纳摩尔浓度下即可有效抑制rASIC1a (IC50=0.4 nmol/L)和hASIC1a (IC50=0.5 nmol/L)电流, 被认为是目前最具开发前景的镇痛候选分子之一[93]. 这些毒素的发现, 不仅丰富了ASIC调节机制的类型谱, 也为靶向不同亚型的选择性药物开发提供了基础.
3.3 毒素肽与非特异性药物的对比
传统镇痛药物由于作用靶点的非特异性常伴随严重副作用, 而毒素肽类药物通过多残基协同作用(包括氢键网络、疏水作用和静电互补等)实现靶标的高选择性, 从而有效规避此类问题. NSAIDs是临床常用的外周镇痛剂, 可以调节炎症诱导的ASICs表达和功能活性. 研究表明, 布洛芬和氟比洛芬(IC50=349±40 μmol/L)能够抑制ASIC1a电流, 在更高浓度下(IC50=51.3 mmol/L)可对ASIC3瞬时电流产生微弱影响, 其作用位点主要位于rASIC1a的跨膜螺旋上部及ECD的β9-α4区域[124-125]. 水杨酸(IC50=260±21 μmol/L)、双氯芬酸(IC50=92±19 μmol/L)和阿司匹林则可以抑制ASIC3持续电流而不影响瞬时电流, 推测其通过通道蛋白的胞外结构域发生相互作用. ASIC3/2b异源通道电流同样可被500 μmol/L水杨酸或200 μmol/L双氯芬酸抑制, 而其他NSAIDs如吡罗昔康、依托度酸、尼美舒利、萘普生、吲哚美辛、对乙酰氨基酚等对ASIC1a和ASIC3均无显著影响[125]. 和毒素肽相比, 此类药物依赖单一作用模式(如通过羧酸基相互作用), 需高剂量或长时间暴露才能起效, 容易导致脱靶效应, 例如高剂量的水杨酸或水杨酸盐可能引发耳鸣和败血症样疾病[126].
阿片类药物虽然具有强效镇痛作用, 但对炎症性疼痛疗效有限, 且多数表现出激活或增强ASIC电流的作用. 内源性吗啡前体四氢罂粟林可在高浓度下激活hASIC3 (EC50=24.86 mmol/L)和rASIC3 (EC50=17.23 mmol/L), 内吗啡肽-1/2能够同时增强小鼠ASIC3 (mASIC3)电流的瞬时成分和持续成分[127]. 而合成类阿片药物如芬太尼、瑞芬太尼和半合成阿片类药物如羟考酮均会增加ASIC3的持续电流[128], 他福定则通过抑制脱敏来增强rASIC1a (EC50=1 mmol/L)和rASIC3 (EC50=0.09 mmol/L)电流[129]. 这些证据表明阿片类药物的镇痛作用主要源于阿片受体激活而非ASIC抑制.
ENaC/DEG超家族成员对阿米洛利类非选择性阻断剂具有特征性敏感, 这类化合物可以强效抑制ASIC瞬时电流但会增强ASIC3持续电流. 阿米洛利使ASIC3的pH依赖激活曲线碱移而SSD曲线酸移, 两曲线重叠部分的增加导致持续电流升高; 对ASIC1a则是使激活和SSD曲线都向酸性pH偏移[116]. 结构研究表明, 阿米洛利主要通过酸性口袋和相邻亚基间的细胞外前庭区域与cASIC1a结合, 其脒基延伸至孔道的Gly436羰基氧处产生部分阻塞[50], 这种同样的单一结合机制是其缺乏亚型特异性的原因之一. 虽然阿米洛利作为保钾利尿剂被批准用于高血压和心力衰竭的临床治疗[130], 但其利尿作用在镇痛应用中成为需要避免的副作用. 此外, 该药物能够透过血脑屏障非特异性作用于中枢神经系统的ENaC/DEG超家族离子通道, 可能产生中枢不良反应, 限制了其作为ASIC靶向镇痛药的开发潜力[131].
4 毒素肽的生物合成技术
毒素多肽的制备技术主要涵盖化学合成和生物合成两大技术体系. 在化学合成领域, SPPS和LPPS在短肽制备、序列精确控制以及多样化修饰(如环化结构构建、D-氨基酸引入和荧光标记)等方面展现出独特优势.
随着巯基保护策略、逐步氧化法、折叠辅助剂和天然化学连接等技术的不断发展, 中长链毒素肽的二硫键错配和低折叠效率问题得到一定程度的改善. 然而, 对于具有复杂二硫键网络和严格构象要求的天然大分子毒素肽, 化学合成仍面临折叠过程复杂、生产成本高昂和产物收率偏低等技术瓶颈. 相较而言, 生物合成技术(图6)通过利用原核或真核表达系统模拟天然折叠环境, 在制备结构复杂且具有完整生物活性的天然毒素多肽方面表现出更高的技术可行性和产业化潜力. 特别是通过表达宿主工程化改造(如引入硫氧还蛋白系统、构建氧化型胞质环境)或选用真核表达系统(如酵母和昆虫细胞), 可显著降低二硫键错配概率, 提升表达产率与生物活性. 因此, 本研究聚焦于毒素肽生物合成工艺的开发与优化, 旨在探索高效、经济的活性多肽制备新方法.
4.1 表达宿主系统选择
毒素多肽的异源表达效果在很大程度上取决于表达宿主系统的选择, 这需要建立在对目标毒素肽的分子结构和理化性质有清晰认知的基础上. 多数毒素肽需要进行翻译后修饰才能表现出特有的生物活性, 这些修饰包括但不限于N-糖基化, O-糖基化以及二硫键形成. 特别是对于富含半胱氨酸残基的毒素肽而言, 二硫键的正确配对不仅是维持其三维结构稳定性的关键因素, 更是保证其与靶标分子特异性结合的必要条件[132]. 然而, 这往往是生物合成中的困难和挑战, 因此所选择的表达宿主需要具备促进多肽二级结构正确折叠的分子环境.
4.1.1 大肠杆菌
大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)作为最常用的原核表达系统, 具有遗传信息简单, 实验操作简便, 培养时间短且成本低廉以及重组蛋白产量高(可达菌体干重的80%)等显著优势. 然而, 天然大肠杆菌的细胞质是还原环境, 存在大量的硫醇还原酶(包括Grx1/2/3、Trx1/2等)、谷胱甘肽和硫醇还原剂, 使半胱氨酸通常保持还原状态[133]. 在这种环境下, 毒素肽不能形成正确的二硫键, 导致大部分表达产物发生错误折叠并以包涵体的形式聚集在细胞质中. 虽然包涵体含有较高纯度的目的多肽, 但其纯化涉及变性、溶解、复性等多个步骤, 不仅费时费力, 而且体外正确折叠率通常较低[134]. 大肠杆菌一般在周质内进行二硫键的合成, 因此解决方案之一是在目的多肽N端加入信号肽, 引导前体蛋白分泌到周质空间, 转移过程中信号肽会被信号肽酶切除, 剩余氨基酸序列在周质的Dsb酶系统辅助下正确折叠为成熟多肽[32,134]. 周质环境具有蛋白酶含量低、杂质蛋白少的优点, 有利于后续纯化操作. 不过, 信号肽的加入会给目的多肽的折叠动力学和结构稳定性带来不可预测的影响, 而且内膜运输效率较低, 周质容量较小, 这一策略在目的多肽产量提升方面存在限制[135-136].
为克服上述限制, 研究者开发了多种基因工程改造策略. 利用基因编辑技术敲除大肠杆菌谷胱甘肽还原酶(gor)和硫氧还蛋白还原酶(trx B)基因, 破坏其还原途径, 构建氧化型细胞质环境, 如Origami菌株(Novagen)[133,137-138]. 在此基础上, 进一步在细胞质中共表达缺失信号序列的周质二硫键异构酶Dsb C, 使其在细胞质中积累, 如SHuffle菌株(New England Biolabs), 可显著改善目的蛋白折叠效率[139]. 但这些改造对产量提升效果有限, 因此研究人员开发了更为先进的CyDisCo (Cytoplasmic Disulphide bond formation in E. coli)表达系统. 该系统共表达两种氧化还原酶, 一种是利用分子氧提供氧化等价物从头合成二硫键的酵母线粒体硫醇氧化酶Erv1p, 另一种是催化蛋白质折叠并重构底物蛋白质错误二硫键的人类蛋白二硫键异构酶(human protein disulphide isomerase, hPDI), 在不破坏菌株本身还原途径的前提下, 实现细胞质内二硫键的高效形成, 并可在所有大肠杆菌菌株中通用[140-141]. 基于此, Bertelsen及同事将其与用于可调表达的pLemo (LEss is MOre)工具结合, 创建了更稳定的DisCoTune可调表达系统. pLemo在可滴定的鼠李糖诱导型rhaBAD启动子下游插入T7溶菌酶基因以缓解T7生产系统压力, 可精确调控蛋白表达水平, 优化资源分配, 显著提高活性蛋白的产量[142-143].
4.1.2 酵母
真核表达系统在动物毒素肽的异源表达中展现出显著优势, 其完善的蛋白翻译后修饰系统能够确保多肽的正确折叠和功能活性. 不过与大肠杆菌等原核表达系统相比, 真核细胞对培养条件等要求更高, 操作流程更为复杂且成本上升. 酵母作为典型的真核表达宿主, 同样可以快速繁殖和大规模培养, 而且具有遗传背景清晰和生物安全性高等特点. 在众多酵母表达系统中, 毕赤酵母(Pichia pastoris)因其独特的生理特性成为药用多肽生产的理想选择. 相比酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae), 它缺少甘露糖基转移酶基因, 避免非人源糖基化修饰带来的免疫原性问题, 同时具备更强大的翻译后修饰系统[132].
毕赤酵母以甲醇为唯一碳源和能源, 可以在高密度培养下实现外源蛋白的高效表达, 其表达水平可达约20 g/L[37]. 该系统的强启动子调控特性使其能够表达原核系统无法生产的复杂蛋白, 如蛇的锌金属蛋白酶[144], 并可达到更高的产量, 如APETx2在毕赤酵母中的表达量比在大肠杆菌中提高了2~4倍[31,38]. 毕赤酵母的内源性蛋白分泌量低的特性为重组蛋白纯化提供便利, 通常在目的蛋白N端加入信号肽如酿酒酵母的α-MF (α-mating factor), 使其直接分泌至培养基[37]. 为了保证细胞的高密度生长和产品质量需要严格控制发酵参数, 维持发酵罐中的高溶解氧浓度, 减少甲醇分解代谢的副产物如过氧化氢和甲醛的积累, 在大规模生产前需要优化培养条件, 生产过程中也需要时刻监控发酵罐中各项指标的变化, 随时进行调整[37]. 针对蛋白酶敏感的重组毒素肽, 可以使用SMD1163, SMD1165和SMD1168等蛋白酶缺陷菌株以减少目的蛋白的降解[132,145]. 此外, 非人源糖基化模式的蛋白进入人体中会受到抗体攻击, 引发过敏反应[146], 因此对于需要糖基化修饰的重组多肽, 可以使用经过“类人”糖基化模式改造的毕赤酵母GlycoSwitch菌株, 降低目的多肽的免疫原性[147-148].
4.1.3 哺乳动物细胞
目前上市的各类重组蛋白药物中, 70%以上由哺乳动物细胞生产, 其中中国仓鼠卵巢细胞系(chinese hamster ovary cells, CHO)因其无血清悬浮培养适应性、高表达量、易转染特性以及较低的人源病毒感染风险等优势成为首选平台, 具有更高的生物安全性, 不过也存在非人源糖基化的潜在免疫原性风险[42]. 相比之下, 人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293 cells, HEK293)可以产生完全人源化的糖基化结构, 但极易被人源病毒感染, 使用前需要经过严格的病毒灭活程序. 相较于微生物, 哺乳动物细胞生长缓慢, 需要营养物质更丰富的培养基和更精准控制的生长条件, 涉及的技术更为复杂, 放大处理难度更大, 稳定表达细胞系需要经过长时间的多轮筛选和验证, 导致整体研发周期延长和成本显著增加[149]. 这些特性使得哺乳动物表达系统在毒素蛋白生产中呈现出高技术门槛与高经济成本特征.
4.2 标签蛋白
异源表达系统中, 富含二硫键的多肽或蛋白常需和各种融合标签共表达以优化其表达效率与功能特性. 融合标签的引入能够显著提高目标蛋白的可溶性表达水平、促进二硫键形成和正确折叠, 避免包涵体的产生, 同时使后续分离纯化流程更简洁高效. 不过标签的加入可能会影响目的蛋白的组装和功能活性, 或引入额外的免疫原性, 因此需要在纯化过程中通过特异性蛋白酶(如TEV蛋白酶或凝血酶)切除. 这些蛋白酶识别位点通常设计在标签和目的蛋白的连接区域, 确保酶切后可以获得完整的目的蛋白. 现有的融合标签系统根据功能可分为促进溶解型、包涵体诱导型、亲和纯化型和检测标记型等, 这些标签既可以单独使用也可以联合使用. 在实际选择时需要综合考虑标签的特异性、酶切后残留氨基酸的影响以及分离操作的难易程度等因素[150]. 其中促溶标签和亲和标签的串联应用最为常见, 二者协同作用可同时实现表达优化和高效纯化的双重目的.
4.2.1 常见促溶标签
麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein, MBP)是分子量为42 kDa的标签蛋白, 从大肠杆菌K12菌株中获得, 在增强目的蛋白表达量和可溶性方面表现出卓越效果. 它作为分子伴侣, 与未折叠目的蛋白的疏水性残基相互作用, 协助蛋白进行正确折叠, 避免蛋白聚集和水解[151]. 当MBP融合到目的蛋白N端时, 其结构域与核糖体结合位点的空间邻近效应显著增强翻译起始效率, 从而提高融合蛋白的表达量和溶解度[152-153]. 此外, MBP标签对交联直链淀粉有天然亲和力, 因此可以利用交联淀粉树脂和麦芽糖缓冲液实现高效纯化. 实验数据显示, 在大肠杆菌异源表达的天冬氨酸蛋白酶(如胃蛋白酶原)在N端融合MBP标签后, 溶解度提升100%且无包涵体生成, 经过直链淀粉亲和层析后纯度高达90%, 即使在10 mg/mL高浓度下长期保存仍保持稳定可溶状态[154].
小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier, SUMO)的大小约为11 kDa, 是泛素样蛋白(ubiquitin-like protein, UBL)家族中高度保守的蛋白. 它具有独特的亲水外围和疏水核心结构特征, 其C端羧基可以与目的蛋白赖氨酸残基形成酰胺键, 从而促进易聚集蛋白的溶解并减轻细胞毒性[157-159]. 在蛋白质折叠过程中, SUMO发挥类似分子伴侣的作用, 通过协助目的蛋白正确折叠, 稳定其结构并减少蛋白酶解, 显著提高目的蛋白的表达量和溶解度[150]. 与其他标签蛋白相比, SUMO的优势在于可以被Ulp1酶等识别蛋白质三级结构的高度特异性蛋白酶切割, 实现无痕切除, 完整保留目的蛋白原有序列及结构完整性[157,160]. 这种特性使其在需要保持蛋白原始结构和功能的应用中具有独特价值.
4.2.2 常见亲和标签
多聚组氨酸标签(poly-His)是应用最广泛的亲和纯化标签, 由3~10个连续重复的组氨酸组成, 其中六组氨酸标签(6×His)最为常见, 具有分子量小、电荷干扰弱且对目的蛋白的结构和功能影响小的显著优势[132]. 该标签通过组氨酸残基的咪唑环与Ni²⁺、Co²⁺、Zn²⁺等二价金属离子形成可逆的配位键, 从而实现基于固定化金属离子亲和层析(immobilized-metal affinity chromatography, IMAC)技术的高效纯化[132,150]. IMAC树脂的结合载量高, 可以耐受较苛刻的条件(如8 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍的变性条件)[161], 且可反复再生使用, 成本花费较小. 相比于真核细胞, 原核表达系统的内源性含组氨酸蛋白较少, His标签纯化可获得较高纯度且较少杂蛋白污染的目的蛋白. 当和促溶标签联用时, 其位置排列对表达效果具有重要影响, 例如将10×His标签置于MBP标签C端后再连接至目标蛋白N端可以提高疏水性牛R9AP蛋白的表达量, 而His标签位于MBP标签N端时则会导致表达量下降[162].
FLAG标签属于抗原表位标签, 由8个氨基酸(DYKDDDDK)组成, 其较小的体积和紧凑的结构对目的多肽或蛋白的高级结构及生物活性影响甚微. 该标签包含肠激酶识别位点, 在真核表达系统中表现出优于His标签的适用性. FLAG标签不仅可以用于免疫亲和纯化, 还能在不同的异源表达系统中直接检测重组蛋白, 并广泛应用于免疫共沉淀、蛋白印迹、免疫荧光等与抗原-抗体反应相关的实验中[150,163]. 作为高度亲水的短肽, FLAG标签通常暴露于融合蛋白表面, 既能防止目的蛋白变性失活, 又能更容易被抗体或肠激酶识别. 利用抗FLAG单克隆抗体固定化层析可实现融合蛋白的非变性纯化, 特别适用于对金属离子敏感的毒素肽, 通过低浓度EDTA即可洗脱目标蛋白. 然而, 由于需使用抗体偶联树脂, 其成本较高且稳定性较IMAC树脂差[150].
4.3 其他优化策略
4.3.1 优化密码子
大肠杆菌对密码子存在明显的偏向性, 对于基因组中低水平表达基因所含的稀有密码子, 其对应的氨酰化tRNA表达水平也相对较低. 但是在真核基因中往往含有大量这类稀有密码子, 当在大肠杆菌中表达含有过多稀有密码子的异源基因时, 氨酰化tRNA的缺乏会导致翻译过程出现氨基酸替换、移码突变或提前终止等异常现象, 严重影响目的蛋白的正确组装和功能活性[164]. 针对这一问题, 目前主要采用两种应对策略, 一种是优化目的蛋白基因, 根据简并性规则将其碱基序列替换为大肠杆菌偏好的同义密码子, 或直接根据宿主密码子偏好进行全基因合成[165-166]; 另一种是优化大肠杆菌基因表达, 通过共转化携带稀有tRNA基因的辅助质粒, 提高宿主细胞中相应tRNA的表达量, 如商业化的pRARE质粒和Rosetta(DE3)菌株[166-168]. 这一密码子优化策略具有普适性, 在其他异源表达系统中, 通过将异源DNA序列改造为宿主偏好的密码子模式, 可以大幅提高目的蛋白表达水平[169].
4.3.2 优化培养条件
降低培养温度和诱导剂浓度是增加重组蛋白可溶性的有效策略之一, 通过减缓蛋白质翻译速度阻止蛋白折叠中间体在细胞质聚集成为包涵体[170-171]. 大肠杆菌在以葡萄糖为碳源的培养基中快速生长时, 会积累大量醋酸代谢副产物, 导致培养基pH下降、溶解氧浓度增加及底物降解等一系列理化性质改变. 采用分批补料培养技术, 根据细菌对营养物的消耗速率动态补充葡萄糖, 可将细菌生长速率控制在醋酸盐生成阈值以下, 减少代谢副产物对蛋白表达的影响[172]. 此外, 特定辅助因子补充对促进蛋白质正确折叠具有重要作用. 实验证明, 在大肠杆菌BL21(DE3)的培养基中添加0.1 mmol/L Mg2+后, 重组蛇毒类凝血酶gloshedobin的溶解度提高了50%[173]. 这些优化策略通过多维度调控表达环境, 为获得高可溶性重组蛋白提供了有效途径.
5 重组毒素肽的成药性优化及挑战
虽然数十年来研究者已从蜘蛛、蛇、海葵、芋螺、蜜蜂等多种动物毒液中鉴定出大量具有潜在治疗价值的活性毒素成分, 但这些天然产物的药物开发历程往往需要经历漫长的转化过程. 从最初的生物活性发现到功能验证, 直至最终的临床应用, 特别是作为成熟药物进入上市前的关键临床研究阶段, 必须通过系统的体外和体内测试全面评估其药效、副作用及用药安全性. 这一严格的药物开发流程需要花费巨大的人力资源、时间成本和资金支持, 以满足各国药品监管机构对创新药物的评审要求.
5.1 成药性优化策略
迄今为止, 有两种源自天然毒素的多肽药物已被批准用于慢性疼痛的临床治疗, 包括作用于N型电压门控钙通道的齐考诺肽和靶向烟碱型乙酰胆碱受体的科博肽(克痛宁, Cobratide), 其中后者于2002年获得中国国家药品监督管理局批准(国药准字H53022101)[30]. 此外, 正如表1所列, 多项毒素衍生药物进入了临床试验阶段, 在不同的疾病体内模型中展现出疗效, 证实毒素肽作为特异性治疗药物的巨大潜力. 然而, 毒素肽药物的开发仍面临若干关键性挑战, 包括潜在的免疫原性、有限的膜通透性、较短的体内半衰期以及快速的清除率等问题, 这些因素极大程度降低了毒素肽的生物利用度, 难以满足临床药物严格的活性要求. 为此, 需要通过多种分子工程技术对天然毒素肽进行系统性优化改造.
5.1.1 化学修饰
基于前文所述经糖基化模式改造的毕赤酵母表达系统, 可进一步对其产生的毒素肽进行聚乙二醇(PEG)共价修饰. 该技术利用亲电的PEG亲电试剂(如氯三嗪、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺和醛类)与多肽表面的亲核基团(如氨基、巯基)进行非特异性的共轭加成反应(图7), 并可根据亲核基团的理化性质(pKa、亲核性等)进行位点特异性修饰[174]. PEG化修饰可以增加毒素肽的有效分子量和流体力学半径, 进一步降低免疫原性, 并通过空间位阻效应减少肾脏过滤清除率, 显著延长血浆循环半衰期[175]. 以来源于蛇毒的凝血酶样丝氨酸蛋白酶Collinein-1为例, 经5 kDa的马来酰亚胺-mPEG修饰后, 不仅保持了原有酶活性和细胞安全性, 还表现出增强的热稳定性、催化效率和底物亲和力, 同时在小鼠内显示出降低的免疫原性[176]. 此外, 针对效应记忆T淋巴细胞关键调节因子Kv1.3通道的蝎毒衍生肽HsTX1[R14A], 经PEG化后其对Kv1.3惰性表面的非特异性吸附减少并显著延长体内循环半衰期, 从少于1 h延长至37.3 h, 补偿了通道亲和力的损失(下降1300倍), 在关节炎模型中展现出持续两周的抗炎效果, 证实其在自身免疫性疾病治疗中的潜在价值[177].
提高毒素肽在生物体内的屏障穿透能力可以通过共价连接促进被动或者主动运输的相关元件实现. 在C末端加入带正电荷的氨基酸如精氨酸或赖氨酸, 甚至串联重复使用, 可以大大增强多肽的细胞和组织穿透力, 提高细胞吸收率[178-179], 其机制可能与带正电荷的多肽和生物体内负电性表面产生低亲和力电荷相互作用有关[175]. 但阳离子过多的多肽末端会对哺乳动物细胞膜有不利影响, 存在细胞毒性, 因此更安全的替代方案是将多肽与细胞表面受体的特异性配体偶连. 其中糖基化修饰是最广泛应用的策略之一, 不仅可以提高细胞摄取效率和组织穿透性, 还可以促进血脑屏障的跨越[180-181]. 实验证实, 对线性阿片肽Tyr-D-Thr-Gly-Phe-Leu-Ser末端的丝氨酸残基进行O-糖基化修饰后, 显著提高了其在血清和大脑中的代谢稳定性, 血脑屏障通透性从1.0±0.2 μL•min−1•g−1增加至2.2±0.2 μL•min−1•g−1, 静脉注射给药后展现出比原生肽更好的镇痛效果[182].
5.1.2 基因突变
毒素肽虽然具有高度特异的靶向性, 但对不同物种同源靶标的亲和力往往存在显著差异, 如APETx2对大鼠和人类ASIC3通道的抑制能力相差约10倍. 这一现象源于大多数毒素肽并不是为了人类用途而进化的, 所以通常需要人为增强毒素肽针对特定靶点的效力和亚型特异性. 饱和突变是其中一种关键策略, 通过丙氨酸突变扫描等方法首先鉴定出毒素肽中影响其与特定靶点相互作用的残基, 随后在特定位点设计简并引物(如NNK或NNS密码子), 在PCR中引入随机突变且覆盖所有可能的氨基酸替换, 生成单位点饱和诱变文库, 经过克隆表达和筛选鉴定获得最优的氨基酸组合[187].
5.1.3 递送载体
纳米载体递送系统作为多肽药物靶向输送的重要策略, 近年来受到广泛关注. 基于脂质的纳米载体包括水包油纳米乳剂、自乳化给药系统(SEDDS)、固体脂质纳米颗粒(SLN)、纳米结构脂质载体(NLC)、脂质体和胶束等多种形式, 为多肽药物的递送提供了多样化选择. 多肽中的疏水侧链可以和疏水反离子形成疏水离子对(hydrophobic ion pairs, HIP), 大大提高自身的亲脂性, 从而有效包载于纳米载体的亲脂相中[190-191]. 这一策略可以规避生物体内蛋白酶、巯基化合物(如谷胱甘肽和膳食蛋白质)等强亲水性分子对多肽药物生物利用度的影响, 保持药物的结构完整性和生物活性[192]. 对于亲脂性较强的脂肪酶等降解酶, 可通过添加耐受型辅料确保纳米载体的稳定性. 纳米载体凭借其微小尺寸(通常<200 nm)展现出优异的粘液渗透性, 在到达作用部位后, 可通过细胞内吞或细胞膜融合方式释放载体里的多肽药物[193]. 实验研究表明, 用水包油(O/W)微乳液滴包裹的促性腺激素释放激素(GnRH)类似物亮丙瑞林(leuprorelin), 经过胰蛋白酶和α-糜蛋白酶消化120 min后仍保持50%的完整性, 口服利用度也提高了17.2倍, 证明了SEDDS对多肽药物的保护作用, 可用于治疗激素依赖性疾病[194]. 这些纳米载体技术为克服多肽药物的递送障碍提供了有效解决方案.
5.2 药物开发挑战
毒素肽从发现治疗作用到真正作为治疗药物在临床上使用, 需要经历复杂而漫长的转化过程, 期间会面临着各种各样的瓶颈和挑战. 在基础研究阶段, 必须系统解决靶标选择性、作用机制、药剂剂型、体内稳定性以及药代动力学等关键问题. 研究过程遵循从分子水平到细胞水平再到动物水平的递进式验证策略, 需要逐步明晰和优化毒素肽的分子结构和功能活性. 其中, 动物实验是临床前研究的核心环节, 需要全面评估毒素肽在动物体内的药效学特征、作用持续时间、潜在毒副作用和用药风险. 给药方式也是药物研发中很重要的一环, 需根据多肽药物的分子大小、理化性质、蛋白酶敏感性和免疫原性等关键参数, 综合考虑药物的递送系统、作用部位特性以及生物屏障穿透需求等. 目前获批的蛇毒衍生药物受限于分子特性, 主要采用肠外给药方式[30]. 因此, 临床前研究作为药物开发中最复杂、耗时且成本高昂的阶段, 还面临着监管审批、资金投入和生产工艺等多重挑战.
随机临床试验虽然是多肽药物上市前评价其有效性、安全性等的金标准, 但其受试人群通常排除了儿童、孕妇和老人等特殊人群, 导致这部分人群的药物安全性存在不确定性. 新药研发要求候选分子必须较现有药物具有更强的竞争力, 如更低的生产或使用成本、更好的药效等, 但在临床试验中常出现预期外的生物学效应, 如靶标与疾病症状相关性不足、非靶标组织部位分布或脱靶结合等问题, 都可能会导致药效没有达到预想效果而终止临床实验[30,195]. 源于尖吻蝮蛇毒液的蛇毒抗血小板溶栓素(Agkisacutacin)可通过阻断血小板粘附和聚集达到抗凝血效果, 但其在围手术期出血方面的Ⅲ期临床研究因出现过敏反应而终止[196-197]. 来自铜头蝮的蛇毒纤溶酶(Alfimeprase)能够加速血栓溶解, 在慢性周围动脉血栓和周围静脉导管栓塞方面的应用已经进入Ⅲ期临床实验, 在中风方面已进入Ⅱ期临床研究, 但均因为未达到预期治疗效果而被放弃开发[198-199].
毒素多肽类候选药物也面临着潜在的脱靶效应与副作用挑战, 特别是作用于ASIC通道的动物毒素, 它们的靶标选择性尚未完全明确. 以APETx2为例, 虽然是相对特异的ASIC3抑制剂, 但在微摩尔浓度下仍可影响Nav1.2、Nav1.6、Nav1.8等钠通道, 以及心脏hERG钾通道, 存在引发神经系统或心血管副作用的潜在风险. PcTx1也被证实在一定条件下可调节ASIC1a以外的亚型. 鉴于ASIC家族成员在中枢和外周神经系统、骨骼、肌肉、胃肠道等多种器官组织中广泛分布, 毒素肽的非靶向作用风险不容忽视. 目前, 这类多肽缺乏系统的长期毒理学数据, 其用药安全性评估不足, 严重制约了临床转化进程. 未来研究需加强脱靶效应筛查、剂量优化和组织分布特征分析, 以提升毒素肽类药物的临床转化成功率.
6 结论与展望
ASIC通道作为酸诱导疼痛信号传导的关键分子传感器, 其亚型特异性分布特征(如ASIC1a参与中枢敏化, ASIC3调控外周炎性痛), 为开发精准镇痛药物提供了重要靶点. 以PcTx1、Mambalgin、APETx2为代表的毒素肽凭借纳摩尔级结合亲和力和高亚型选择性的独特作用机制, 在多种动物疼痛模型中展现出与吗啡相当的疗效且无成瘾性风险[14], 表现出明显优于传统阿片类药物及NSAIDs的镇痛潜力. 近年来, 冷冻电镜解析、分子对接模拟和定点突变分析揭示了毒素肽与ASIC的相互作用界面, 明确了其通过调控状态转换相关区域(如酸性口袋、拇指结构域)的变构效应或直接孔阻塞影响通道门控的分子机制. 异源表达系统的发展为获得高纯度、高产量的毒素肽提供了有效途径, 其优势在于能够直接在细胞内完成复杂的翻译后修饰过程(如二硫键形成和糖基化修饰等), 不仅降低生产成本, 更满足了从基础研究(如高通量生物活性筛选)到工业化大规模生产的全链条需求. 生物合成技术与化学修饰策略(如PEG化、脂化)的结合, 显著提升了毒素肽的分子稳定性、体内半衰期及靶向效率, 为其临床转化奠定了技术基础.
尽管研究取得显著进展, ASIC靶向毒素肽的临床转化进程仍面临多重挑战. 在结构生物学层面, 目前只有cASIC1和hASIC1a的高分辨率结构得到解析, 其他物种的ASIC1或其他ASIC亚基的同源建模会因氨基酸序列差异出现构象偏差, 严重制约基于结构的理性药物设计. 虽然ASIC的生理病理功能已有很多研究阐明, 但其功能的复杂性仍有许多未解之谜, 特别是ASIC3持续窗口电流与慢性疼痛的因果关系尚未明确, 加之缺乏特异性抑制剂, 限制了其病理机制的深入探究. 在药物开发方面, 毒素肽较差的血脑屏障穿透性、潜在的免疫原性及脱靶效应是需要克服的瓶颈问题, 需通过纳米脂质体、细胞穿透肽等技术优化递送系统, 同时提高包封率和体内释放率, 并充分考虑种属差异对药效评估的影响. 从工业化生产角度考量, 现有表达系统存在明显局限, 哺乳动物细胞虽然更符合天然状态蛋白表达但成本高昂且生产周期长, 微生物系统则面临折叠效率与翻译后修饰能力不足的问题, 需要开发新型工程化宿主以平衡表达质量与生产成本. 这些挑战的解决将直接决定ASIC靶向毒素肽能否成功实现临床应用.
随着多学科发展及交叉应用, 可以结合不同学科的特点优化毒素多肽的药物开发. 在结构生物学领域, 可借助AlphaFold2等人工智能工具构建未解析ASIC亚型的全原子模型, 结合已知的ASIC1结构信息, 联用饱和突变和定向进化技术, 在现有毒素肽的基础上设计具有跨物种一致性的高选择性毒素变体, 如增强hASIC3结合力的APETx2类似物. 鉴于疼痛信号传导涉及多种离子通道的协同作用, 包括瞬时受体电位通道TRPA1[200]、配体门控离子通道P2X3[201]等, 未来研究可开发基于这些离子通道的双靶点毒素嵌合体或小分子-多肽复合物, 以应对复杂疼痛病理微环境的治疗需求. 在药物递送方面, 开发基于HIP技术或血脑屏障穿透肽(如TAT)构建的刺激响应型纳米载体, 实现毒素肽的局部缓释与病灶靶向递送. 表达系统优化方面, 通过改进DisCoTune系统和糖基化工程酵母等异源表达系统, 更好地实现二硫键密集型毒素肽的高效折叠与“类人化”翻译后修饰, 进行绿色生物制造的同时降低生产成本. 综上所述, ASIC靶向毒素肽的研究正处于从基础探索向临床突破的关键阶段, 多学科协同创新与计算辅助设计相结合, 有望为慢性疼痛治疗提供新一代安全高效的解决方案.
(Cheng, B.)