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Acta Chimica Sinica >

2025 , Vol. 83 >Issue 8: 878 - 886

DOI: https://doi.org/10.6023/A25040134

Article

Conformational Conversion Strategy-Driven Solid-State Nanopore Enables Concentration-Sensitive Quantification of Biomarkers

  • Jianyu Shang a, b ,
  • Chaochao Wang a, b ,
  • Xinran Gao a, b ,
  • Yin Zhang , a, b, * ,
  • Jingjie Sha , a, b, *
Expand
  • a Jiangsu Key Laboratory for Design and Manufacturing of Precision Medicine Equipment, Southeast University, Nanjing 211189, China
  • b School of Mechanical Engineering, Southeast University, Nanjing 211189, China
* E-mail: ;

Received date: 2025-04-27

  Online published: 2025-06-19

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National Natural Science Foundation of China(52361145851)

National Natural Science Foundation of China(52075099)

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Abstract

The quantitative detection of microRNA (miRNA) is of critical importance for the early diagnosis of cancers, particularly lung cancer, where specific miRNAs such as miRNA-21 have been identified as key biomarkers. However, the low abundance, short chain length, and high sequence homology of miRNAs present significant challenges in developing a rapid, low-cost, and concentration-sensitive detection platform. In this study, we investigate the detection of 22 nt single-stranded DNA (ssDNA), a surrogate for miRNA-21, using solid-state nanopores, and observe a saturation phenomenon in the capture rate at low concentrations, which limits the sensitivity of the detection. To elucidate this phenomenon, we propose a competition theoretical model based on Langmuir adsorption dynamics, which identifies spatial hindrance effects caused by the competitive adsorption of DNA molecules near the nanopore entrance as the primary factor limiting detection sensitivity. This hindrance effect is influenced by the physicochemical properties of DNA, the applied voltage, and the nanopore dimensions. Through numerical simulations, we further analyze the interplay of electrophoretic forces, electroosmotic flow, and electrostatic repulsion in the translocation dynamics of DNA molecules, providing a comprehensive understanding of the underlying mechanisms. To overcome these limitations, we introduce a conformational conversion strategy that transforms ssDNA into double-stranded DNA (dsDNA) through the addition of complementary strands. This strategy significantly reduces the spatial hindrance at the nanopore inlet and lowers the energy barrier for molecular translocation. Experimental results demonstrate that the conversion to dsDNA not only enhances the capture efficiency but also transforms the concentration-response relationship from nonlinear to linear, enabling more accurate quantification of low-concentration analytes. Furthermore, the conformational conversion reverses the translocation direction of the target biomarkers, improving the specificity and sensitivity of the detection process. Our findings reveal that the dsDNA-based approach achieves dual improvements in low-concentration sensitivity and voltage-dependent capture rates, providing a robust framework for the ultrasensitive detection of low-abundance biomarkers in complex biological samples. In conclusion, the conformational conversion strategy-driven solid-state nanopore platform represents a significant step forward in the rapid, low-cost, and concentration-sensitive detection of lung cancer biomarkers, addressing critical challenges in the field and offering new opportunities for early disease diagnosis and personalized medicine.

Key words： biomarkers; solid-state nanopore; microRNA; concentration quantification; conformational conversion strategy; ssDNA; dsDNA

Cite this article

Jianyu Shang , Chaochao Wang , Xinran Gao , Yin Zhang , Jingjie Sha . Conformational Conversion Strategy-Driven Solid-State Nanopore Enables Concentration-Sensitive Quantification of Biomarkers[J]. Acta Chimica Sinica, 2025 , 83(8) : 878 -886 . DOI: 10.6023/A25040134

1 引言

癌症的早期精准诊断是改善临床预后的关键环节, 也是肿瘤学研究的前沿领域. 长度约20个核苷酸的内源性核糖核酸分子——MicroRNA (miRNA)[1-2], 其异常表达与许多疾病存在显著相关性[3-5], 可作为癌症诊断的生物标志物. 研究显示, 肺癌患者血清中miRNA-1254[6], miRNA-21[7-8], miRNA-10b[9]等特征性miRNAs呈现显著浓度偏移[10-11]. 高效、灵敏的miRNAs检测技术在无创早期筛查和临床诊断中具有重要应用价值[12-13], 通过监测特定标志物浓度的动态变化, 可在亚临床阶段锁定癌变进程[14-15], 从而优化治疗决策的时间节点. 然而, miRNA的低丰度、短链长和高度同源性等固有特性[1], 使得开发一个快速、低成本且浓度变化敏感的miRNA检测平台具有实际挑战性[16-17]. 固态纳米孔技术具有无标记、高灵敏度和低成本等优势[18-20], 成为生物标志物检测的研究热点[21-23]. 纳米孔检测是基于生物分子易位过程引起的离子电流变化, 来实现单分子水平上对分子尺寸、构型及浓度的动态检测[24-26]. 然而, miRNAs在液相环境中易受核糖核酸酶(RNase)介导降解导致不稳定且难以长时间保存[27], 因此实验研究中采用对应的miDNAs作为待检测的目标标志物.
短链核酸分子的检测面临着易位速度过快导致分辨率受限和低浓度样本捕获率较低等问题. Keyser等[28]通过光镊施加反作用力来减缓甚至阻止DNA过孔, 首次实现了对固态纳米孔中单个DNA的力学测量. Wanunu等[29]利用盐梯度增强了低浓度下DNA的捕获率, 并提高了平均易位时间. Zhang等[30-31]通过压力减缓了通过纳米孔的DNA易位速度, 进而区分不同长度的DNA分子. Wang等[32]利用金属有机笼(PCC-57)作为生物分子载体, 提高了固态纳米孔的灵敏度和选择性. 此外, 电渗透陷阱(Electro-Osmotic Trap)[33-34]、新型阵列结构[35-36]和化学修饰[37]或DNA碱基修饰[38]等手段也被用于提高纳米孔的灵敏度和选择性. 癌变进程与生物标志物的浓度水平密切相关[10-11], 因此快速且敏感的目标生物标志物浓度检测是miRNA检测平台的重要指标[39]. He等[40]提出了一种数字免疫测定方案并实现了复杂生物样本中目标分子浓度的测定, 这为基于纳米孔技术的精准医疗奠定了基础. 目前, 基于固态孔的检测技术已在生物分子的检测和测序方面取得显著进展, 但针对低浓度下生物标志物的敏感性、特异性和一致性检测仍需进一步深入.
本研究发现了单链DNA (single-stranded DNA, ssDNA)分子的浓度检测中捕获率的浓度响应曲线呈现非线性饱和响应, 这一现象表明固态纳米孔技术在痕量水平ssDNA的定量检测中适用性受限. 研究提出基于 Langmuir吸附理论的孔口动态竞争理论模型, 并结合数值模拟研究了纳米孔孔口的位阻效应对DNA分子易位过程的影响. 利用互补链杂交诱导的构象转换策略, 使得ssDNA转变为双链DNA (double-stranded DNA, dsDNA), 成功实现了捕获率的浓度响应曲线从非线性响应到线性响应的转变, 并显著提高了浓度检测灵敏度. 该策略不仅可以提高浓度检测灵敏度, 还能够改变目标生物分子的易位方向, 该方案为复杂生物样本中低丰度生物标志物的定量检测及临床应用提供了新的技术路径.

2 结果与讨论

2.1 固态纳米孔检测单链DNA

在我们的实验中, 纳米孔是用受控介电击穿(CBD)方法[41-42]在30 nm厚度的氮化硅膜上制备的(详细的制备过程见支持信息部分S1). 实验装置的原理图如图1a所示, 纳米孔芯片集成于双腔室微流控系统, 两腔室充满1 mol•L−1 KCl 电解质溶液. Ag/AgCl电极浸没在两侧腔室中, Cis 室的电极上施加驱动电压Vapp, 同时将Trans室的电极接地. 待检测的DNA在驱动电压的作用下会被纳米孔捕获, 用电阻式反馈放大器以500 kHz实时记录捕获事件的时间-电流信号(实验过程的细节见支持信息部分S2). 当纳米孔两端被施加电压时会形成一个稳定的离子电流I0, DNA分子通过纳米孔时会引发特征性电流阻塞事件, 从而引起离子电流的暂态变化. 实验中一个典型的电流阻塞信号如图1b所示, 电流从初始的开孔电流I0, 下降至阻塞电流IB, 形成幅值为ΔI, 持续时间为Δt的瞬态信号, 对应的占位比ΔI/I0为(dDNA/dpore)2, 其中dDNA和dpore分别为DNA的等效直径和纳米孔的直径.
图1 (a)使用固态纳米孔检测DNA分子的原理图. (b)实验中典型的电流阻塞事件. (c)不同条件下的离子电流信号. (d)待检测的ssDNA捕获率与浓度的非线性依赖性. 其中插图为50、100、500 pmol•L−1浓度的ssDNA溶液通过纳米孔的离子电流信号

Figure 1 (a) Principle of nanopore-based device for DNA molecules detection. (b) A typical current blockade event in experiments. (c) Ion current traces under different conditions. (d) Saturating nonlinearity relationship between concentration and the capture rate of the target ssDNA. The Inset shows current traces for 50, 100, and 500 pmol•L−1 ssDNA

直径为5.7 nm的纳米孔检测平台的两侧腔室中均加入1 mol•L−1 KCl溶液, 在无待测物的对照实验中, 500 mV电压条件下基线电流保持稳定, 未观察到电流阻塞事件. 在Cis室中引入待检测的ssDNA溶液并施加驱动电压后, 发现捕获事件呈现显著的电压极性依赖性. 负向电压条件下未观察到电流阻塞事件, 而正向电压条件下可观察到明显的电流阻塞事件, 如图1c所示. 该现象表明ssDNA的易位行为受电场方向调控[43]. 带负电的DNA分子在外加电场作用下, 受到与外加电场方向相反的电泳力FEP. 同时, 纳米孔通道内的净电荷在电场作用下带动溶液流动形成电渗流, 电渗流对DNA分子的作用称为电渗力FEOF. 氮化硅纳米孔表面会因水解反应带负电[44-45], 因电中性要求使得通道内存在净正电荷, 所以电渗流和电渗力的方向与电场方向相同. 电渗力和电泳力的大小均与DNA分子的长度有关, 然而待检测的ssDNA的等效电荷密度较小, 因此电渗力在易位过程中起主导作用[46], 易位方向与电场方向相同, 这与ssDNA在本实验体系中所带净负电荷的特性相符合. 实验期望通过捕获率来预测待检测生物标志物的浓度水平, 然而, ssDNA从50到500 pmol•L−1浓度范围内的捕获率仅增长约0.015 s−1并逐渐稳定在0.135 s−1附近, 未呈现显著浓度依赖性(图1d), 说明ssDNA作为浓度响应型生物标志物存在局限性.

2.2 动态竞争理论模型及数值仿真

本研究基于经典静电聚焦模型[29]与Langmuir竞争吸附模型[47]提出一种新的孔口动态竞争理论. 该理论认为DNA分子在孔口附近的竞争性引发的空间位阻效应是导致捕获率平台化的关键因素. 该理论认为, 纳米孔捕获DNA分子的能力与电场强度有关, 因此距离纳米孔孔口越近, DNA分子受到的捕获效果越强, 也就更难以逃脱纳米孔的捕获. 而在距离纳米孔捕获半径rcap附近的DNA分子, 其受到的电场作用与其自由扩散效果接近, 因此该区域的DNA分子存在进入捕获区的可能, 也存在脱离捕获区的可能, 我们称该区域为半捕获区. 图2a展示了动态竞争理论模型中一个DNA分子的完整动力学过程, Cis室中的一个DNA分子会在外加电 场的作用下到达半捕获区内, 对应DNA分子从状态i转化为状态ii. 处于状态ii的DNA分子存在两种可能, 再次回到非捕获区(状态i)和被纳米孔捕获(状态iii). 被成功捕获的DNA分子穿过纳米孔并进入Trans室, 继续受到电场作用逐渐远离纳米孔, 这一过程中电场作用逐渐减弱, DNA 分子恢复自由扩散状态(状态iiii到状态iiiii). 在DNA分子的易位过程中, 其运动不仅受到电泳力和电渗力的共同作用, 还受到其他DNA分子的静电排斥作用. 这种静电排斥作用在捕获区和半捕获区内尤为显著. 当半捕获区内聚集了大量DNA分子时, 静电排斥作用增强, 导致驱动电压无法进一步驱动更多的DNA分子进入捕获区, 此时系统达到一种竞争饱和状态. 在此状态下, 纳米孔的捕获率不再依赖于DNA分子的浓度, 而仅与捕获速率相关.
图2 (a) DNA分子通过纳米孔完整动力学过程的模型示意图. 其中状态i为非捕获区的自由扩散的DNA分子, 状态ii为半捕获区内的DNA分子, 状态iii为被纳米孔捕获的DNA分子, 状态iiii到状态iiiii为DNA分子逐渐脱离纳米孔束缚的过程. (b)实际捕获率与相对吸附比的关系曲线. (c) DNA分子在易位过程中受到的合力变化. (d)单个ssDNA在纳米孔孔口受到的电泳力、电渗力与合力大小与DNA表面电荷密度的关系. 模型中的纳米孔直径为5nm. (e, f) ssDNA与dsDNA易位过程中受到的电泳力、电渗力与合力变化

Figure 2 (a) Schematic illustration of the complete kinetic process of DNA molecules translocating through a nanopore. State i represents DNA molecules freely diffusing in the non-capture region. State ii represents DNA molecules in the semi-capture region. State iii represents DNA molecules captured by the nanopore. States iiii to iiiii represent the process of DNA molecules gradually escaping from the nanopore. (b) Relationship curve between the actual capture rate and the relative adsorption ratio. (c) Variation of the total force acting on DNA molecules during the translocation process. (d) Electrophoretic force, electroosmotic force, and total force acting on a single ssDNA at the nanopore entrance as a function of DNA surface charge density. The nanopore diameter in the model is 5 nm. (e, f) Electrophoretic force, electroosmotic force, and total force acting on ssDNA and dsDNA during the translocation process

为了更准确地描述DNA分子在半捕获区内的行为, 我们引入Langmuir假设, 认为DNA分子被捕获(状态i到状态ii)和脱捕获(状态ii到状态i)行为符合动态竞争关系(详细推导过程见支持信息部分S3). 该假设认为半捕获区内存在一系列离散的吸附位点, Nsite表示总吸附位点数, 而Ncap表示捕获到DNA的吸附位点数, 定义吸附位点的占据度θs=Ncap/Nsite, 则有:
d θ s d t ＝ k o n c D N A 1 － θ s － k o f f θ s
其中kon表示表示单位时间内单位浓度的DNA分子与一个未被占据的吸附位点发生有效碰撞并吸附到该位点上的概率, 对应过程中状态i到状态ii的演变; koff表示一个已吸附的DNA分子从吸附位点上解吸附的概率, 对应上述过程中状态ii到状态i的演变. cDNA表示DNA溶液的浓度. 稳态条件下, 占据度θs不随时间变化, 即dθs/dt=0. 定义解离常数kD=koff/kon并代入公式(1), 则有:
θ s ＝ c D N A / k D 1 ＋ c D N A / k D
纳米孔的实际捕获率Rcap定义为单位时间内通过纳米孔的DNA分子数, 对应过程中状态ii到状态iii的演变, 其大小与捕获到DNA的吸附位点数Ncap成正比. 无量纲常数sDNA=cDNA/kD表示半捕获区的相对吸附比, Rm=kcap•Nsite表示理论最大捕获率. 捕获到DNA的吸附位点数Ncap可表示为占据度θs与总吸附位点数Nsite的乘积. 结合公式(2), 能够得到实际捕获率Rcap表达式, 即:
R c a p ＝ R m · s D N A 1 ＋ s D N A
根据公式(3), 实际捕获率主要与理论捕获率和相对吸附比有关. 理论捕获率决定了纳米孔系统的捕获率上限, 而相对吸附比决定了捕获率动态特征. 在100 pmol•L−1到1000 pmol•L−1的浓度范围内, 捕获率表现出三种不同动态特征的连续转变. 捕获率的浓度响应曲线逐渐从线性增长状态过渡到饱和状态(不同状态见支持信息S3). 图2b 展示了在理论捕获率恒定时, 实际捕获率与相对吸附比的关系. 当sDNA≈1时, Rcap与sDNA显示出动态竞争特征, 实际捕获率随着sDNA的增大而逐渐增长, 最终趋于一个恒定值, 即理论捕获速率Rm. 而当sDNA>>1时, sDNA/(1＋sDNA)≈1, 此时实际捕获率Rcap几乎恒定不变.
ssDNA在溶液中通常以折叠形态存在[48-49], 这种折叠形态极大减少了半捕获区内的有效捕获位点. 此外, 折叠形态的ssDNA需要克服更大的能量势垒才能通过纳米孔, 这限制了其最大捕获速率[49]. 另一方面, 由于ssDNA的带电量较小, 在电场中的迁移效率较低, 导致在皮摩尔(pmol•L−1)浓度范围内, 捕获率的变化不够显著, 难以实现高灵敏度的浓度检测. 值得注意的是, 当sDNA<<1时, sDNA/(1＋sDNA)≈sDNA, 此时公式(3)可以简化为Rcap=RmsDNA, 实际捕获率与sDNA成线性关系, 如图2b插图所示. ssDNA在溶液中的折叠形态, 限制了有效捕获位点数与捕获速率常数, 因此其理论捕获率较低. 另一方面, ssDNA的带电量较小导致其受到的电场作用效果较弱, 因此捕获率曲线特征上呈现出竞争饱和特征. 这些因素导致在皮摩尔浓度范围内, ssDNA捕获率的变化不够显著, 难以实现高灵敏度的浓度检测.
本研究采用数值模拟方法计算了DNA分子在易位过程中的受力情况. 基于COMSOL软件[50]建立的有限元模型见支持信息S4. 为简化计算复杂度, 模型采用二维旋转对称结构[46], 其中纳米孔的长度与直径分别设置为30 nm和5 nm. DNA分子被简化为直径1.4 nm[49]、长度13.2 nm(每个碱基约0.6 nm)[51]的棒状结构. 通过求解Poisson-Nernst-Planck-Stokes (PNPS)方程组[36,52], 计算了纳米孔内DNA分子与离子的电动力学行为. 溶液中DNA分子所受的电渗力FEOF与电泳力FEP的具体数值可通过公式S4.6与S4.7(见支持信息)计算获得.
图2c展示了ssDNA在易位过程中所受作用力与距离的关系曲线. 横坐标表示相对于纳米孔的距离, 纵坐标表示作用力的值. 在非竞争条件下(橙色曲线), 目标 ssDNA仅受外加电场作用, 其受力随距离从100 nm减小至10 nm而逐渐增大. 然而, 当目标ssDNA在纳米孔孔口处被竞争分子包围时, 位阻效应使得电场作用削减, 该位阻效果与周围ssDNA的密度呈正相关. 这一竞争动力学表现出两种典型机制: 在低竞争分子密度下(插图1), 静电力仍占主导地位, 使目标ssDNA能够克服空间位阻能垒通过纳米孔; 而当竞争分子密度超过临界阈值时(插图2), 电场作用不足以驱动ssDNA跨越位阻能垒. 多色曲线展示了随着周围ssDNA密度增加时, 目标 ssDNA的受力变化. 实验表明, 增大纳米孔直径与提高外加电压可有效提升捕获率[53]. 然而, 电压升高会破坏开孔电流基线稳定性, 而孔径扩大则会降低捕获事件的分辨率(详见支持信息章节S5). 通过数值模拟计算了不同表面电荷密度、长度及外加电压条件下, ssDNA在纳米孔入口与中心位置所受的电泳力、电渗力及总力值, 具体结果见图S5-3(见支持信息).
纳米孔的实际捕获效率主要受两个关键因素调控, 半捕获区内DNA分子间的位阻效应以及纳米孔的过孔能垒. 为提高捕获率, 本研究采用构象转换策略, 基于碱基互补配对原则将ssDNA结构转化为dsDNA结构. 由于双链结构的电荷量是单链结构的两倍[29,47], 因此dsDNA受到的电渗力与电泳力均显著增强. 图2d展示了作用力与表面电荷密度的关系曲线, 其中横坐标表示DNA分子的表面电荷密度, 左纵坐标表示电泳力与电渗力的大小, 右纵坐标表示总作用力大小. 随着电荷密度的增加, 电泳力以高于电渗力的速率增长, 当DNA的表面电荷密度约为－70 mC•m−2时达到平衡状态. 通过计算ssDNA与dsDNA在整个易位过程中的受力情况(图2e与2f), 发现dsDNA的运动主要由电泳力主导, 其易位方向与ssDNA相反, 这与实验结果一致. 值得注意的是, 在相同条件下, dsDNA所受电场力大小约为 ssDNA的两倍. 更强的电场力能够驱动DNA分子克服更大的能垒, 从而提高捕获率. 同时, 利用双链结构的稳定性, 可增加捕获速率常数与吸附位点数量, 显著提升理论最大捕获率.

2.3 探针法实现ssDNA的构象转换

根据待测DNA分子的序列, 实验采用了完全互补的DNA序列作为探针, 探针序列从5'端到3'端为ATCGAATAGTCTGACTACAACT(图3a紫色). 按照碱基互补配对原则, 当探针与待测DNA分子按1:1比例混合时, 溶液中的大部分待测DNA分子会与探针结合形成双链DNA分子. 为了验证探针的特异性, 对照组实验选择了一条与待检测DNA分子序列不匹配的DNA分子链, 对照DNA序列从5'端到3'端为22个连续的腺嘌呤碱基(图3a绿色). 在相同条件下进行热处理后, 互补的单链DNA分子会形成双链DNA分子, 而非互补的单链DNA则不会, 如图3a所示. 通过分析混合物的易位信息, 可以区分这两种情况(对照组离子电流数据见支持信息S6).
图3 (a) ssDNA具有特异性结合的性质. (b)在±500 mV外加电压下, 混合的DNA溶液通过纳米孔的装置示意图与离子电流信号. 其中上图为dsDNA溶液, 下图为n(dsDNA):n(ssDNA)=1:1的分子溶液. (c, d) ssDNA(橙)和dsDNA(蓝)通过5.3 nm纳米孔的幅值占位比和过孔时间直方图. (e) ssDNA(橙)和dsDNA(蓝)通过5.3 nm纳米孔的过孔时间与占位比分布散点图

Figure 3 (a) The specific binding property of ssDNA. (b) Schematic illustration of mixed DNA translocation through a nanopore and the corresponding current traces under ±500 mV applied voltage. The upper panel shows the dsDNA solution, while the lower panel shows the mixed solution of dsDNA:ssDNA at a ratio of 1:1. (c, d) Histograms of amplitude occupancy ratio (c) and dwell time (d) for ssDNA (orange) and dsDNA (blue) through a 5.3 nm nanopore under ±500 mV voltage. (e) Scatter plot of translocation time versus amplitude occupancy ratio for ssDNA (orange) and dsDNA (blue) through a 5.3 nm nanopore

在Cis室引入探针与目标DNA分子1:1混合的溶液, 通过一个5.3 nm左右的氮化硅纳米孔, 电解质为1 mol•L−1的KCl溶液. 在±500 mV的外加电压条件下, 实验记录的离子电流片段如图3b上方图所示. 正向电压条件下离子电流处于稳定基线电流水平, 未观察到明显的电流阻塞现象. 而负向电压条件下基线电流出现波动并伴随较为明显的电流阻塞现象. 这说明ssDNA在结合成dsDNA后产生了不同方向的易位信号, 易位过程从电渗力主导转变为电泳力主导, 这与数值仿真的结果一致. 为了进一步验证dsDNA易位性质, 探针和待检测ssDNA以2:1比例混合并形成n(ssDNA):n(dsDNA)=1:1的混合溶液. 在相同条件下进行实验并记录得到的离子电流信号, 如图3b下方图所示, 在正向电压和负向电压条件下均观察到明显的电流阻塞事件. 对于该实验中不同极性电压下采集到的电流阻塞信号分别进行统计, 图3c, 3d分别为正负电压下过孔信号的幅值占位比和过孔时间柱状分布图, 其中橙色和蓝色分别为正向电压和负向电压下捕获事件的统计结果. 图3c展示负向电压条件下的过孔信号(蓝色)比正向电压条件(橙色)下的过孔信号产生了更大的占位比, 这个比例大概在1.7 (0.066/0.038)倍左右. 这是因为dsDNA具有更大的等效直径, 由于占位效应引起的纳米通道内的离子减少的数目更多, 该实验结果与理论预测相一致. 图3d展示了电流堵塞事件的时间分布, 可以看出正负电压下的阻塞事件持续时间分布接近. 过孔时间与占位比分布散点图(图3e)可以明显看出正负电压下过孔信号的分布特性. 可以认为, 在正向和负向跨膜电压下得到的两种电流阻塞信号分别为ssDNA和dsDNA的易位信号.

2.4 构象转换策略实现浓度敏感的定量检测

实验研究了不同浓度的dsDNA溶液的捕获率, 在一个7 nm氮化硅纳米孔中, 电解质溶液为1 mol•L−1 KCl溶液, 纳米孔两端的外加电压为200 mV. 该实验统计了不同浓度下的纳米孔捕获事件, 不同浓度下的离子电流信号与对应的散点图见支持信息S7, 幅值占位比和过孔时间的直方图和频率点线图如图4和图5所示. 幅值分布的直方图与高斯函数拟合曲线(黑色线)如图4所示, 峰值集中在0.05附近, 符合理论预测的占位比0.048. 并且随着DNA分子浓度的增加, 拟合峰位置没有发生变化, 这说明溶液中的ssDNA已经完全结合. 纳米孔捕获事件的频率随着dsDNA的浓度而逐渐增加. 然而, DNA分子会在溶液中可能团聚形成分子团, 阻塞时间明显高于正常dsDNA. 因此浓度升高时过孔时间直方图上出现两个分布峰值. 溶液浓度越高, 产生团聚物的可能性也越大. 其中较小的峰值信号出现的频率较高, 对应着未团聚的dsDNA过孔. 双链DNA的过孔时间集中在了0.1 ms附近(图5).
图4 (a)不同浓度dsDNA溶液通过直径为7 nm的纳米孔的幅值占位比直方图. 溶液浓度分别为50、100、200、300、400、500 pmol•L−1. (b)不同浓度dsDNA溶液通过直径为7 nm的纳米孔的幅值占位比的频率点线图.

Figure 4 (a) Histograms of amplitude ratio of different concentrations of dsDNA solutions through a 7 nm nanopore. The solution concentrations are 50, 100, 200, 300, 400, and 500 pmol•L−1, respectively. (b) Dotted line plot of amplitude ratio of different concentrations of dsDNA solutions through a 7 nm nanopore

图5 (a)不同浓度dsDNA溶液通过直径为7 nm的纳米孔的过孔时间直方图. 溶液浓度分别为50、100、200、300、400、500 pmol•L−1. (b)不同浓度dsDNA溶液通过直径为7 nm的纳米孔的过孔时间的频率点线图

Figure 5 (a) Histograms of dwell time of different concentrations of dsDNA solutions through a 7 nm nanopore. The solution concentrations are 50, 100, 200, 300, 400, and 500 pmol•L−1, respectively. (b) Dotted line plot of dwell time of different concentrations of dsDNA solutions through a 7 nm nanopore

图6a与6b分别展示了浓度范围50~500 pmol•L−1、电压范围100~600 mV条件下dsDNA的捕获率. 其中, 粉色圆点为实验数据, 粉色曲线为拟合结果. 如图6a所示, 在200 mV外加电压下, 7 nm纳米孔中dsDNA的捕获效率与浓度呈线性关系. 这一现象源于dsDNA的双链结构及其电荷分布特性, 有效降低了半捕获区的空间位阻与过孔能垒. 实验结果与理论预测一致, 证实了构象转换策略能够显著提升捕获率. 为进一步验证电压对捕获率的影响, 在4.6 nm纳米孔中进行了50 pmol•L−1 dsDNA浓度下的系列实验, 外加电压范围为100 mV至600 mV. 如图6b中粉色曲线所示, dsDNA捕获率随电压升高呈指数增长. 此外, 使用9.5 nm纳米孔在50 pmol•L−1 ssDNA浓度下进行的实验表明, ssDNA的捕获率与电压呈线性依赖关系(图6b插图), 这进一步证实了构象转换策略在电压检测中的适用性. 相关电压检测的离子电流见支持信息章节S8.
图6 (a) ssDNA与dsDNA的捕获率与浓度的关系. (b) ssDNA与dsDNA的捕获率与外加电压的关系

Figure 6 (a) The relationship between capture rates and diverse DNA concentrations. (b) The relationship between capture rates and diverse voltages

3 结论

本研究通过固态纳米孔系统检测了生物标志物的浓度与捕获率的关系, 并结合数值模拟深入研究了DNA分子在纳米孔入口附近的动态竞争机制, 以揭示影响捕获率的关键因素. DNA分子的电驱动易位过程受到位阻效应的限制, 其主要机制为纳米孔入口附近的DNA分子阻碍其他分子进入捕获区域, 从而抑制了捕获率的进一步提升. 空间位阻效应强度与DNA 带电量、驱动电压和纳米孔大小等因素有关. 实验表明, 5 nm孔径的氮化硅纳米孔检测22个碱基的单链DNA (ssDNA)时, 捕获率存在明显的非线性饱和现象, 随着浓度增加, 捕获率逐渐稳定在0.12 s−1左右, 这限制了其作为生物标志物的适用性. 我们认为这是由于DNA浓度升高导致纳米孔孔口结合位点竞争加剧, 形成动态平衡. 孔口动态竞争模型被用来解释该现象, 并据此提出构象转换策略, 通过引入互补链将ssDNA转化为双链DNA (dsDNA), 实验证实该策略有效提高了低浓度下捕获率的浓度敏感性与电压敏感性, 为肺癌生物标志物miRNA的精准定量分析提供了技术基础.
我们提出的构象转换策略, 通过切换电压极性来实现靶标与非靶DNA的物理分离, 能够在复杂环境下有效降低信号解析难度, 提升检测的准确性和效率. 此外, 完全互补的DNA探针设计可以有效避免与其他DNA结合, 实现对靶标miDNA的特异性检测. 该策略依靠目标生物分子的带电量差异实现易位过程从电渗力主导驱动模式转换为电泳力主导驱动. 值得注意的是, 该方法也具有普适性, 单链RNA也可以通过构象改变策略形成双链RNA, 其带电性质与对应的DNA相近, 所以也会产生易位方向的变化, 使用DNA搭建的检测体系可以同样适用于miRNA的检测. 在这一基础上, 我们提出一种新的检测策略(见支持信息S9), 通过在混合生物标志物溶液中加入目标标志物的特异性互补链, 使得目标生物标志物转变为双链结构, 在负向电压作用下, 目标生物分子在电泳力主导下通过纳米孔, 而其他生物分子无法通过. 因此, 通过驱动电压极性和实施检测的捕获率, 即可快速确定目标生物标志物的浓度. 该方案为复杂生物样本中低丰度生物标志物的定量检测提供了新思路, 在疾病早期筛查和快速临床诊断领域具有重要的应用潜力. 在未来的工作中, 我们也会将构象转换策略用于临床诊断, 进一步验证其在复杂生物样本中的可行性和准确性.

4 实验部分

4.1 试剂与样品

氯化钾(KCl), AR, 国药; 无水乙醇(C2H5OH), AR, 国药; 丙酮(C3H6O), AR, 国药; 过氧化氢30%, AR, 国药; 硫酸(H2SO4), AR, 国药; Tris-HCl缓冲溶液, 1 mol•L−1 pH 8.0, 麦克林生化; 去离子水.
DNA 分子样品由上海生物工程技术服务有限公司提供, 采用HPLC纯化的方式, 在－20 ℃环境中冷冻保存.

4.2 DNA溶液的准备

配置样品时, 首先在离心管内注入1 mL的Tris-HCl缓冲溶液作为原液. 实际使用过程中根据所需的样品浓度, 采用1 mol•L−1 KCl电解质溶液进行稀释. 稀释好的样品在60 ℃温度下加热3 min, 随后用冰袋快速冷却至室温. 使得内部的DNA分子团散开成为单个分子链, 用于后续的检测实验. 双链DNA溶液配置时, 根据目标双链浓度, 将原液稀释至双链的双倍浓度. 随后将互补的单链溶液按照1:1的比例混合, 在振荡台上摇匀后静置. 将水浴锅加热到85 ℃, 将混合后的DNA溶液水浴加热5 min左右. 取出后自然冷却至室温即可得到对应浓度的双链溶液. 制备好的DNA溶液用1 mL的离心管分装, 在4 ℃冷藏保存.
实验中所使用的DNA分子序列如下:
待检测DNA: 5'-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3'
互补链DNA: 5'-ATCGAATAGTCTGACTACA ACT-3'
干扰链DNA: 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'
(Cheng, B.)

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