SIOC 中文
ACS
Adv search

Acta Chimica Sinica >

2025 , Vol. 83 >Issue 10: 1174 - 1183

DOI: https://doi.org/10.6023/A25060209

Article

Design, Synthesis, and Anti-inflammatory/Antioxidant Activities of Guaiazulene Dimers Bridged by Triethylene Glycol

  • Diefeng Ren a, b ,
  • Junjun Xiang b ,
  • Xike Gao , b, *
Expand
  • a College of Chemistry and Materials Science, Sichuan Normal University, Chengdu 610066, China
  • b State Key Laboratory of Organometallic Chemistry, Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China
* E-mail:

Received date: 2025-06-09

  Online published: 2025-08-25

Supported by

National Natural Science Foundation of China(22225506)

Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences(XDB0610000)

Fold

Abstract

Imbalanced release of inflammatory mediators can trigger various chronic diseases, and the development of highly effective anti-inflammatory drugs holds significant clinical value. The bridged dimerization of natural products can markedly enhance the bioactivity, selectivity, and stability of monomers. This study designed and synthesized guaiazulene (GA)-based dimers (BGA-E and BGA-T) linked via ester and ether bonds, with triethylene glycol as the spacer and the natural bicyclic sesquiterpene GA as the core structure. The anti-inflammatory and antioxidant activities of the new compounds were investigated in comparison with the reference compounds (GA and sodium guaiazulene sulfonate). The antioxidant capacity of the compounds was determined using the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging assay and the ferric ion reducing antioxidant power (FRAP) assay. The inhibitory effects of the compounds on inflammatory factors were evaluated using the Griess method, conventional enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and Western Blot analysis. Cytotoxicity was measured via the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. The results demonstrated that compound BGA-T effectively suppressed the release of the inflammatory cytokine interleukin-6 (IL-6) induced by lipopolysaccharide (LPS), reducing IL-6 secretion to 34.89% of the blank control group. Its inhibitory effect was 8-fold stronger than GA. Additionally, BGA-T exerted its anti-inflammatory effects by downregulating the expression of cyclooxygenase-2 (COX-II). None of the tested compounds exhibited significant cytotoxicity. This study provides new insights for the design of bridged dimers based on natural products and the development of anti-inflammatory drugs.

Key words： guaiazulene; triethylene glycol; anti-inflammatory; antioxidant; natural products

Cite this article

Diefeng Ren , Junjun Xiang , Xike Gao . Design, Synthesis, and Anti-inflammatory/Antioxidant Activities of Guaiazulene Dimers Bridged by Triethylene Glycol[J]. Acta Chimica Sinica, 2025 , 83(10) : 1174 -1183 . DOI: 10.6023/A25060209

1 引言

炎症是一种免疫防御机制, 当机体受到创伤或感染等问题时, 为保护并恢复组织而产生的一种复杂生理反应[1]. 炎症可分为慢性和急性炎症, 在该过程中会产生炎症介质, 例如肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白细胞介素6 (IL-6)、活性氧(ROS)以及前列腺素(PEG2)等[2]. 一般性炎症机体可以自愈, 但当炎症反应迅速或失控时会产生一些慢性疾病, 例如糖尿病、癌症和类风湿关节炎等[3]. 因此, 及时且有效地治疗炎症对维护身体健康至关重要.
利用活性单体构建桥联二聚体的分子设计策略应用于药物化学领域, 该策略通过合理的结构修饰可显著优化药物的药效学特性[4]. 研究表明, 用不同连接基团构建的桥联二聚体分子不仅可以有效增强药物的生物活性和与靶点的结合能力, 还可显著改善靶向选择性和代谢稳定性等问题[5]. 这一策略在抗氧化剂、抗肿瘤药物及抗疟疾药物的研发中取得了一定进展[6].
构效关系研究表明, 桥联二聚体及三聚体的分子设计可使其抗肿瘤活性产生数量级提升[7]. 以青蒿素类衍生物为例, 含磷酸酯连接基团的青蒿素桥联二聚体(图1)对普氏栖粪杆菌(Plasmodium falciparum)的半数抑制浓度(IC50)达到0.09~0.21 nmol•L−1水平, 其抗疟疾活性是临床用药氯喹的4700倍及青蒿素单体的300倍[8]. 一些桥联二聚体对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7产生一氧化氮(NO)的抑制活性比阳性对照组地塞米松和美他松更强[9]. 这些发现为基于活性分子桥联二聚体的创新药物设计提供了科学依据. 桥联二聚体化合物的生物活性与其结构中的单体和连接基团有关, 合理选择单体及连接基团可进一步提高桥联二聚体的生物活性.
图1 青蒿素桥联二聚体的结构式

Figure 1 The structural formula of artemisinin-bridged dimers

愈创木薁(Guaiazulene, 以下简称GA)是一种深蓝色的双环倍半萜化合物, 由五元环与七元环骈合而成(图2). GA 1号位和4号位的取代基为甲基, 7号位为异丙基. 异丙基中次甲基上的活性氢原子易参与自由基反应, 这一结构特性赋予其显著的抗氧化活性[10]. 愈创木薁是一种亲脂性化合物, 主要由愈创木精油精炼得到[11]. 研究表明, GA具有多种生物活性, 在抗细菌感染、抗肿瘤、免疫调节、修复溃疡及治疗皮炎等方面展现出良好的应用前景[12]. 此外, 美国食品药品监督管理局(FDA)已批准将GA作为化妆品着色剂使用, 并认可其在食品罐头中作为抗氧化剂使用[12].
图2 愈创木薁的结构式

Figure 2 Chemical structure of Guaiazulene

本课题组前期在薁及其衍生物的生物活性研究中合成了一系列新型薁类化合物, 部分化合物表现出较好的抗炎和抗氧化活性[13]. 针对GA的脂溶性较强, 以及生物活性不够显著等问题, 我们对其做了进一步的结构优化. 三甘醇(Triethylene glycol, 以下简称TEG)具有良好的亲水性和生物相容性, 是一种在体内外均无明显毒性和刺激性的化合物. 并且其具有抗氧化、免疫调节、保护皮肤和抗菌等作用[14]. 另外, TEG两端的羟基易于修饰, 这一特性使其展现出独特的优势, 可广泛应用于医药、化工、食品以及化妆品等领域[15]. 本工作以GA作为母体结构, TEG作为连接片段合成了具有生物活性的愈创木薁桥联二聚体化合物, 并测试其抗炎和抗氧化活性, 旨在开发兼具亲脂性和亲水性, 且具有良好的生物活性的抗炎先导化合物.

2 结果与讨论

2.1 合成与表征

BGA-E与BGA-T的合成路线如图式1所示. 以GA为起始原料, 在甲氧基(环辛二烯)合铱二聚体催化剂和2,9-二甲基-1,10-菲啰啉配体作用下, 与联硼酸频哪醇酯通过C—H键活化反应, 以97%的产率得到化合物2-频哪醇硼酸酯愈创木薁1[16]. 随后, 化合物1与溴化亚铜反应, 以84%的产率得到2-溴愈创木薁2[16]. 以醋酸钯为催化剂, 4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(Xantphos)为配体, N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)为缩水剂, 化合物2与甲酸反应, 以99%的产率得到化合物2-羧基愈创木薁3[17]. 最后, 化合物3与三甘醇发生酯化反应, 以35%的产率得到目标化合物BGA-E. 以化合物3为原料, 经BH3•THF络合物还原, 以85%的产率得到2-甲醇愈创木薁4[18]. 化合物4与三甘醇二对甲苯磺酸酯通过Williamson醚合成反应, 得到目标化合物BGA-T, 产率为30%. 化合物BGA-E与BGA-T分别为绿色和蓝色油状液体. 通过1H NMR, 13C NMR, 傅里叶红外光谱(FT-IR)和高分辨质谱(HRMS)表征了目标化合物的化学结构. 其中, 化合物BGA-E中与酯基相连的亚甲基氢信号(H-3)位于δ 4.54处, 为三重峰, 而在化合物BGA-T中与薁环相连的亚甲基氢信号(H-4)位于δ 4.80处, 为单峰(图3).
图式1 BGA-E和BGA-T的合成路线

Scheme 1 Synthetic routes of BGA-E and BGA-T

图3 BGA-E和BGA-T的1H NMR谱图

Figure 3 1H NMR spectra of compounds BGA-E and BGA-T

2.2 体外抗氧化能力研究

本研究采用两种经典的方法来测定化合物BGA-E、BGA-T、GA和愈创木薁磺酸钠(GA-SO3Na)的抗氧化活性: 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除法和铁离子还原抗氧化能力(FRAP)法. DPPH自由基清除法通过检测化合物对稳定自由基(DPPH•)的氢原子供给能力评估其抗氧化活性; 而FRAP法则基于化合物还原Fe³⁺的电子转移效率反映抗氧化能力[19]. 结合这两种方法评估化合物BGA-E和BGA-T的体外抗氧化能力, 可以更全面地揭示化合物的抗氧化机制和活性强度.

2.2.1 DPPH自由基清除法测定抗氧化能力

DPPH自由基是一种稳定的氮中心自由基, 其深紫色的乙醇溶液在517 nm处具有特征吸收峰[20]. 当抗氧化剂通过氢原子转移机制还原DPPH•时, 生成无色的DPPH-H, 导致517 nm处吸收峰的吸光度下降. 通过检测吸光度变化可定量评估化合物的自由基清除能力[21].
如图4和表1所示, 分别测试了BGA-E、BGA-T、GA和GA-SO3Na四个化合物在0.5 h和4 h时的吸光度, 并通过计算得到自由基清除率. 在400 μmol•L−1浓度下, BGA-E在0.5 h和4 h时的DPPH自由基清除率分别为24.1%和31.9%, BGA-T的清除率分别为17.5%和24.4%. 四个化合物的DPPH自由基清除率表现为: BGA-E>BGA-T>GA>GA-SO3Na. 在400 μmol•L−1浓度下作用4 h后桥联二聚体化合物BGA-E的自由基清除率是GA单体的2.65倍. BGA-E的抗氧化能力更强可能是因为其结构中的酯基作为吸电子基团, 降低了愈创木薁分子骨架的电子云密度, 使其异丙基的次甲基H上的电子云密度降低, 更容易被DPPH•进攻, 形成稳定的自由基中间体, 从而增强了化合物的抗氧化能力. 由于桥联二聚体化合物的溶液颜色比单体更深, 可能导致测量值低于实际值, 造成一定的误差. 此外, 从表1可见桥联二聚体化合物(BGA-E和BGA-T)在4 h时的DPPH自由基清除率较0.5 h时显著提升, 而单体(GA和GA-SO3Na)的清除率随时间变化不明显, 表明二聚体的抗氧化作用具有更强的持续性.
图4 不同浓度的化合物分别在0.5 h (a)和4 h (b)时对DPPH自由基的清除率

Figure 4 The scavenging rates of different concentrations of compounds against DPPH radicals at 0.5 h (a) and 4 h (b)

Data are given as mean±standard error of mean (SEM). Statistical analysis is performed by oneway analysis of variance (ANOVA). **p<0.01

表1 不同浓度的化合物在0.5 h和4 h时对DPPH自由基的清除率

Table 1 The scavenging rates of different concentrations of compounds against DPPH radicals at 0.5 h and 4 h

化合物 时间/h 自由基清除率a/%
50 μmol•L−1 100 μmol•L−1 200 μmol•L−1 400 μmol•L−1
BGA-E 0.5 12.86 14.25 18.90 24.13
4 14.19 16.58 23.58 31.91
BGA-T 0.5 11.25 12.06 12.70 17.52
4 13.35 14.72 14.83 24.44
GA 0.5 11.84 11.86 13.88 10.15
4 12.35 12.51 13.91 12.03
GA-SO3Na 0.5 10.86 10.95 10.40 9.20
4 11.23 11.64 11.24 9.69

a Calculated by the formula.

2.2.2 FRAP法测定抗氧化能力

1996年, Benzie和Strain[22]提出一种灵敏且准确的抗氧化能力测定方法——FRAP法. FRAP法是一种基于氧化还原反应的抗氧化能力检测技术. 在酸性缓冲体系(pH=3.6)中, 抗氧化剂能将无色的Ferric Tripyridyltriazine (Fe3+-TPTZ)复合物还原为蓝色的Fe2+-TPTZ, 该复合物在593 nm波长处具有特征性吸收峰. 通过分光光度法测定吸光值(OD), 即可定量样本的还原能力, 从而反映其总抗氧化活性[23].
结果如图5和表2所示, 分别测试了四个化合物BGA-E、BGA-T、GA和GA-SO3Na在浓度为50、100、200和400 μmol•L−1时于626 nm波长下的OD值. 400 μmol•L−1浓度时, GA的OD值为0.57, 显示出最佳的Fe³+-TPTZ的还原能力. 化合物的吸光度大小顺序为GA>BGA-T>GA-SO3Na>BGA-E, 这可能是由于酯基和磺酸钠基团的吸电子效应使愈创木薁上的电子云密度降低, 减弱了其对Fe3+-TPTZ的还原能力. 但所有化合物均具有对Fe3+-TPTZ的还原能力. 此外, 实验结果显示化合物对Fe3+-TPTZ的还原能力具有明显的浓度依赖性.
图5 FRAP法测定不同浓度化合物的OD值

Figure 5 Measurement of OD values for compounds at different concentrations by FRAP assay

Data are given as mean±SEM

表2 FRAP 法测定化合物的OD值

Table 2 Measurement of OD values for compounds at different concentrations by FRAP assay

化合物 OD值
50 μmol•L−1 100 μmol•L−1 200 μmol•L−1 400 μmol•L−1
BGA-E 0.0685 0.0827 0.1011 0.1389
BGA-T 0.1005 0.1503 0.2267 0.3357
GA 0.1084 0.1772 0.3135 0.5741
GA-SO3Na 0.0955 0.1370 0.2090 0.3346
化合物连接吸电子基团会削弱化合物整体的给电子能力, 从而降低FRAP法中化合物对Fe3+-TPTZ的还原能力. 而DPPH自由基清除实验中, GA的抗氧化活性主要源于异丙基上次甲基氢(H)的活泼性, 该氢原子易被DPPH•夺取, BGA-E中酯基降低了次甲基H的电子云密度, 增强了其被自由基进攻的活性, 由于化合物对FRAP法和DPPH自由基清除法的实验原理不同, 导致测定结果呈现差异, 但两种方法共同证实了GA及其衍生物具备一定的抗氧化活性.

2.3 体外抗炎能力研究

RAW 264.7细胞是小鼠单核巨噬细胞, 具有巨噬细胞的多种典型特征, 例如可以发挥吞噬功能, 进行抗原呈递以及分泌多种炎症因子等[24]. 由于其良好的可操作性和稳定性, 在免疫学和炎症研究中广泛用作体外模型[25]. 脂多糖是革兰氏阴性菌胞外膜上最外层和最主要的成分, 它是一种强效免疫激活物质, 会通过Toll-like receptor 4 (TLR 4)受体激活免疫反应, 激活核因子κB (NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的信号通路, 产生NO和活性氧(ROS)等, 这些信号会诱导免疫细胞产生炎症反应[26].

2.3.1 Griess法测试化合物对LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症模型的NO抑制率

研究表明, NO过量会导致细胞凋亡、DNA损伤和ROS积累, 从而导致炎症的产生[27]. NO易氧化为NO2, 继而转化为$NO_{2}^{-}$.$NO_{2}^{-}$与对氨基苯磺酸及萘乙二胺生成粉色偶氮化合物, 在波长为540 nm处检测其吸光度, 吸光度与$NO_{2}^{-}$浓度呈正相关, 从而间接推测NO的含量[28].
用LPS诱导RAW 264.7产生炎症模型, 随后加入不同浓度的四种化合物, 浓度分别设置为10、20、40和80 μmol•L−1, 在恒温培养箱中培养48 h后, 取上清液通过Griess法测NO含量. 结果如图6和表3所示, 化合物BGA-E和BGA-T具有明显的浓度依赖性, 显示出比对照组GA和GA-SO3Na更显著的NO抑制率, BGA-E和BGA-T在浓度为80 μmol•L−1时的NO抑制率分别为47.75%和57.92%, 是GA的1.76倍和2.13倍.
图6 不同浓度的化合物对LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症模型的NO抑制率

Figure 6 NO inhibition rates of compounds at various concentrations in LPS-stimulated RAW 264.7 cells

Data are given as mean±SEM. Statistical analysis is performed by Two-way analysis of variance (ANOVA). ****p<0.0001, ***p<0.001, **p<0.01 compared to GA and GA-SO3Na

表3 不同浓度的化合物对LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症模型的NO抑制率

Table 3 NO inhibition rates of compounds at various concentrations in LPS-stimulated RAW 264.7 cells

化合物 浓度/(μmol•L−1) 抑制率a/%
BGA-E 10 16.60
20 23.01
40 36.23
80 47.75
BGA-T 10 15.61
20 28.57
40 43.99
80 57.92
GA 10 12.88
20 19.52
40 23.05
80 27.19
GA-SO3Na 10 4.49
20 2.85
40 6.18
80 15.32
模型组 — 0

a Calculated by the formula.

2.3.2 化合物对LPS诱导的小鼠RAW 264.7巨噬细胞中促炎因子TNF-α和IL-6的影响

TNF-α和IL-6等促炎因子在炎症反应中起着关键作用. 当TNF-α和IL-6在体内异常升高时, 可能引发免疫应激反应, 激活多种炎症通路, 从而导致慢性炎症和组织损伤[29]. 高灵敏度的酶联免疫吸附试验(ELISA)法通过抗原-抗体特异性结合来定量和定性分析目标分子的浓度, 能够较精准地检测细胞培养液或组织样本中的促炎因子[30].
实验以母体GA和商用药物GA-SO3Na作为对照组, BGA-E和BGA-T作为实验组, 采用ELISA法测定这些化合物的抗炎活性. 如图7和表4所示, 化合物BGA-E、BGA-T、GA和GA-SO3Na均能够显著抑制IL-6的表达, 且化合物BGA-T对TNF-α和IL-6的抑制效果均优于BGA-E. 在80 μmol•L−1浓度下, BGA-T组TNF-α和IL-6的相对含量分别达到77.14%和34.89%, 其对IL-6的抑制效果是母体GA的八倍(抑制效果=(100%-BGA-T组IL-6相对含量)/(100%-GA组IL-6相对含量)), 表现出显著的抗炎活性, 具有减轻炎症反应的应用潜力.
图7 不同化合物对LPS诱导的RAW 264.7细胞中TNF-α (a)和IL-6 (b)相对含量的影响

Figure 7 The effect of different compounds on the relative amount of TNF-α (a) and IL-6 (b) in LPS-induced RAW 264.7 cells

Data are given as mean±SEM. Statistical analysis is performed by Two-way analysis of variance (ANOVA). ****p<0.0001, ***p<0.001, **p<0.01 compared to GA and GA-SO3Na

表4 化合物对LPS诱导的RAW 264.7细胞中TNF-α和IL-6的相对含量

Table 4 The relative amounts of TNF-α and IL-6 in LPS-induced RAW 264.7 cells with the compounds

化合物 浓度/ (μmol•L−1) 相对含量a/%
TNF-α IL-6
BGA-E 20 101.71 88.40
40 105.33 71.76
80 139.79 45.83
BGA-T 20 94.47 79.25
40 89.67 63.89
80 77.14 34.89
GA 20 101.29 98.72
40 114.84 95.28
80 122.68 92.17
GA-SO3Na 20 88.96 103.13
40 84.68 96.59
80 82.98 91.48
模型组 — 100.00 100.00

a Calculated by the formula.

2.3.3 Western Blot法测化合物对COX-Ⅱ的释放

COX-Ⅱ是一种诱导型酶, 受多种炎症因子和信号通路的调控, 是一种重要的炎症相关靶标[31]. Western Blot (WB)实验是一种用于检测特定蛋白质的经典方法, 该技术通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质, 将其转移至固体支持膜上, 随后通过与特异性抗体进行检测, 经曝光显影扫描得到相应的图像[32]. 该方法可以有效避免化合物本身的颜色对实验结果造成影响.
已有研究表明, 薁的衍生物母菊薁(Chamazulene)可通过抑制NF-κB信号通路下调COX-Ⅱ的表达[33]. 基于愈创木薁(GA)与母菊薁在结构上的相似性, GA也有可能下调COX-Ⅱ的表达.
将小鼠巨噬细胞RAW 264.7接种于6孔板中, 培养24 h后, 用含LPS和不同浓度化合物(BGA-T、BGA-E和GA-SO3Na)的培养基处理48 h. 待细胞裂解后通过SDS-PAGE电泳分离蛋白, 转膜并封闭, 依次孵育一抗(COX-Ⅱ、β-Actin)和二抗(HRP辣根过氧化物酶偶联), 最后用增强型化学发光(ECL)显影液曝光并扫描获取WB条带图, 分析化合物对COX-Ⅱ表达的影响. 条带颜色越浅, 表明在该浓度下对COX-Ⅱ的抑制效果越显著(图8).
图8 不同化合物影响LPS诱导的RAW 264.7细胞中COX-II表达的WB条带图

Figure 8 Western blot bands showing the effects of different compounds on COX-II expression in LPS-induced RAW 264.7 cells

化合物BGA-E与GA-SO3Na在COX-Ⅱ抑制活性方面表现相当, BGA-T在80 μmol•L−1浓度时表现出最佳的抑制效果. 利用ImageJ软件进行定量分析(图9), 三个化合物相较于二甲基亚砜(DMSO)对照组均表现出显著性差异, 且p<0.0001, 具有统计学意义. 与DMSO空白对照组相比, 化合物BGA-T能够显著抑制COX-Ⅱ的表达, 使其含量降至对照组的23.65%(见支持信息), 表现出明显的抑制作用.
图9 不同化合物对LPS诱导的RAW 264.7细胞中COX-II相对含量的影响

Figure 9 The effect of different compounds on the relative amount of COX-II in LPS-induced RAW 264.7 cells

Data are given as mean±SEM. Statistical analysis is performed by One-way analysis of variance (ANOVA). ****p<0.0001, ***p<0.001, **p<0.01 compared to DMSO

2.4 细胞毒性研究

Cell Counting Kit-8 (CCK-8)法是一种广泛应用于检测细胞增殖和细胞毒性的方法. 水溶性四氮唑-8 (WAT-8)能够被线粒体脱氢酶还原为一种水溶性的橙色化合物甲臜(MTT). 随细胞毒性的增大, 线粒体功能受损, 生成的MTT数量减少, 从而导致溶液颜色变浅[34]. 通过酶标仪测量其吸光度, 利用公式计算细胞存活率.
化合物BGA-E、BGA-T、GA和GA-SO3Na分别在20、40、80和160 μmol•L−1浓度下与小鼠巨噬细胞RAW 264.7共同培育48 h后, 通过CCK-8法测其细胞毒性. 结果显示(图10), 在80 μmol•L−1浓度内四个化合物细胞存活率均在99%以上, 表现出极低的细胞毒性.
图10 化合物对巨噬细胞RAW 264.7细胞存活率的影响

Figure 10 Effects of compounds on the cell viability of macrophage RAW 264.7 cells

3 结论

通过酯化反应和Williamson反应合成了两个愈创木薁桥联二聚体化合物BGA-E和BGA-T, 并将其与母体化合物GA及商用化合物GA-SO3Na进行了对比研究. 研究发现, 两种桥联二聚体化合物均表现出一定的抗氧化能力, 表明其为有效的抗氧化剂, 当化合物连接吸电子基团时会增强DPPH自由基清除率, 降低FRAP中Fe3+-TPTZ复合物的还原效率. 通过Griess法检测NO含量, ELISA法检测IL-6和TNF-α的表达水平. 结果显示连接给电子基团的化合物BGA-T在80 μmol•L−1浓度下对上述炎症因子表现出最优的抑制效果. Western Blot实验进一步验证了BGA-T在80 μmol•L−1浓度下对COX-Ⅱ蛋白表达的显著抑制作用. 在安全性评估方面, 通过CCK-8法检测细胞毒性, 结果表明所有测试化合物在实验浓度范围内表现出极低的细胞毒性. 连接给电子基团的化合物BGA-T整体生物活性(NO、IL-6、TNF-α、COX-Ⅱ的抑制效果)强于连接吸电子基团的化合物BGA-E, 且活性均强于单体GA. 化合物BGA-T展现出较好的抗氧化活性、显著的抗炎效果以及良好的生物安全性, 有望成为新型抗炎药物的候选分子.

4 实验部分

4.1 试剂与仪器

核磁共振(1H NMR, 和13C NMR)由VARIAN 400 核磁共振波谱仪或 Bruker AV500 核磁共振波谱仪测定, 傅里叶红外光谱(FT-IR)由Thermo Fisher Nicolet FT-IR spectrometer型红外分析仪测定; 高分辨质谱(HRMS)由Thermo Fisher Scientific LTQ FTICR-MS 质谱仪测定; 吸光度由美国多功能酶标仪PerkinElmer EnVision测定.
所有试剂和溶剂均来自商业购买, 未经进一步纯化直接使用. MesGen Biotech购于上海麦克林生化科技有限公司; 一氧化氮(NO)检测试剂盒、抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)、RIPA细胞裂解液购于碧云天; RAW 264.7细胞、LPS (TLR4 激活剂)、Mouse TNF-α和IL-6 ELISA Kit检测试剂盒购于上海迈谨生物技术有限公司; 兔源COX-Ⅱ多克隆抗体购于Proteintech; CCK-8检测试剂盒、抗β-Actin单克隆抗体、ECL超敏化学发光试剂盒和脱脂奶粉购于MesGen Biotech; 蛋白酶抑制剂Protease Inhibitor Cocktailg购于GLPBIO; NC转印膜购于PALL; 5~7英寸感光胶片购于白云三和.

4.2 化合物的合成

2-联硼酸频那醇酯愈创木薁(1): 参考文献中的合成方法[16]. 250 mL Schlenk瓶中依次加入GA (19.8 g, 100 mmol), 联硼酸频那醇酯(27.9 g, 110 mmol), 2,9-二甲基-1,10-菲啰啉(208.3 mg, 1 mmol)和[Ir(OMe)(cod)]2 (331.4 mg, 0.5 mmol). 抽换氮气三次后, 在氮气氛围下加入100 mL干燥的正庚烷. 将反应瓶置于110 ℃油浴中搅拌2 h. 待反应恢复至室温后加50 mL水淬灭, 石油醚萃取三次(50 mL×3), 有机相用无水硫酸钠干燥, 浓缩后硅胶柱层析[V(石油醚PE)∶V(乙酸乙酯EA)=50∶1], 得到31.5 g蓝色固体1, 产率为97%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.23 (d, J=2.0 Hz, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.38 (dd, J=10.5, 2.0 Hz, 1H), 6.94 (d, J=10.5 Hz, 1H), 3.05 (hept, J=6.9 Hz, 1H), 2.82 (s, 3H), 2.82 (s, 3H), 1.40 (s, 12H), 1.35 (d, J=6.9 Hz, 6H).
2-溴愈创木薁(2): 参考文献中的合成方法[16]. 500 mL单口瓶中加入CuBr (2.4 g, 15 mmol)和30 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF). 将反应瓶置于90 ℃油浴中搅拌10 min. 加入溶解于60 mL DMF的1 (4.9 g, 15 mmol)溶液, 继续反应3 h. 待反应恢复至室温后加入20 mL水淬灭, 用硅藻土过滤去除金属盐, 用乙酸乙酯将海藻酸钠中残留的产物溶解, 滤液水洗三次(200 mL×3)除去DMF, 有机相用无水硫酸钠干燥. 浓缩, 硅胶柱层析(石油醚), 得到3.5 g蓝色油状物2, 产率为84%. 1H NMR (500 MHz, CD2Cl2) δ: 8.19 (d, J=2.0 Hz, 1H), 7.49 (dd, J=10.6, 2.0 Hz, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.12 (d, J=10.6 Hz, 1H), 3.11 (hept, J=6.9 Hz, 1H), 2.77 (s, 3H), 2.58 (s, 3H), 1.36 (d, J=6.9 Hz, 6H).
2-羧酸愈创木薁(3): 参考文献中的合成方法[17]. 于100 mL Schlenk瓶中依次加入2 (3.0 g, 10.8 mmol), 醋酸钯(72.7 mg, 0.3 mmol), 4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(187.5 mg, 0.3 mmol), N,N-二环己基碳二亚胺(4.5 g, 21.6 mmol). 抽换氮气三次后, 在氮气氛围下加入20 mL干燥的DMF和干燥的三乙胺(3 mL, 21.6 mmol), 缓慢滴加239 μL甲酸. 将反应置于80 ℃油浴中搅拌4 h. 待反应恢复至室温后, 加氢氧化钠水溶液调pH至8~9, 析出大量绿色固体, 少量水洗后用乙酸乙酯溶解. 溶液中滴加稀硫酸调pH至弱酸性, 析出大量绿色固体, 再次抽滤得到产物3, 用少量水洗涤后干燥, 得到2.6 g绿色固体3, 产率为99%. m.p. 148~149 ℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.38 (d, J=2.0 Hz, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.49 (dd, J=10.5, 1.9 Hz, 1H), 7.04 (d, J=10.5 Hz, 1H), 3.08 (hept, J=6.9 Hz, 1H), 2.91 (s, 3H), 2.85 (s, 3H), 1.37 (d, J=7.0 Hz, 6H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 172.00, 149.56, 141.43, 138.60, 137.94, 137.77, 135.83, 132.95, 129.03, 126.20, 115.79, 100.12, 38.39, 24.77, 24.51, 11.93; IR (KBr) v: 2957.5, 2579.7, 2361.1, 1671.3, 1556.8, 1505.7, 1433.7, 1400.1, 1322.4, 1258.0, 1200.0, 1059.0, 956.2, 822.8, 773.9, 696.8 cm−1; HRMS (ESI) m/z: [M＋H]+ calcd for C16H19O2 243.1307, found 243.1378.
(双(愈创木薁-2-甲酸)三甘醇酯(BGA-E): 25 mL Schlenk瓶中依次加入3 (533.1 mg, 2.2 mmol), 1-乙基- (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI) (575.1 mg, 3 mmol), 4-二甲氨基吡啶(DMAP) (6.1 mg, 0.05 mmol). 抽换氮气三次后, 在氮气氛围下加入3 mL二氯甲烷, 搅拌溶解后加入三甘醇(136.5 μL, 1 mmol). 室温反应12 h, 待反应结束后, 加入15 mL水淬灭, 二氯甲烷萃取三次(10 mL×3), 干燥浓缩, 硅胶柱层析[V(PE)∶V(EA)=1∶1], 得到209.6 mg绿色油状产物BGA-E, 产率为35%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.33 (d, J=2.0 Hz, 2H), 7.68 (s, 2H), 7.45 (dd, J=10.5, 1.9 Hz, 2H), 7.00 (d, J=10.5 Hz, 2H), 4.54 (t, J=4.9 Hz, 4H), 3.92 (t, J=4.9 Hz, 4H), 3.79 (s, 4H), 3.06 (hept, J=7.0 Hz, 2H), 2.86 (s, 6H), 2.80 (s, 6H), 1.36 (d, J=6.9 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 166.66, 148.85, 141.15, 137.97, 137.52, 137.33, 135.65, 133.62, 128.05, 125.99, 115.14, 70.81, 69.57, 63.52, 38.28, 24.71, 24.41, 11.79; IR (KBr) ν: 3523, 2958, 2869, 1933, 1709, 1598, 1557, 1528, 1501, 1462, 1387, 1368, 1343, 1323, 1283, 1228, 1143, 1067, 957, 923, 868, 823, 772, 736, 718, 637, 564, 538 cm−1; HRMS (ESI) m/z: [M＋H]+ calcd for C38H47O6 599.3366, found 599.3367.
羟甲基愈创木薁(4): 参考文献中的合成方法[18]. 250 mL单口瓶中依次加入3 (1.2 g, 5 mmol), 25 mL四氢呋喃, 冰浴下缓慢加入BH3•THF (25 mL, 25 mmol), 室温反应2 h. 反应完毕后倒入至100 mL冰水中, 有大量固体析出, 抽滤并用少量水洗滤饼. 干燥后得到970 mg蓝色固体4, 产率为85%. m.p. 101~102 ℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.19 (d, J=2.0 Hz, 1H), 7.41 (dd, J=10.7, 1.9 Hz, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.04 (d, J=10.7 Hz, 1H), 5.05 (s, 2H), 3.08 (hept, J=6.9 Hz, 1H), 2.83 (s, 3H), 2.59 (s, 3H), 1.36 (d, J=6.9 Hz, 6H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 148.07, 144.18, 140.63, 136.94, 136.81, 134.84, 133.06, 125.83, 121.72, 111.86, 60.64, 38.46, 24.91, 24.24, 10.38; IR (KBr) v: 3420.8, 2955.8, 2922.1, 2864.3, 1559.1, 1530.3, 1498.2, 1453.3, 1410.3, 1384.3, 1365.9, 1331.9, 1309.1, 1277.4, 1240.6, 1226.2, 1201.0, 1080.4, 1051.6, 1014.6, 952.8, 805.2, 718.9, 640.2, 535.2 cm−1; HRMS (ESI) m/z: [M＋H]+ calcd for C16H21O 229.1514, found 229.1587.
1,12-二愈创木薁-2,5,8,11-四氧杂十二烷(BGA-T): 50 mL Schlenk瓶中加入4 (456.6 mg, 2 mmol)和氢化钠(192 mg, 8 mmol), 加入8 mL干燥的四氢呋喃, 抽换氮气三次后, 在80 ℃油浴中搅拌20 min. 在氮气氛围下加入三乙烯基二醇(458.6 mg, 1 mmol). 继续反应4 h. 反应完毕后加入2 mL 1 mol/L稀盐酸淬灭反应, 再加入15 mL饱和食盐水, 用EA (10 mL×3)萃取三次. 干燥浓缩, 硅胶柱层析[V(PE)∶V(EA)=5∶1], 得到171.24 mg蓝色油状产物BGA-T, 产率为30%. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.16 (d, J=1.9 Hz, 2H), 7.45 (dd, J=10.6, 1.9 Hz, 2H), 7.20 (s, 2H), 7.03 (d, J=10.7 Hz, 2H), 4.80 (s, 4H), 3.60 (s, 8H), 3.56 (s, 4H), 3.08 (hept, J=6.8 Hz, 2H), 2.72 (s, 6H), 2.49 (s, 6H), 1.30 (d, J=6.9 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 145.59, 143.91, 140.28, 136.82, 136.55, 134.59, 132.81, 125.56, 122.61, 113.19, 70.88, 70.78, 69.70, 68.42, 38.41, 24.89, 24.21, 10.47; IR (KBr) v: 2957, 2924, 2866, 2243, 1697, 1558, 1528, 1459, 1386, 1362, 1283, 1248, 1204, 1116, 1050, 951, 909, 815, 732, 646, 541, 420, 407 cm−1; HRMS (ESI) m/z: [M＋H]+ calcd for C38H51O4 571.3782, found 571.3782.

4.3 体外抗氧化活性测定

4.3.1 DPPH自由基清除率的测定

配制0.2 mmol•L−1的DPPH母液, 用无水乙醇配制浓度分别为10、20、40和80 μmol•L−1化合物BGA-E、BGA-T、GA、GA-SO3Na溶液, 低温避光保存. 在96孔板中加入100 μL DPPH溶液和100 μL不同化合物的溶液作为测试组, 室温避光放置0.5 h, 用酶标仪检测其在517 nm下的吸光度As, 4 h后再次测量. 在96孔板中加入100 μL不同化合物的溶液和100 μL乙醇作为对照组, 室温避光放置0.5 h后, 用酶标仪检测其在517 nm下的吸光度A0, 4 h后再次测量. 在96孔板中加入100 μL DPPH溶液和100 μL乙醇作为空白组, 室温避光放置0.5 h后, 用酶标仪检测其在517 nm下的吸光值Ac, 4 h后再次测量. 每组均设置3个复孔.
DPPH自由基清除率(%)=[1-(As-A0)/Ac]×100%

4.3.2 FRAP法测总抗氧化能力

配制抗坏血酸溶液(浓度为0、4.88、9.77、19.53、39.06、78.13、156.25、312.50和625 μmol•L−1). 称取试剂盒中FeSO4•7H2O, 配制成100 mmol•L−1的二甲亚砜溶液, 在96孔板每孔中加入180 μL现配的FRAP工作液, 再加入20 μL的抗坏血酸溶液, 均设置3个复孔. 将其混匀后在37 ℃下孵育3 min, 用酶标仪测其在626 nm处的吸光值, 计算得到标准曲线. 同标准曲线测定方法, 测定四种化合物, 将化合物分别稀释为50、100、200和400 μmol•L−1溶液, 通过其吸光度判断化合物的抗氧化能力.
相对抗氧化能力=总抗氧化能力/样品浓度

4.4 体外抗炎活性测定

4.4.1 Griess法检测化合物对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型中NO的抑制作用

将小鼠巨噬细胞RAW 264.7接种于含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基中, 在37 ℃, 5%的二氧化碳恒温培养箱中培养, 每24 h更换一次培养基. 待细胞传至三代后, 将细胞以每毫升5×104个的密度接种于96孔板中, 继续孵育24 h. 实验组和对照组分别加入不同浓度(10、20、40和80 μmol•L−1)的化合物, 培养1 h后加入LPS (100 ng/孔), 继续培养48 h, 置于离心机离心(转速1000 r/min, 时间1 min)后, 收集上清液. 通过酶标仪测其吸光值, 以公式计算NO的抑制率.
NO抑制率(%)=[1-(实验组OD值/模型组OD值)]×100%

4.4.2 ELISA法测化合物对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型的TNF-α和IL-6的抑制作用

用含10% FBS的DMEM高糖培养基, 将小鼠巨噬细胞RAW 264.7接种于培养基中, 置于37 ℃, 5% CO2恒温培养箱中培养, 每24 h更换一次新鲜培养基, 直至细胞传至第三代. 将第三代细胞以5×104个/mL的密度接种于96孔板中, 孵育24 h. 实验组和对照组分别加入不同浓度的化合物, 培养1 h后加入LPS (100 ng/孔)继续培养48 h. 培养结束后, 进行离心(转速1000 r/min, 时间1 min), 收集上清液. 用ELISA试剂盒检测细胞因子IL-6和TNF-α的相对含量(细胞因子含量根据预先建立的标准曲线, 通过OD值计算得出).
细胞因子相对含量(%)=(实验组细胞因子含量/对照组细胞因子含量)×100%

4.4.3 WB法检测化合物对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型中COX-Ⅱ的抑制作用

将小鼠巨噬细胞RAW 264.7以8000个/孔的密度均匀铺种于6孔细胞培养板中, 在37 ℃, 5% CO2的培养箱中培养24 h. 小心吸去细胞培养基, 每孔加入LPS (100 ng/孔)以及浓度分别为10、20、40和80 μmol•L−1化合物的完全培养基, 并设置DMSO空白对照组及DMSO＋LPS诱导组, 在37 ℃, 5% CO2培养箱中培养48 h. 吸去培养基, 每孔加入300 µL细胞裂解液, 1X蛋白上样缓冲液(含溴酚蓝, 1X表示一倍浓度), 及1X蛋白酶抑制剂Cocktail, 用细胞刮器刮取细胞, 转移至洁净的1.5 mL离心管中, 在95 ℃水浴中加热20 min, 得到SDS-PAGE蛋白样品. 采用含12% SDS-PAGE的凝胶, 每孔加入10 µL蛋白样品, 电泳开始时使用80 V恒定电压, 持续120 min; 随后升至100 V, 继续电泳120 min. 电泳结束后, 取下转印膜, 根据预染蛋白分子量标准条带位置剪下对应蛋白的部分用于后续封闭和抗体结合. 将转印膜放入含5%脱脂奶粉的1X Tris Buffered Saline Tween (TBST缓冲液)中, 在室温下孵育1 h. 用1X TBST缓冲液漂洗2~3次. 将兔源COX-Ⅱ抗体稀释为1∶1000, 并加入含3%牛血清白蛋白(BSA)的1X TBST缓冲液中, 将小鼠来源的β-Actin内参抗体稀释为1∶3000, 加入同样的缓冲液中, 放置于4 ℃摇床中过夜. 用1X TBST缓冲液漂洗转印膜5~6次. 将羊抗兔HRP偶联二抗和羊抗小鼠HRP偶联二抗分别按1∶5000稀释于含3% BSA的1X TBST中, 加入至转印膜中, 室温摇床孵育1 h. 再用1X TBST缓冲液漂洗5~6次. 最后, 将转印膜固定于X光胶片暗盒内, 加入超敏ECL反应液, 在暗房中显影, 待感光胶片显影稳定后, 风干并扫描得到WB条带原始图像.

4.5 细胞毒性测定

4.5.1 CCK-8法检测化合物对巨噬细胞RAW 264.7细胞活性的影响

在96孔板中将巨噬细胞以密度为5×104个/mL接种, 每孔100 μL, 孵育24 h. 分别加入不同浓度的化合物(20、40、80和160 μmol•L−1)作为实验组, 同时空白组中加入相同体积的细胞培养液, 继续培养48 h后向每孔中加入100 μL, 10% CCK-8无血清DMEM培养液, 在37 ℃, 含5% CO₂的细胞培养箱中孵育45 min, 用酶标仪测量在450 nm处的吸光值, 通过公式计算细胞存活率.
细胞存活率(%)=(实验组OD值/空白对照组OD值)×100%.

4.6 统计方法

采用GraphPad Prism 8.0.1软件对数据进行one-way和two-way ANOVA方差分析, 显著水平为0.05.
Cheng, B.

References

Publishing order | Descend order by publishing year | Descend order by cited within
[1]
Libby P. Nutr. Rev. 2007, 65, S140.

[2]
Abdulkhaleq L. A.; Assi M. A.; Abdullah R.; Zamri-Saad M.; Taufiq-Yap Y. H.; Hezmee M. N. M. Vet. World 2018, 11, 627.

[3]
Zhao H.; Wu L.; Yan G.; Chen Y.; Zhou M.; Wu Y.; Li Y. Sig. Transduct. Target. Ther. 2021, 6, 263.

[4]
Paquin A.; Reyes-Moreno C.; Bérubé G. Molecules 2021, 26, 2340.

[5]
Chen X.; Yan Y.; Zhang Z.; Zhang F.; Liu M.; Du L.; Zhang H.; Shen X.; Zhao D.; Shi J. B. J. Med. Chem. 2021, 64, 11857.

[6]
Patel O. P. S.; Beteck R. M.; Legoabe L. J. Eur. J. Med. Chem. 2021, 213, 113193.

[7]
Reiter C.; Fröhlich T.; Gruber L.; Hutterer C.; Marschall M.; Voigtländer C.; Friedrich O.; Kappes B.; Efferth T.; Tsogoeva S. B. Bioorg. Med. Chem. 2015, 23, 5452.

[8]
Fröhlich T.; Çapcı Karagöz A.; Reiter C.; Tsogoeva S. B. J. Med. Chem. 2016, 59, 7360.

DOI PMID

[9]
Fan Y.; Shen J.; Liu Z.; Xia K.; Zhu W.; Fu P. Nat. Prod. Rep. 2022, 39, 1305.

[10]
Kourounakis A. P.; Rekka E. A.; Kourounakis P. N. J. Pharm. Pharmacol. 1997, 49, 938.

PMID

[11]
Pratsinis H.; Haroutounian S. Nat. Prod. Lett. 2002, 16, 201.

PMID

[12]
Akram W.; Tagde P.; Ahmed S.; Arora S.; Emran T. B.; Babalghith A. O.; Sweilam S. H.; Simal-Gandara J. Life Sci. 2023, 316, 121389.

[13]
((a) Li L.;Zhu, C. C.: Zhu, Q. K.; Chen, Z. J.; Gao, X. K. Chin. J. Org. Chem. 2022, 42, 2906 (in Chinese).

(李蕾, 朱聪聪, 朱权刚, 陈中建, 高希珂, 有机化学, 2022, 42, 2906.)

DOI

((b) Xiao M. J.; Gao X. K. Chin. J. Org. Chem. 2023, 43, 3246 (in Chinese).

肖梦佳, 高希珂, 有机化学, 2023, 43, 3246.).

[14]
Kumari S.; Sharma V.; Soni S.; Sharma A.; Thakur A.; Kumar S.; Dhama K.; Sharma A. K.; Bhatia S. K. Environ. Res. 2023, 238, 117171.

[15]
Mao S.; Shuai X.; Unger F.; Wittmar M.; Xie X.; Kissel T. Biomaterials 2005, 26, 6343.

[16]
Narita M.; Murafuji T.; Yamashita S.; Fujinaga M.; Hiyama K.; Oka Y.; Tani F.; Kamijo S.; Ishiguro K. J. Org. Chem. 2018, 83, 1298.

[17]
Wu F.-P.; Peng J.-B.; Qi X.; Wu X.-F. J. Org. Chem. 2017, 82, 9710.

[18]
Maruoka K.; Yoshitaka K.; Ngoc D. A. T.; Ryuju S.; Anudari B.; Nagaki S.; Hirohito U.; and Kasai H. Mol. Cryst. Liq. Cryst. 2022, 744, 100.

[19]
Huang D.; Ou B.; Prior R. L. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 1841.

[20]
Zhang X. Y.; Li X. Y.; Cui B.; Shao Z. H.; Zhao M. Q. Chin. J. Org. Chem. 2023, 43, 2885 (in Chinese).

(张晓雨, 李欣燕, 崔冰, 邵志晖, 赵铭钦, 有机化学, 2023, 43, 2885.)

DOI

[21]
(a) Blois M. S. Nature 1958, 181, 1199.

((b) Li Y.; Chen B. N.; Luo D.; Lei S.; Wang L. Acta Chim. Sinica 2023, 81, 1318 (in Chinese).

(李瑶, 陈丙年, 罗丹, 雷珊, 王力, 化学学报, 2023, 81, 1318.)

DOI

[22]
Benzie I. F. F.; Strain J. J. Anal. Biochem. 1996, 239, 70.

DOI PMID

[23]
Brahmi F.; Nury T.; Debbabi M.; Hadj-Ahmed S.; Zarrouk A.; Prost M.; Madani K.; Boulekbache-Makhlouf L.; Lizard G. Antioxidants 2018, 7, 184.

[24]
Raschke W. C.; Baird S.; Ralph P.; Nakoinz I. Cell 1978, 15, 261.

DOI PMID

[25]
Berghaus L. J.; Moore J. N.; Hurley D. J.; Vandenplas M. L.; Fortes B. P.; Wolfert M. A.; Boons G.-J. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2010, 33, 443.

[26]
He W.; Qu T.; Yu Q.; Wang Z.; Lv H.; Zhang J.; Zhao X.; Wang P. Int. Endod. J. 2013, 46, 128.

DOI PMID

[27]
Wang C. Y.; Jang H.-J.; Han Y. K.; Su X. D.; Lee S. W.; Rho M.-C.; Wang H.-S.; Yang S. Y.; Kim Y. H. Molecules 2018, 23, 1445.

[28]
Bryan N. S.; Grisham M. B. Free Radic. Biol. Med. 2007, 43, 645.

[29]
Jang D.-i.; Lee A.-H.; Shin H.-Y.; Song H.-R.; Park J.-H.; Kang T.-B.; Lee S.-R.; Yang S.-H. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 2719.

[30]
Najafi M.; Hashemi Goradel N.; Farhood B.; Salehi E.; Nashtaei M. S.; Khanlarkhani N.; Khezri Z.; Majidpoor J.; Abouzaripour M.; Habibi M.; Kashani I.; Mortezaee K. J. Cell. Biochem. 2019, 120, 2756.

[31]
Harris R. E.; Casto B. C.; Harris Z. M. World J. Clin. Oncol. 2014, 5, 677.

[32]
Mishra M.; Tiwari S.; Gomes A. V. Expert Rev. Proteomics 2017, 14, 1037.

[33]
Ma D.; He J.; He D. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2020, 84, 402.

[34]
Cai L.; Qin X.; Xu Z.; Song Y.; Jiang H.; Wu Y.; Ruan H.; Chen J. ACS Omega 2019, 4, 12036.

Options
Outlines

/

〈 〉