1 引言
血脑屏障(Blood-brain barrier, BBB)作为存在于血液和脑组织之间的高度选择性生理屏障[1], 对维持中枢神经系统内环境稳态具有重要作用[2]. BBB主要由脑微血管内皮细胞(Brain microvascular endothelial cells, BMECs)、周细胞(Pericytes)、星形胶质细胞(Astrocytes)、神经元及基底膜等共同构成[3]. 其中, BMECs作为BBB的关键组成细胞, 位于毛细血管管腔内侧, 通过表达闭合蛋白-5(Claudin-5)、闭合蛋白(Occludin)和闭锁小带蛋白(ZO-1)等紧密连接蛋白, 形成严密的屏障系统[4], 精确调控物质转运, 并限制病原体及毒素侵袭[5]. 然而, BBB的存在也给神经系统疾病的诊断与治疗带来巨大挑战. 研究表明, 约100%大分子药物和98%以上的小分子药物难以突破完整的BBB进入大脑[6-7], 导致许多中枢神经系统疾病药物临床试验失败或疗效不佳. 此外, 在癫痫、脑瘤、帕金森病或阿尔茨海默病等病理状态下, BBB的结构和功能通常发生显著改变甚至受 损[8-9]. 因此, 深入理解BBB的结构与功能, 对研究神经系统疾病和开发药物具有重要意义.
鉴于BBB结构的复杂性, 开发能够精准模拟其生理与病理特征的模型尤为关键. 目前, BBB的研究主要基于体内与体外两种平台. 体内模型多采用大鼠或小鼠等实验动物, 其优势在于能够高度模拟生理复杂性, 从而确保实验数据可靠性. 然而, 由于物种差异、成本高昂、实验周期长和伦理限制等因素[10], 动物模型难以准确预测人类药物反应, 且难以大规模应用. 传统体外模型多采用基于Transwell体系的二维(2D)静态培养系统, 可应用于药物筛选和疾病诊断与治疗. 然而, 该类模型缺乏流体剪切力, 并且多种细胞相互作用模拟不足, 难以真实模拟体内BBB的生理功能[11]. 为克服上述模型的局限性, 近年来, 微流控技术已成为构建BBB体外模型的重要方法. 该技术基于微米级芯片结构, 可实现多细胞共培养、动态流体刺激与细胞外基质支持等多种功能, 为深入探究BBB的结构和功能机制提供生理相关性更高的体外研究平台[12-15].
本文介绍了近年来基于微流控技术的BBB模型构建策略、综述了不同的流体驱动方式与细胞来源的研究进展、总结了常用的屏障功能评价方法, 并探讨该领域当前面临的技术挑战, 展望未来发展方向.
2 微流控血脑屏障芯片系统
微流控技术依托微纳制造工艺, 将传统宏观实验室中样品的预处理、生化反应、分离及信号检测等复杂操作高度集成于数平方厘米的微型芯片上, 因此被称为“芯片上的实验室”[16-18]. 该系统以微米尺度流体通道和反应腔室为核心结构, 在体外细胞培养领域具有传统培养皿难以实现的显著优势. 首先, 微通道的几何尺度为细胞贴壁生长及细胞间相互作用提供了适宜的空间尺度; 其次, 封闭式流体网络可更真实地模拟体内微环境; 更重要的是, 通过对流体的精密操纵, 可灵活调控流体剪切应力及生化因子的浓度梯度. 凭借这些能够精准重现体内物理与生化刺激的工程学特性, 基于微流控技术的器官芯片成功在微型器件上实现了对人体组织与器官核心功能的高度仿生模拟[19-20]. 对于BBB的体外重建, 微流控技术不仅可在受限微尺度空间内按生理层级排布多种脑部细胞, 还能引入模拟体内的血流剪切应力, 为构建高生理相关性的BBB模型提供了理想的研究平台[21].
2.1 微流控血脑屏障芯片设计
为了在微流控系统中更真实地模拟BBB生理特性, 研究者们开发并验证多种芯片设计. 根据结构设计差异, 用于构建BBB体外模型的芯片可分为以下四种主要类型: 三明治结构芯片、平行结构芯片、三维(3D)管状芯片和血管生成芯片.
2.1.1 三明治结构芯片
基于多孔膜的三明治结构芯片, 是微流控BBB模型中出现最早且应用最广泛的形式之一. 该类芯片通常采用三明治状结构, 其基本构型与静态培养常用的Transwell装置较为相似. 芯片通道多以聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS)为主体材料构建, 中间以PDMS、聚碳酸酯(Polycarbonate, PC)或聚对苯二甲酸乙二酯(Polyethylene terephthalate, PET)等材质的多孔薄膜作为分隔层[22]. 该多孔薄膜孔径一般小于10 μm, 可在阻隔上下两个腔室细胞迁移的同时允许物质传输和细胞间交流[23]. 基于三明治结构的微流控BBB器官芯片因制造工艺成熟, 易于集成外部灌流系统, 提供生理相关的流体剪切力, 因此已成为动态BBB模型研究的重要平台之一.
Booth等[24]开发了一种微流控BBB器官芯片, 该芯片采用孔径0.4 μm, 厚度10 μm的PC多孔膜分隔上下通道, 芯片内集成金属电极. 上通道接种小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3), 下通道接种小鼠星形胶质细胞, 构建能够测量跨内皮细胞电阻(Transendothelial electrical resistance, TEER)的共培养BBB模型(图1A). 该研究通过引入动态流体克服了Transwell静态培养系统的局限, 显著提升了BBB模型的稳定性. Park等[25]基于类似的芯片结构, 通过诱导人多能干细胞分化为脑微血管内皮细胞以构建BBB模型, 并在低氧条件下诱导其分化, 从而显著提升所构建的BBB模型的屏障功能(图1B).
图1 三明治结构的BBB器官芯片(A)集成电化学传感功能的BBB器官芯片[24]. (B)基于干细胞诱导分化技术构建的BBB器官芯片[25]. (C)用于研究跨屏障物质传输的级联式BBB-脑-BBB器官芯片[26]. (D)具有3D胶质细胞网络的BBB器官芯片[28] Figure 1 Sandwich-structured BBB organ-on-chips (A) BBB organ-on-a-chip integrated with electrochemical sensing functions[24]. Copyright 2012 Royal Society of Chemistry. (B) BBB organ-on-a-chip constructed via stem cell-induced differentiation technology[25]. Copyright 2019 Springer Nature. (C) Cascaded BBB-brain-BBB chip for studying substance transport across the barrier[26]. Copyright 2018 Springer Nature. (D) BBB organ-on-a-chip featuring a 3D astrocytic network[28]. Copyright 2020 Springer Nature |
此外, 三明治结构微流控芯片易于与其他芯片集成, 支持构建更为复杂的神经血管单元或多器官耦合模型. 例如, Maoz等[26]利用微流控芯片采用三个级联的BBB-脑-BBB器官芯片模拟人类的神经血管单元, 还原药物从血液穿过BBB流入脑实质, 再穿过BBB返回至血液的循环过程, 分析不同细胞类型在神经血管单元功能中的作用, 并揭示神经元与BBB之间的代谢耦合机制(图1C). Qin等[27]进一步将两个三明治结构芯片进行串联, 分别模拟肺泡界面与血脑屏障, 构建了多器官集成平台. 该研究成功模拟了新冠病毒(SARS-CoV-2)通过呼吸系统进入循环并跨BBB入侵脑组织的病理过程, 为探究病毒的神经侵袭机制提供了重要工具. 尽管此类模型具备实现复杂的多器官芯片耦合的能力, 但大多数模型仍局限于2D细胞培养层面, 缺乏细胞的3D空间结构以及细胞与基质间复杂相互作用, 因此生理相关性尚显不足. 基于此, Kim等[28]对传统三明治结构芯片进行改进, 在下层通道引入微柱阵列, 构建平行三通道结构(图1D). 该模型中, 上层通道用于2D培养内皮细胞; 下层分为三个平行通道, 其中中间通道用于细胞培养, 两侧通道用于营养物质输送. 在中间通道内部多孔膜下侧培养周细胞, 并在该通道中实现星形胶质细胞的3D培养, 这一设计能够更好地模拟人类BBB的关键结构与功能. 类似地, Zhang等[29]将芯片下层设计为五个平行微通道, 并引入小胶质细胞与神经元, 成功构建了3D血脑屏障模型. 研究人员通过在该模型的脑实质侧接种Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1), 系统探究了HSV-1穿越血脑屏障并引发脑损伤的病理过程, 动态模拟了疱疹性脑炎的发生机制. 该研究为神经病毒感染机制解析及抗脑炎药物筛选提供了新的体外实验平台.
基于多孔膜的三明治结构芯片通过引入流体剪切力, 突破了传统Transwell静态培养的局限性, 提供更具生理相关性和准确性的研究平台, 适用于体外药物跨屏障渗透性评价. 在此基础上, 通过对血管侧通道施加低氧或引入病毒等刺激, 可模拟缺氧或病毒条件下的BBB功能障碍, 从而实现对屏障完整性与通透性变化的评估. 然而, 受限于细胞接种方式和多孔膜材料的不透明性, 该类模型在高分辨率实时成像及细胞生长过程的动态监测方面仍存在困难.
2.1.2 平行结构芯片
区别于三明治结构, 基于微缝隙的平行结构是BBB器官芯片设计中另一种常见的形式. 此类芯片通常利用微柱阵列构建微缝隙代替多孔膜, 在水平方向上实现血液侧和大脑侧的分隔.
Deosarkar等[30]设计了一种三通道BBB器官芯片. 该芯片由一个圆形中央腔室和环绕两侧的两个通道组成, 中央腔室与两侧通道之间通过3 μm宽的微缝隙阵列相连(图2A). 其中, 两侧通道内接种内皮细胞, 中央腔室培养星形胶质细胞. 各通道及腔室均设有独立的入口与出口, 便于分别控制流体. 目前, 该种芯片设计已经被商业化. 随后, Adriani等[31]进一步开发了一种具有四个平行直通道的BBB器官芯片, 各通道间利用阵列微缝隙连通. 该芯片中央两条通道填充水凝胶, 用于3D培养星形胶质细胞和神经元; 两侧通道可用于内皮细胞培养和培养基灌注(图2B). 在这一系统中, 水凝胶既作为星形胶质细胞和神经元的细胞外基质支撑, 又起到物理屏障的作用. 研究证明, 该水平结构芯片能够形成具备屏障特性的BBB模型, 且其屏障功能和分子通透性更接近体内实际情况. 然而, 多数单个BBB系统难以进行高效药物筛选, 为了解决此问题, Xu等[32]开发了一种集成16个独立单元的多通道微流控BBB器官芯片. 每个单元包含四个结构一致的BBB区域, 各区域均由两个通道组成, 一个通道用于流体灌注, 并进行内皮细胞培养, 以此模拟血管的功能与环境; 另一个通道用于填充基质胶和星形胶质细胞培养, 从而模拟大脑生理特性(图2C). 这些单元通过微通道连接, 可模拟血管流动, 平行开展多个实验, 有助于构建标准化模型, 极大提高分析效率. 但该芯片设计与商业上的高通量仪器不兼容, 难以实现高效检测. Wevers等[33]也基于水平结构进一步提升通量, 开发了一种高通量三通道微流体孔板. 该孔板上设有40个相同单元, 每个单元均可独立构成完整的BBB模型(图2D).
图2 平行结构的BBB器官芯片(A)圆形三通道芯片[30]. (B)平行四通道芯片[31]. (C)阵列平行芯片[32]. (D)高通量三通道平行芯片[33] Figure 2 Parallel structure BBB organ-on-chips (A) Circular three-channel chip[30]. Copyright 2015 Public Library of Science. (B) Parallel four-channel chip[31]. Copyright 2017 Royal Society of Chemistry. (C) Array parallel chip[32]. Copyright 2016 Springer Nature. (D) High-throughput three-channel parallel chip[33]. Copyright 2018 Springer Nature |
平行结构芯片的并行通道设计可实现不同细胞群之间的直接交流, 为复杂疾病模型的构建提供了结构基础. 通过在脑侧通道引入肿瘤细胞, 可构建BBB-肿瘤共培养模型, 能够用于研究肿瘤微环境下BBB的功能变化; 同时, 引入阿尔茨海默病相关细胞及β-淀粉样蛋白, 可建立具有BBB功能障碍特征的阿尔茨海默病体外模型, 用于研究神经退行性病变过程中BBB的变化规律. 相较于基于多孔膜的三明治结构, 平行结构的BBB器官芯片仅设有单层流体通道, 极大地简化了芯片制备流程, 无需进行与多孔膜复杂的键合操作. 同时, 该设计有效避免了Z轴方向荧光成像的穿透深度的限制, 也有利于运用实时显微成像技术动态监测BBB形态变化. 然而, 平行式设计也给屏障完整性的评估带来挑战. 由于该结构的有效面积难以明确界定, 使得TEER的测量尤为复杂.
2.1.3 3D管状芯片
在BBB器官芯片的研究中, 无论是基于多孔膜的三明治结构还是基于微缝隙的平行式结构, 该类芯片通常采用光刻工艺加工, 所形成的微通道多呈矩形截面. 然而, 此类几何形状容易导致通道内流速及剪切应力分布不均、剪切应力偏离生理范围, 进而引起血管内皮细胞在通道沿线的形态和功能异质性[34]; 此外, 矩形通道与体内脑毛细血管的圆柱形态存在显著差异, 难以准确复制脑毛细血管的实际形态[35]. 因此, 为了更真实地模拟BBB的血管结构, 研究者开发多种技术构建圆柱形微通道, 包括牺牲模板法[36-38]、微流控原位成型法[39-40]和3D生物打印技术[41-43]. 这些方法显著提升了微通道的生理相似性, 为构建更具仿生意义的BBB模型提供了重要途径.
牺牲模板法是构建基于凝胶的3D管状结构芯片的一种重要方法. 通过使用可移除或可降解的圆柱形模具, 如金属微针、水溶性纤维等, 在凝胶内部形成中空通道结构. Kim等[36]通过使用微针在凝胶化的胶原基质中制备了直径为360 µm的中空管状通道阵列(图3A), 并在该管状通道中培养bEnd.3细胞, 实现体外环境BBB的模拟. 尽管该方法能够形成结构一致、形貌可控的管状结构, 但仍存在一定局限, 例如在移除模具过程中可能对周围凝胶基质造成机械损伤. 除了牺牲模板法外, 微流控原位成型法为在凝胶中形成3D管状结构提供了另一重要途径. 该方法基于微流控芯片内的多相流体流动, 在凝胶固化过程中诱导中空通道的自发形成. Herland等[39]首次基于该技术, 在胶原材料里成功制备出圆柱微通道芯片(图3B). 该研究通过驱动流体流过胶原管腔形成空心通道, 并将星形胶质细胞嵌入胶原基质中, 同时在通道表面共培养内皮细胞与周细胞, 形成仿生血管结构, 从而在结构与细胞组成层面实现了对BBB的高度模拟. 然而, 该方法操作过程较为复杂, 对流速、黏度等流体动力学参数要求较高, 实验重现性仍面临一定挑战. 为构建更接近体内真实生理状态的血管网络, 3D生物打印提供了一种新的技术手段. Galpayage Dona等[42]利用该技术开发了一种用于BBB研究的脑微血管网络微流控芯片模型(图3C). 该模型利用聚乙二醇二丙烯酸酯与甲基丙烯酸明胶混合配制的生物墨水, 打印出直径在80~350 µm区间的中空管道支架, 并在管道中培养原代内皮细胞和周细胞, 成功制备具有微血管网络的BBB器官芯片. 此种方法设计自由度高, 但受限于管径分辨率, 无法完全重现大脑复杂的微血管结构.
图3 3D管状BBB器官芯片构建方法(A)牺牲模板法[36]. (B)微流控原位成型法[39]. (C) 3D生物打印技术[42] Figure 3 Fabrication methods for constructing gel-based 3D tubular BBB organ-on-chips (A) Sacrificial template method[36]. Copyright 2015 AIP Publishing. (B) In-situ microfluidic molding method[39]. Copyright 2016 Public Library of Science. (C) 3D bioprinting technology[42]. Copyright 2023 Multidisciplinary Digital Publishing Institute AG |
3D管状结构不仅显著提升BBB模型的生理相关性, 更为复杂疾病的病理模型构建提供了理想的物理基础. 依托其对称的圆柱形流场, 研究者可通过精确调控灌流流速、压力及氧含量, 高仿真地建立脑缺血再灌注模型; 在管腔内侧引入肿瘤细胞, 可动态观察其在三维曲面上的黏附行为与迁移过程, 构建肿瘤相关BBB模型; 通过在管周基质中添加炎症因子或免疫细胞, 该模型还能更真实地模拟神经炎症微环境下的屏障响应, 实现了从几何仿生到功能病理模拟的跨越.
2.1.4 血管生成芯片
为提高BBB模型生理准确性, 模拟人脑内毛细血管尺寸(≈6~10 µm)[44-45], 部分研究者基于微血管形成的机制开发了自组装血管生成策略. 目前, 该类方法主要利用纤维蛋白原在凝血酶作用下形成不溶性纤维蛋白凝胶, 内皮细胞在凝胶中自发生成微血管和管腔结 构[46-48]. 基于此策略构建的BBB器官芯片通常设计为三个平行通道, 通道间以微柱阵列分隔, 整体结构与常规平行芯片相似. 然而, 二者在细胞接种方式上存在显著差异. 不同于平行结构芯片中血液侧与脑侧的空间分隔, 基于血管生成策略的BBB器官芯片通常将细胞与纤维蛋白凝胶等基质材料共同混合并注入通道内, 从而使屏障结构得以在通道内通过细胞自组装自发形成.
Bang等[49]基于血管生成技术开发了一种BBB体外模型. 该芯片具有由微柱分隔的三条平行通道, 中央为纤维蛋白凝胶通道, 两侧为培养基流动通道. 在纤维蛋白凝胶中, 人脐静脉内皮细胞自发形成类血管网络, 并与星形胶质细胞及神经元建立密切接触(图4A). Campisi等[50]同样基于血管生成策略设计了BBB模型. 该模型由人诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)来源的脑内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞组成, 这些细胞在纤维蛋白凝胶中自组装形成血管网络, 更好地模拟了三种细胞在脑内的实际空间分布(图4B). Winkelman等[51]进一步在血管生成型BBB器官芯片中引入流体流动, 以探究间质液流动对脑微血管网络的影响(图4C). 间质液既承担营养物质输送与代谢产物清除的功能, 同时也为细胞及基质提供机械信号. 该研究通过在血管网络上施加液压差以产生间质液流动. 结果表明, 在动态培养条件下, 血管面积、分支长度和直径等增加, 屏障完整性显著提升, 更接近体内生理状态.
图4 血管生成BBB器官芯片(A)基于人脐静脉内皮细胞的BBB器官芯片[49]. (B)基于iPSCs来源的脑微血管内皮细胞的BBB器官芯片[50]. (C)间质液流动的BBB器官芯片[51] Figure 4 Angiogenic BBB organ-on-chips (A) BBB chip based on human umbilical vein endothelial cells[49]. Copyright 2017 Springer Nature. (B) BBB chip based on brain microvascular endothelial cells derived from human iPSCs[50]. Copyright 2018 Elsevier. (C) BBB chip with interstitial fluid flow[51]. Copyright 2022 Royal Society of Chemistry |
基于血管生成策略构建的BBB体外模型, 能够较好地再现人脑中复杂的微血管网络结构, 展现出较高的生理相关性. 此外, 该类模型尤其适用于通过引入肿瘤细胞或三维肿瘤球构建肿瘤相关BBB体系, 从而系统研究肿瘤诱导的异常血管生成、屏障通透性改变及其对药物递送效率的影响. 然而, 该模型的血管生成过程存在一定随机性, 这不仅导致不同批次模型之间存在异质性, 还对TEER的精准测量造成限制, 从而影响了该模型的可重复性与可靠性, 限制了其标准化应用.
综上所述, 现有的基于微流控技术的BBB模型各具优势与局限, 研究者需根据具体研究目标与应用需求选择合适的芯片结构. 基于多孔膜的三明治结构与平行型芯片模型制备工艺相对成熟, 适用于高通量药物筛选及毒理评价. 相比之下, 3D管状结构及血管生成模型在血管形态、空间结构及生理微环境重建方面更接近体内真实状态, 因此在疾病机制研究与个性化医疗等领域展现出更广阔的应用前景(表1).
表1 不同结构设计的微流控BBB器官芯片的对比Table 1 Comparison of main structural designs for microfluidic blood-brain barrier organ-on-chips |
| 芯片类型 | 芯片结构 | 生理 相关性 | 芯片材料 | 胶原材料 | 细胞接种方式 | 屏障完整性指标 | 优点 | 局限性 | 适用场景 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 三明治结构 芯片 | 上下层通道 +多孔膜 | 中等 | PDMS+ PC/PET | 纤连蛋白 | 膜两侧接种 | TEER; 渗透率; 特异性蛋白表达 | 工艺成熟; 便于TEER、 渗透率测量 | 3D血管缺失; 高分辨成像受限 | 高通量药物筛选; 屏障功能探究 |
| 平行结构 芯片 | 平行通道 +微柱阵列 | 中等 | COCa; PDMS | 基质胶; 纤连蛋白 | 通道内接种; 水凝胶内包埋 | 渗透率; 特异性蛋白表达 | 成像兼容性好; 利于细胞交流 | 3D血管缺失; TEER测量困难 | 细胞相互作用研究; 实时动态成像检测 |
| 3D管状 芯片 | 中空管状 微血管 | 高 | COC; PDMS | 水凝胶 | 管腔内壁接种; 水凝胶内包埋 | 渗透率; 特异性蛋白表达 | 高仿生管腔 | 制备工艺复杂; TEER难测量 | 血流动力学研究; 肿瘤跨内皮迁移研究 |
| 血管生成 芯片 | 3D自组装 微血管网络 | 最高 | PDMS; PMMAb | 纤维蛋白原 +凝血酶 | 胶原内包埋 | 渗透率; 特异性蛋白表达 | 高仿生3D 血管网络 | 批次效应强; 灌注操作困难; TEER难测量 | 血管生成机制研究; 复杂疾病模型构建 |
a Cyclic olefin copolymer; b Poly(methyl methacrylate). |
2.2 微流控血脑屏障器官芯片流体驱动方式
流体剪切应力是调控内皮细胞形态结构与生理功能的关键物理因素[52], 对维持血脑屏障的完整性和特性具有重要意义. 人脑微血管内的剪切力通常处于5~23 dyn•cm−2区间[53], 而啮齿类动物则略高, 约为20~40 dyn•cm−2 [54]. 在微流控BBB器官芯片中, 实现精确可控的流体剪切应力对于构建生理相关性高的体外模型至关重要. 适宜的流体剪切应力既能为内皮细胞提供关键的机械生物学刺激, 促使其成熟、极化及紧密连接的形成[55-56], 又可以增强屏障功能与药物转运预测的准确 性[57]. 目前, 基于微流控的动态BBB器官芯片系统主要通过泵驱动与重力驱动等方式施加流体剪切应力.
2.2.1 泵驱动
微流控BBB器官芯片大多通过注射泵或蠕动泵进行流体驱动[58-60](图5A, 5B). 注射泵通过步进电机精密推动注射器, 能够产生恒定的流速, 适用于需长时间、低流速及高重复性剪切力研究的实验场景[61-62]. 凭借其流量控制精确、可重复性强等优势, 注射泵可定量模拟0.1~10 dyn•cm−2的生理相关剪切环境[63]. 这种机械刺激能显著提升内皮层TEER值并降低旁细胞通透性, 有效促进血脑屏障表型的成熟. 此外, 注射泵可以与编程控制系统相结合, 通过改变流速, 进而实现浓度梯度的自动化调控[64-65]. 然而, 注射泵系统通常成本较高, 且受限于注射器容量, 难以实现真正意义上的长期不间断灌流. 蠕动泵则通过旋转滚轮交替挤压和释放弹性软管推动流体前进. 该方式可依托外置储液池实现长期循环灌流, 因而适用于长周期细胞培养实验[66]. 蠕动泵可模拟0.5~15 dyn•cm−2的剪切应力, 理论上可用于模拟脑微血管的生理力学环境[67]. 然而, 其固有的周期性流体脉动特征会导致瞬时剪切力波动[68], 在力学敏感性极高的BBB模型中, 会干扰内皮细胞的稳态表型, 甚至削弱紧密连接结构的稳定性. 因此, 在采用蠕动泵施加剪切应力时, 通常需要集成阻尼结构或稳流装置, 以缓冲脉动效应, 从而构建更为平稳、可靠的剪切应力微环境.
图5 微流控BBB器官芯片流体驱动方式(A)基于注射泵的流体驱动[59]. (B)基于蠕动泵的流体驱动[60]. (C)基于重力的流体驱动[73] Figure 5 Fluid driving methods for microfluidic BBB organ-on-chips (A) Fluid driving based on syringe pump[59]. Copyright 2025 John Wiley and Sons. (B) Fluid driving based on a peristaltic pump[60]. Copyright 2016 Elsevier. (C) Fluid driving based on gravity[73]. Copyright 2023 John Wiley and Sons |
2.2.2 重力驱动
基于泵的外接式流体驱动系统可实现对培养基流动的主动控制, 为芯片内细胞提供动态培养环境, 有利于内皮细胞在剪切应力作用下形成屏障极化和紧密连接. 然而, 这类系统通常依赖额外设备, 操作复杂度较高. 相比之下, 基于重力的流体驱动系统无需外接泵, 其工作原理依赖于芯片两侧储液池间的液面高度差, 由此产生的流体静压力驱动培养基在微通道内发生流 动[69]. 该系统结构简单, 易于实现多芯片并行操作, 在高通量实验中展现出显著优势[70-71]. 重力驱动系统通常可产生0.01~10 dyn•cm−2的低剪切应力[72], 适用于BBB早期构建或初步功能验证. 然而, 该方式难以维持长效恒定的流速, 随着液位差减小, 剪切应力逐渐衰减, 难以长期稳定维持在生理剪切应力区间内. 因此, 该方式适用于对剪切力要求不高的实验, 但无法满足需严格调控力学刺激的高保真BBB模型构建需求. Wei等[73]开发了一种动态BBB模型, 通过摇摆灌注平台实现重力驱动的流体循环, 使培养液流经芯片通道, 在为细胞提供必要营养物质的同时, 使内皮细胞暴露于剪切应力环境中(图5C).
驱动方式的选择取决于具体研究需求. 基于泵的流体驱动方式在流速控制精度方面优势显著, 然而该系统通常需依赖外部泵设备及复杂的管路连接, 系统搭建与操作较为复杂. 相比之下, 重力驱动系统结构简单, 更易于实现高通量的芯片操作. 但该系统的主要局限在于流速会随液面高度的改变而改变, 导致剪切力发生波动. 总体而言, 泵驱动的BBB器官芯片系统更适用于对剪切力精度要求较高的研究; 而重力驱动则更适合用于高通量筛选、长期细胞培养的BBB模型构建. 未来, 集成化与自动化的多功能驱动系统有望作为微流控BBB器官芯片技术发展的重要方向.
2.3 细胞来源
在构建适用于特定研究体系的BBB器官芯片时, 除需关注芯片结构与流体灌注方式外, 选择合适的细胞类型对于提升研究结果的生理相关性和临床转化潜力至关重要. BBB由脑微血管内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞和神经元等细胞共同构成, 其中脑微血管内皮细胞因独特的功能特性, 成为BBB的核心细胞类型. 根据细胞来源, BBB器官芯片模型中常用的脑微血管内皮细胞可分为三大类: 永生化细胞系、原代细胞和干细胞分化而来的脑微血管内皮细胞.
2.3.1 永生化细胞系
迄今为止, 多种永生化内皮细胞系已被广泛应用于微流控BBB器官芯片模型中, 包括人脑微血管内皮细胞系[56,70,74-75]、大鼠脑微血管内皮细胞[76-77]和bEnd.3[24,57,78]等. 这些细胞多通过慢病毒或逆转录病毒转导端粒酶亚基或肿瘤抗原而实现永生化[14,79]. 永生化脑微血管内皮细胞系因具备较强的增殖能力、易于获取与培养且成本较低等优势, 在体外BBB模型研究中占据重要地位. Eigenmann等[56]对不同脑微血管内皮细胞系进行比较, 认为永生化人脑微血管内皮细胞系是构建人源体外BBB模型的较优选择. 然而, 永生化过程涉及的基因改造往往导致细胞表型与原代细胞存在差异. 与采用其他细胞来源的BBB体外模型相比, 永生化脑微血管内皮细胞系通常表现出较弱的屏障功能和较低的外排转运体活性.
2.3.2 原代细胞
原代脑微血管内皮细胞通常从新鲜组织样本中分离获得. 此类细胞能够较好地保留其天然生理特性, 通常表现出较高的细胞旁屏障紧密性、适宜的转运蛋白活性与细胞极性, 更接近于体内BBB的真实表型, 因而是BBB体外研究的理想细胞选择. Nair等[80]将人原代脑微血管内皮细胞、人原代周细胞和人原代星形胶质细胞进行共培养, 在体外成功再现了BBB的基本结构与功能. 该模型中血管内皮钙粘蛋白(VE-cadherin)和血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1)以及Claudin-5均有表达, 证实其屏障结构紧密. 然而, 原代细胞不适用于大规模实验. 在长期体外培养过程中, 其表型易发生改变. 此外, 原代细胞需从新鲜组织中获取, 成本高昂, 且其分离提取、培养和维持均存在较高技术难度, 这些因素共同限制了原代细胞在BBB模型中的应用.
2.3.3 干细胞分化
iPSCs源自体细胞, 通过重编程获得多能性, 能够进一步分化为各种特定功能细胞[81]. 研究显示, iPSCs在特定分化条件下可衍生为脑微血管内皮细胞, 并保留其关键表型特征, 包括转运蛋白和紧密连接蛋白的表 达[25]. 与原代细胞相比, iPSCs来源广泛, 既可以取自健康个体, 也能来自特定疾病患者, 为个性化诊疗和疾病建模提供了有力工具[82-83]. 因此, 相较于其他细胞来源, 利用iPSCs衍生的脑内皮细胞构建体外BBB模型, 是一种极具潜力且用途广泛的方案. 然而, 该技术目前仍面临一些挑战, 包括分化方案复杂、批次间差异、以及分化流程耗时较长, 成本较高等问题, 这些都制约了其在体外BBB研究中的发展与应用.
综上所述, 细胞来源的选择是构建微流控BBB器官芯片的关键要素, 直接决定了模型的屏障功能强度、生理相关性及临床应用潜力. 如表2所示, 永生化细胞系凭借增殖能力强、成本低、稳定性强的优势, 适用于高通量药物筛选及工艺探索; 原代细胞因高度保留体内表型, 适用于屏障功能及相关机制研究, 但其获取难度与批次差异限制了大规模应用; iPSCs则兼顾人源背景与患者特异性, 在个性化医疗与疾病建模中展现出独特价值, 但分化效率与成熟度问题仍有待突破. 因此, 研究者需结合具体的研究目标, 综合权衡细胞获取的便捷性、生理相关性与个体差异性, 以最大化BBB器官芯片的应用价值.
表2 不同来源脑微血管内皮细胞在体外BBB模型中的对比Table 2 Comparison of cerebral microvascular endothelial cells of different sources in vitro BBB models |
| 细胞来源 | 代表细胞 | 优势 | 局限性 | 屏障水平 | 适用场景 | 参考文献 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 永生化 细胞系 | bEnd.3 RBE4a hCMEC/D3b | 成本低; 稳定性强; 增殖能力强 | 屏障功能弱; 转运体活性低 | 低 | 药物筛选; 工艺探索 | [14,24,28 30-33,56-57 74-79] |
| 原代细胞 | hBMEC | 保留天然表型 | 成本高; 获取难; 传代有限 | 高 | 生理参数测定; 高生理相关性模型 | [26-27,39,42 80] |
| 干细胞分化 | iBMECsc (健康个体/患者来源) | 病理模拟; 个体化潜力 | 耗时长; 分化复杂; 批次差异 | 高 | 疾病建模; 个性化医疗 | [25,50,81-83] |
a Rat Brain Endothelial cell line 4; b human Cerebral Microvascular Endothelial Cells/D3; c induced pluripotent stem cell-derived Brain Microvascular Endothelial Cells. |
3 血脑屏障微流控模型的评估
与基于Transwell的传统BBB体外模型相比, 基于微流控芯片的BBB体外模型展现出更高的生理相关性. 然而, 鉴于芯片设计多样和细胞来源各异, 不同芯片之间存在显著差异. 屏障完整性是衡量模型能否真实再现体内BBB功能的核心指标, 直接决定模型可靠性、数据可信度及药物筛选与机制研究的准确性. 因此, 对屏障完整性进行系统评估至关重要, 它既是验证模型功能是否达到生理屏障特征的必要依据, 也是确保不同研究结果之间具有可比性的基础. 目前, 评估微流控BBB模型完整性的通用方法主要分为以下三类: TEER测量、渗透性检测以及特异性蛋白表达分析.
3.1 跨内皮电阻测量
TEER测量作为一种快速、非侵入且无标记的电学参数检测手段, 是评估BBB完整性的有效方法. 该方法通过测量单层细胞间通路的离子电导反映屏障功能, 避免了对细胞的损伤, 且能够在细胞生长与分化的各个阶段对活细胞进行连续监测. TEER值与细胞旁路通透性呈负相关, 并受溶质性质及内皮细胞类型等因素影响. 常用的TEER测量方法包括基于欧姆定律的直接电阻测量法和电化学阻抗谱(Electrochemical impedance spectroscopy, EIS)测量法[84]. 欧姆定律法通过在BBB两侧分别放置电极, 通过测量产生的直流电来获取电阻值. EIS方法通过施加交流激励信号, 测量细胞层的相位响应、电容及振幅等参数, 结合拟合算法后可更准确地反映跨内皮电阻.
受微流控芯片通道微米尺度的限制, 商业电阻仪难以直接对芯片内BBB模型的TEER进行测量. Booth 等[24]设计了首个集成化BBB微流控芯片, 采用溅射沉积Ag/AgCl薄膜电极连接商业电阻仪进行测量, 基于该芯片的BBB模型, 其TEER值稳定在约250 Ω•cm2, 显著高于Transwell体系(图6A). 然而, 薄膜电极在长期使用中易发生剥落, 影响测量准确性. 为提升电极稳定性, Wang等[85]在无泵式BBB器官芯片平台中采用固定于芯片表面的Ag/AgCl颗粒电极, 结合商业电阻仪进行TEER测量. 该模型在第3天TEER峰值超过4000 Ω•cm2, 并在2000 Ω•cm2以上维持约10天(图6B). 然而, 固定于芯片内的电极会对细胞的显微观察造成干扰, 同时, 金属电极与细胞的长期接触存在引发炎症反应的潜在风险. Wang等[86]开发了可与商业电阻仪兼容的场景适应性芯片, 支持细胞灌流培养及TEER直接测量. 基于该平台的BBB模型, TEER值约为250 Ω•cm2(图6C). 为进一步提高芯片内TEER测量的准确性, Ceccarelli 等[87]基于EIS的测量方法开展芯片内TEER测量. 该系统采用六对呈阵列式分布的铂薄膜电极, 这些电极沿内皮细胞分布并集成于微流控芯片内, 从而实现对芯片内TEER的有效测量(图6D). 尽管EIS在测量精度和信息丰度上更具优势, 但传统欧姆定律法以其操作简便性, 在实际应用中仍不可替代.
图6 BBB器官芯片TEER的测量方式(A)基于欧姆定律法Ag/AgCl薄膜电极进行TEER测量[24]. (B)基于欧姆定律法Ag/AgCl颗粒电极进行TEER测量[85]. (C)基于欧姆定律法场景适应性芯片直接使用商业电阻仪进行TEER测量[86]. (D)基于电化学阻抗谱法Pt薄膜微电极进行TEER测量[87] Figure 6 Measurement methods of TEER in the BBB organ-on-chips (A) TEER measurement using Ag/AgCl thin-film electrodes based on Ohm’s law method[24]. Copyright 2012 Royal Society of Chemistry. (B) TEER measurement using Ag/AgCl particle electrodes based on Ohm’s law method[85]. Copyright 2016 John Wiley and Sons. (C) TEER measurement using a commercial resistance meter directly on a scenario-adaptive chip based on Ohm’s law method[86]. Copyright 2025 American Chemical Society. (D) TEER measurement using Pt thin-film microelectrodes based on the impedance spectroscopy method[87]. Copyright 2024 Royal Society of Chemistry |
TEER检测技术因其能够无创、实时地监测细胞生理状态与屏障功能动态变化, 在生物医学工程及药物开发等领域具有重要价值. 然而, 在TEER检测过程中, 其测量值受到多种因素的干扰. 除细胞间紧密连接的完整性外, 测量所得电阻还与温度、培养基成分、检测装置尺寸以及电极的位置、大小和材料等因素密切相关. 这些因素导致不同实验平台, 甚至同一研究中的不同重复实验之间, TEER测量结果难以直接比较. 因此, 单一的TEER值变化通常不足以明确其背后的具体影响因素, 为准确阐释细胞屏障功能的改变, 需结合渗透性检测、特异性蛋白表达分析等其他检测方法进行综合评价.
3.2 渗透性检测
评估BBB完整性的另一种常用方法为渗透性实验, 该方法通过向BBB模型的血管腔灌注示踪剂, 并监测其在脑侧的扩散行为以评估屏障通透性. 具体而言, 可采用以下三种方法: 终点取样分析法、实时浓度监测法和原位荧光成像法. 其中, 终点取样分析法通过在示踪剂渗透结束后对脑侧取样, 以定量计算表观渗透系数; 实时浓度监测法借助在线检测系统, 分析脑侧流出液中示踪分子浓度随时间的变化, 反映分子跨屏障转运的动态过程; 若使用荧光示踪剂, 则可进一步采用原位荧光成像法, 实时、可视化地观测并定量其空间分布. 示踪分子的多种特性, 包括分子量、电荷、亲脂性以及与细胞结合的能力, 均可能影响其在BBB中的转运过程[88]. 目前广泛应用的示踪剂包括不同分子量(3~70 kDa)的荧光标记葡聚糖, 该类分子也常用于体内BBB完整性的评估. 此外, 分子量较小的示踪剂, 如钠荧光素(376 Da)、罗丹明123(381 Da)、氯锂盐(444 Da), 则常用于评估小分子物质的BBB渗透行为. Liang等[89]选用20 kDa荧光素异硫氰酸酯(FITC)-葡聚糖作为示踪剂, 对比无细胞BBB器官芯片、静态培养BBB模型与动态培养BBB模型的渗透率, 结果表明动态培养的BBB模型脑侧示踪剂渗透率最低, 证明屏障致密性最高(图7A), 表明流体剪切应力可显著促进BBB模型的成熟度. 此外, Zeng等[90]选用70 kDa罗丹明-葡聚糖与4 kDa FITC-葡聚糖作为大小分子示踪剂, 在BBB器官芯片中开展渗透性实验. 与无细胞对照组中呈现出的明显示踪剂泄漏相比, 含有内皮细胞的芯片组表现出完整的屏障特性, 两种示踪剂均被有效限制在血管腔内, 未向水凝胶区域中扩散(图7B). 在BBB模型的构建与验证中, 渗透性检测发挥着关键作用. 它不仅是评估屏障完整性的直接手段, 更为优化培养条件、评估药物递送效率以及研究神经系统疾病的病理机制提供重要依据.
图7 BBB器官芯片渗透性检测(A) 20 kDa FITC-葡聚糖在BBB模型的渗透性[89]. (B) 70 kDa罗丹明-葡聚糖与4 kDa FITC-葡聚糖在无/有内皮细胞条件下渗透性比较[90] Figure 7 Permeability detection of the BBB organ-on-chips (A) Permeability of 20 kDa FITC-dextran in the BBB model[89]. Copyright 2024 Elsevier. (B) Comparison of the permeability of 70 kDa rhodamine-dextran and 4 kDa FITC-dextran in the chip under the conditions of without/with endothelial cells[90]. Copyright 2023 Elsevier |
3.3 特异性蛋白表达分析
BBB的完整性依赖于内皮细胞间的紧密连接与黏附连接, 其功能状态可通过免疫荧光或蛋白质印迹法检测相关标志蛋白, 如Occludin、ZO-1和VE-cadherin等的表达来评估. 此外, 转运相关蛋白如P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)和葡萄糖转运蛋白1(GLUT-1)的表达水平, 也常用于评价BBB模型的功能特性. 周细胞、星形胶质细胞以及细胞外基质中的特异性蛋白, 如α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、Ⅳ型胶原等, 也可借助免疫荧光技术进行标记和观察. 基于显微成像的免疫荧光技术, 已成为直观表征BBB屏障形成与功能特性的关键手段[91]. Vatine等[82]利用iPSC构建了一种2D细胞培养的BBB器官芯片模型, 成功模拟了内皮细胞与神经细胞间的相互作用. 在该模型中, iPSC分化的脑微血管内皮细胞形成了致密的单层结构, 并高表达紧密连接蛋白ZO-1. GFAP和α-SMA的表达进一步表明该模型具备典型的细胞组成与生理屏障功能, 能够较好模拟体内BBB的结构与特性(图8A). Lee等[92]通过诱导血管自组装生成的3D细胞培养BBB器官芯片, 实现了CD31、GFAP与α-SMA在三维空间的特异性表达. 结果表明, 此芯片中微血管网络结构完整, 能够体外模拟BBB生理结构(图8B). 综上所述, 特异性蛋白免疫荧光标记能够评估不同BBB模型屏障完整性的同时, 还可揭示其复杂的三维结构与功能特征.
在BBB器官芯片的评估中, 评估方法的选择高度依赖于芯片的几何构型、流体动力学环境及研究目标等, 研究者可根据不同需求进行选择. TEER适用于屏障形成过程的动态追踪及药物或外源性刺激干预后的无创监测, 尤其适配三明治结构微流控BBB器官芯片. 然而, 在3D管状及血管生成型微流控BBB器官芯片中, 由于血管腔结构复杂, 难以实现检测电极的精准定位与标准化植入, 且电极介入易扰动内皮结构完整性, 显著限制了TEER检测的应用. 渗透率检测能够定量反映屏障对物质的阻隔能力, 是BBB功能完整性的核心评价指标之一, 尤其适用于药物跨屏障递送效率评价、病理模型屏障损伤程度的定量分析, 广泛兼容各类芯片构型. 特异性蛋白表达分析侧重于屏障结构完整性的可视化表征. 在结构复杂的3D管状或血管生成型芯片中, TEER检测因电极植入困难而难以有效实施, 渗透率检测则易受流场不均影响而产生偏差. 此时特异性蛋白表达分析可作为屏障完整性表征的关键手段, 直观呈现紧密连接蛋白的连续分布, 解析细胞极性与空间排列, 从而有效表征复杂结构中BBB形态与功能完整性. 在实际应用中, 上述评估方法互为补充, 可根据实验需求与芯片构型合理组合: TEER用于监测屏障形成过程, 渗透率定量评估功能完整性, 特异性蛋白表达实现可视化分析, 从而综合评估不同芯片模型的BBB结构与功能.
4 结论与展望
随着微流控技术的快速发展, BBB研究领域取得了显著进步. 本文系统综述了基于微流控芯片的BBB体外模型构建策略, 包括芯片结构设计、流体驱动方式、细胞来源选择, 同时阐述BBB构建后的屏障功能评估方法. 微流控技术通过在微尺度下对流体和细胞微环境的精准操控, 为构建高度模拟体内生理状态的BBB模型提供了坚实基础.
尽管如此, 当前基于微流控技术的BBB研究仍面临诸多挑战, 现有模型在细胞外基质成分、三维结构模拟以及细胞间相互作用的精确调控方面与体内真实BBB仍存在差距, 同时模型的稳定性、标准化及其与临床研究的衔接能力仍有待提升. 未来BBB器官芯片的发展可关注于以下四个方面.
(1)进一步提升模型仿生能力. 迄今为止, 多数BBB器官芯片仍局限于内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞为核心的三种细胞共培养模型, 缺乏神经元、免疫细胞等细胞的参与, 导致模型难以重现体内神经血管单元的复杂旁分泌信号网络与免疫防御机制. 此外, 现有的流体环境模拟多简化为恒定剪切应力, 忽略了脑部脉管系统中动态压力梯度及脉动流对BBB的调控作用. 未来应聚焦于高仿真神经血管单元的构建, 通过在BBB器官芯片内引入神经元、小胶质细胞等脑部微环境相关细胞, 进一步提升模型的生理相关性. 同时, 集成可编程微流控灌流系统, 以实现对复杂流体力学环境的精准复刻, 从而实现从单一物理刺激向复杂病理生理微环境的跨越, 为研究神经退行性疾病及血脑屏障动态开放机制等提供高保真的实验平台.
(2)推动技术标准化. 当前, 由于各实验室的BBB器官芯片在几何构型、细胞来源及培养体系等方面存在差异, 导致实验数据在不同平台间的研究可比性较差, 严重制约了其在药物研发中的监管认可与大规模应用. 因此, 未来在芯片制作层面, 应推动从手工制造向3D打印、热压或注塑等精密加工转型, 采用具备生物惰性且低吸附特性的热塑性聚合物替代传统的PDMS材质, 以消除非特异性药物吸附对通透性测定的干扰, 并建立统一的通道尺寸标准; 其次, 在生物组成层面, 需建立基于人源iPSC规范化的分化技术和培养方法, 明确细胞接种密度、共培养比例及成熟度判定方法, 以确保屏障起始性能的稳定一致; 最后, 亟需构建行业公认的评价体系, 包括设定针对特定物种和结构的TEER标准, 以及标准化示踪分子的渗透率检测流程. 通过推动技术标准化将极大增强BBB模型的重复性与可靠性, 加速其在中枢神经系统药物筛选中的应用.
(3)结合患者特异性iPSC开发个性化BBB模型. 现有的BBB模型多依赖于人源或动物源性的永生化细胞系及原代细胞. 其中, 动物源性细胞与患者存在显著的种属差异; 而传统的永生化细胞系与原代细胞亦难以有效还原人类个体的遗传背景多样性及临床表现的异质性. 结合患者来源的iPSC技术, 可构建携带特定基因突变或疾病表型的个性化BBB模型, 为罕见神经系统疾病机制研究及精准用药方案筛选提供新工具. 未来需进一步优化基于iPSCs衍生的BBB器官芯片构建策略, 并结合多器官芯片集成技术, 以拓展其在药物研发、疾病诊断与临床治疗中的应用.
(4)与人工智能结合. 随着芯片结构复杂化及实验通量的大幅提升, 传统模式难以应对多变量协同优化及海量数据处理的挑战. 当前瓶颈主要体现在: 多维参数下难以确定最优芯片设计, 以及高内涵图像数据仍依赖人工解析, 导致分析效率低下且存在主观偏差. 未来应与人工智能深度融合, 利用机器学习算法对芯片结构、流体动力学特征、剪切应力等多参数进行智能优化及辅助设计; 借助深度学习技术实现屏障连接蛋白表达及细胞形态变化的高通量、自动化图像分析; 通过构建药物渗透率预测模型, 建立化合物结构与渗透率之间的定量关系, 推动BBB模型从基础研究向智能化、精准化的临床前评价工具的发展.
(Cheng, B.)