光动力疗法(Photodynamic Therapy, PDT)是一种依赖光敏剂(PSs)在特定波长光照射下产生活性氧(ROS)的治疗技术, 能够高效杀灭肿瘤细胞或细菌等[1-3]. 凭借其非侵入性、高选择性、低毒性、良好的生物相容性以及时空可控性, PDT已被广泛应用于癌症治疗、抗菌及其他疾病的治疗中[4-5]. PDT的效果高度依赖于所使用的PSs. 理想的PSs应具备以下特点: 高效的ROS产生能力、较低的暗毒性、优异的组织靶向性、生物相容性, 以及在红光至近红外光区域具有较高的摩尔消光系数[6-8]. 近年来, 众多新型PSs不断涌现, 虽然这些进展令人鼓舞, 但目前临床应用的PSs仍面临诸多挑战, 例如ROS产率低、暗毒性高、组织靶向性差以及稳定性不足. 因此, 开发性能优异的PSs具有重要的研究意义和应用价值.
PSs能够通过Ⅰ型或Ⅱ型机制产生ROS. 因此, 根据作用机制的不同, PSs可分为Ⅰ型PSs和Ⅱ型PSs. 在光照作用下, Ⅱ型PSs从基态(S0)被激发至激发态单重态(Sn), 随后通过系间窜越(ISC)过程转化为激发态三重态(Tn). 激发态三重态的PSs与氧气(O2)发生能量转移反应, 生成单线态氧(1O2)[9-11]. 这种ROS通过氧化细胞膜、蛋白质和核酸等关键细胞成分, 破坏细胞的结构和功能, 从而诱导细胞凋亡或坏死, 达到PDT的目的[12-14]. 由此可见, 在Ⅱ型光敏化过程中, 氧气(O2)的消耗是生成单线态氧(1O2)的必要条件, 因此氧气的含量直接决定了其治疗效果[15]. 然而, 在肿瘤微环境中, 由于癌细胞的快速增殖和血液供应不足, 导致氧气含量极低, 从而显著降低Ⅱ型PSs的PDT效率. 与高度依赖氧气的Ⅱ型PDT相比, 低耗氧量的Ⅰ型PDT展现出克服实体肿瘤乏氧困境的巨大潜力[14]. Ⅰ型PSs在被激发至Tn后, 与周围底物通过电子转移形成自由基或自由基离子. 这些自由基或自由基离子可以进一步与氧气反应生成超氧阴离子($\mathrm{O}_{2}^{g-}$)[16-17]. $\mathrm{O}_{2}^{g-}$在超氧化物歧化酶的作用下发生歧化反应, 不仅可以重新生成氧气, 从而实现在乏氧环境中持续生成ROS. 与此同时, 生成的过氧化氢(H2O2)可与$\mathrm{O}_{2}^{g-}$反应生成羟自由基(•OH)[18-19]. 尽管$\mathrm{O}_{2}^{g-}$的氧化能力较弱, 但在水溶液中具有较高的稳定性; 相反, •OH虽然具有极强的氧化能力, 但寿命极短, 作用范围有 限[20]. 因此, 设计和开发能够同时产生多种ROS(如$\mathrm{O}_{2}^{g-}$和•OH)的PSs, 有望进一步增强PDT的治疗效果, 对于提升乏氧环境中PDT的治疗效果具有重要意义.
离子型氰菁染料[21-23]因其高摩尔消光系数、强近红外(NIR)光吸收、结构灵活性、可调节特性以及优异的生物相容性, 在生物医学领域得到广泛应用. 例如, 氰菁染料中的经典代表吲哚菁绿(ICG)[24-25]已被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于临床荧光成像. 然而, 基于对称氰菁结构的长波PSs通常面临较低的1O2量子产率和较差的光稳定性问题. 相比之下, 半花菁染料因其分子内电子分布的不对称性, 表现出更低的光漂白倾向, 从而具有更高的光稳定性, 适合长期治疗[21]. 此外, 半花菁染料具有更高的结构灵活性, 可通过调整供体或受体部分提高ROS的生成能力[26-28], 从而增强光动力治疗(PDT)的效果.
为提高PSs的ROS产率, 近年来研究者提出了多种策略以增强PSs的ISC效应, 包括引入重原子效应, 促进自旋转换、利用光诱导的电荷转移、扭曲π-共轭体系诱导的ISC, 以及自旋轨道电荷转移诱导的系间窜越(SOCT-ISC)等. 其中, 强推-拉电子(D-A)[26,29]策略通过有效分离最高占据分子轨道(HOMO)和最低未占分子轨道(LUMO), 显著减小单重态与三重态之间的能级差(ΔES-T), 促进ISC过程, 从而增强ROS的生成能力[30]. 此外, 引入苯、噻吩等作为π桥可以延长分子内的共轭链, 增强π电子的离域化程度, 从而实现吸收光谱的红移[31]. 因此, 设计含有D-π-A结构的PSs不仅能够显著提高其光学性能, 还因其合成简单而备受关注, 被认为是一种极具前景的设计策略.
基于此, 本文以半花菁为结构框架, 选择三苯基胺作为电子供体、吲哚碘鎓作为电子受体, 并以苯乙烯为π桥, 设计并合成了具有D-π-A结构的半花菁光敏剂(E)-2-(2-(4'-(二苯胺基)-[1'-联苯]-4-基)乙烯基)-1-乙基- 3,3-二甲基-3H-吲哚-1-铵碘盐(TC)(图1). 为研究D-π-A结构对分子光物理性质的影响, 还合成了单体分子4'-(二苯基氨基)-[1'-联苯]-4-甲醛(T-CHO)和1-乙基- 2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-鎓(YD)作为参比分子. 研究结果表明, T-CHO和YD的光捕获范围分别为400~456和400~440 nm; 通过增加共轭体系, TC的光捕获范围显著扩展至400~745 nm, 极大地提高了对可见光的利用效率. 同时, TC具有更小的ΔES-T, 更有利于ISC的发生. 在光照条件下, TC不仅能够通过Ⅱ型机制生成1O2, 还能通过Ⅰ型机制产生$\mathrm{O}_{2}^{g-}$、•OH等ROS. 与参比分子T-CHO、YD及商业化光敏剂ICG相比, TC展现出了更高的ROS生成能力.
1 结果与讨论
1.1 分子合成与结构表征
TC以及参照分子T-CHO和YD的合成路线如Scheme 1所示. 首先, 通过碘乙烷与2,3,3-三甲基-3H-吲哚的亲核取代反应, 合成吲哚碘鎓YD. 在Pd(PPh3)4的催化下, 4-(二苯基胺基)苯硼酸与4-碘苯甲醛通过Suzuki-Miyaura偶联反应生成产物T-CHO. 最后, 将YD和T-CHO在乙酸酐存在下进行缩合反应, 得到目标产物TC.
所有新合成化合物的结构均通过核磁共振光谱(NMR)、高分辨质谱(HRMS)和红外光谱(IR)进行了确认. 根据TC的¹H NMR谱图分析结果, 可以得到以下信息: 化学位移在δ 8.28和7.76的双峰(4个氢)归属于与乙烯相连的苯环上的氢; 化学位移在δ 8.25和7.86, 偶合常数为16.04 Hz的双峰, 对应于烯烃上的两个氢; 化学位移在δ 7.66~7.05的信号(18个氢)归属于其他苯环上的氢; 化学位移在δ 5.05的四重峰归属于亚甲基信号; 化学位移在δ 1.86的单峰归属于甲基信号; 化学位移在δ 1.62的三重峰归属于与亚甲基相连的甲基上的三个氢.
通过TC的¹³C NMR谱图分析得出, δ 192~122的信号对应于碳氮双键以及苯环上的sp2杂化碳原子; δ 114和111的信号分别对应于烯烃的两个碳原子. 在TC的HRMS谱图中, 脱碘后的TC显示的质荷比(m/z)为519.2799, 与理论预测值完全一致. 综合以上谱图数据, 可以确认TC的结构.
1.2 稳态吸收与荧光光谱
为了研究分子结构对化合物光物理性质的影响, 首先对化合物TC及参照分子T-CHO和YD在三氯甲烷(CHCl3)中的稳态吸收光谱进行了测定, 结果如图2a所示. 从稳态吸收光谱可以观察到, TC在可见光区具有较强的光捕获能力, 其在554和394 nm处有两个吸收峰, 对应的摩尔消光系数分别为8.98×103和7.40×103 mol－1•cm－1. 从吸收光谱可以进一步看出, T-CHO和YD的光捕获范围分别为400~456和400~440 nm, 而TC的光捕获范围显著扩展至400~745 nm, 吸收峰也发生了明显的红移. 这表明通过引入苯乙烯作为π桥, 将T-CHO和YD共轭连接后, 有效增强了两者之间的基态电子相互作用, 形成了更大的共轭体系, 从而实现了吸收光谱的显著红移和光捕获范围的扩展.
图2 (a)化合物TC、T-CHO和YD在CHCl3中的稳态吸收光谱; (b)化合物TC、T-CHO和YD在CHCl3中的荧光发射光谱(插图为TC在600~700 nm区间内的荧光发射光谱的放大图, 激发波长为400 nm, 浓度1.0×10－5 mol/L); (c)化合物TC在CHCl3中的荧光发射光谱(激发波长为540 nm, 浓度1.0×10－5 mol/L)Figure 2 (a) Steady-state absorption spectra of compounds TC, T-CHO, and YD in CHCl3; (b) Fluorescence emission spectra of compounds TC, T-CHO, and YD in CHCl3 (inset showing an enlarged view of the fluorescence emission spectrum of TC in the 600~700 nm range (excitation wavelength: 400 nm, concentration: 1.0×10－5 mol/L); (c) Fluorescence emission spectrum of compound TC in CHCl3 (excitation wavelength: 540 nm, concentration: 1.0×10－5 mol/L) |
其次, 对化合物TC、T-CHO和YD的稳态荧光光谱进行了研究. 由于T-CHO和YD的最大吸收波长仅略高于400 nm, 因此首先采用400 nm的波长激发三种化合物, 其荧光发射光谱如图2b所示. 结果表明, T-CHO和YD的荧光发射峰分别位于516和509 nm, 而TC在478和632 nm处出现了两个荧光发射峰. 此外, TC的荧光强度明显低于T-CHO和YD, 尤其是在632 nm处, 荧光信号几乎看不见.
随后, 使用540 nm的激光进一步激发TC, 其荧光发射光谱如图2c所示. 同样地, 在632 nm处观察到TC的荧光发射峰, 但强度也非常弱, 表明TC的激发态能量主要通过其他非辐射跃迁途径(如系间窜越、能量转移或电子转移)耗散, 而不是通过荧光发射的方式返回基态. 这一现象与TC表现出良好的ROS生成能力的实验结果相一致.
1.3 瞬态吸收和荧光寿命
为了更深入地探究TC、T-CHO和YD的光物理性质, 进一步测试了TC的纳秒瞬态吸收光谱和时间分辨荧光光谱(TC的瞬态吸收光谱见辅助材料图S6所示), 然而在测试的时间分辨范围内未观察到TC的三重态信号[9].
随后, 利用时间相关单光子计数(TCSPC)技术记录了TC、T-CHO和YD的荧光衰减曲线. 所有化合物的荧光寿命均通过与仪器响应函数(IRF)解卷积的方式拟合, 从而获得精确的样品发光寿命数值, 结果如图3所示. 当用400 nm光激发TC时, 其在478 nm处的荧光衰减曲线呈双指数拟合, 寿命分别为τ1=0.02 ns (93%)和τ2=2.28 ns (7%)(图3a). 当用540 nm光激发TC时, 在632 nm处的荧光衰减呈单指数拟合, 寿命为τ=0.30 ns(图3b). 相比之下, T-CHO在400 nm激发并在516 nm处拟合的荧光衰减曲线呈双指数分布, 寿命分别为τ1=0.75 ns (26%)和τ2=3.00 ns (74%)(图3c). YD在400 nm激发并在509 nm处拟合的荧光衰减曲线也呈双指数分布, 寿命分别为τ1=2.12 ns (50%)和τ2=5.37 ns (50%) (图3d). 根据实验结果可以看出, TC的激发态寿命明显短于T-CHO和YD, 尤其是在540 nm激发条件下, 其单指数衰减模式反映了激发态能量通过非辐射跃迁通道快速耗散. 这与其稳态荧光较弱以及较高的ROS生成能力一致.
图3 TC (a)、T-CHO (c)和YD (d)在CHCl3中的荧光衰减曲线(激发波长为400 nm, 检测波长分别为478、516和509 nm), 同时给出其对应的双指数拟合结果; (b) TC在CHCl3中的荧光衰减曲线(激发波长为540 nm, 检测波长为632 nm), 并给出其对应的单指数拟合结果Figure 3 Fluorescence decay traces of TC (a), T-CHO (c), and YD (d) obtained by TCSPC in CHCl3 (excited at 400 nm and recorded at 478, 516, and 509 nm, respectively), along with their corresponding biexponential fitting results; (b) Fluorescence decay trace of TC obtained by TCSPC in CHCl3 (excited at 540 nm and recorded at 632 nm), along with its corresponding single-exponential fitting result The red curve, characterized by a narrow half-width at half-maximum and rapid decay, represents the IRF. |
1.4 理论计算
为了评估分子结构对ΔES-T的影响, 采用时间依赖密度泛函理论(TD-DFT), 在CAM-B3LYP/6-31＋G(d)水平上对含有D-π-A结构的TC分子的基态(S0)、激发单重态(S1)和激发三重态(T1)进行了计算. 计算结果如图4所示. 同时, 为了对比, 还对仅含有电子给体和π桥的T-CHO分子进行了相应的计算(TC和T-CHO在S0、S1和T1态下的优化几何结构列于辅助材料中). 研究结果显示, 对于TC分子, 在S1和T1状态下的跃迁主要为HOMO-2到LUMO的跃迁. 在HOMO-2轨道中, 电子云主要分布在三苯基胺(电子供体)上, 而在LUMO轨道中, 电子云则集中分布在吲哚碘鎓(电子受体)上, 这表明在该分子中存在显著的电荷分离现象. 相比之下, T-CHO中这种电荷分离现象并不明显, 说明D-π-A结构能够显著促进电荷分离, 而这种电荷分离在ISC过程中可能起到重要的辅助作用.
此外, 还计算了TC和T-CHO的ΔES-T值, 结果分别为0.73和1.50 eV. 较小的ΔES-T值通常更有利于ISC过程, 从而进一步增强ROS的产生能力. 因此, TC相比于T-CHO具有更高的ROS生成能力, 这与ROS的实验结果一致. 以上理论计算的结果表明, D-π-A结构通过促进电荷分离, 显著降低ΔES-T值, 从而增强了分子的ISC效率和ROS生成能力.
1.5 ROS的研究
高效的ROS产生能力是PDT的必要条件. 为此对TC的ROS生成能力进行了深入研究. 首先评估了化合物TC、T-CHO、YD和ICG在去离子水中的溶解性(如辅助材料图S7所示), 所有化合物均表现出良好的水溶性, 这为ROS的定量测试和PSs后期在生物体内的应用奠定了基础. 为了研究TC的Ⅱ型光动力效率及其产生1O2的能力, 选用了9,10-蒽二基-双(亚甲基)二甲酸(AB- DA)[10]作为化学传感器. 同时, 对参照化合物T-CHO和YD也进行了研究, 并以ICG作为对照, 实验结果如图5和辅助材料S8所示. 随着光照时间的增加, 以TC为PS时, ABDA在320~420 nm区间的吸收峰强度逐渐下降, 表明TC具有明显的光氧化能力, 而在以T-CHO、YD和ICG为PSs的实验中, ABDA的吸收几乎没有变化. 为进一步证明这种吸收变化来源于PSs敏化产生的1O2与ABDA的反应, 测试了ABDA在纯水环境中随光照的吸收变化. 如图S8b所示, 纯水中的ABDA吸收强度在光照后几乎没有明显变化, 这一结果表明, 以TC为PS时, ABDA吸收的变化确实来源于敏化产生的1O2与ABDA反应的结果, 而不是ABDA的光漂白.
图5 化合物TC (a)、T-CHO (b)和YD (c)作为PSs时ABDA在100 s内受到光照的稳态吸收光谱变化图; (d)通过公式ln(A/A0)对ABDA在377 nm处的吸收变化进行拟合的结果图(测试时PSs的浓度: 1×10－5 mol/L, ABDA浓度: 1.25×10－5 mol/L. A和A0为377 nm处的吸收值, 其中A是随着时间变化的吸收值, A0是初始无光照的吸收值, 光通量大小为10 mW/cm2)Figure 5 Steady-state absorption spectra showing the changes in ABDA under illumination for 100 s when compounds TC (a), T-CHO (b), and YD (c) are used as PSs; (d) Fitting plot of the changes in ABDA absorption at 377 nm using the equation ln(A/A0) (the concentration of PSs was 1×10－5 mol/L and the ABDA concentration was 1.25×10－5 mol/L. A represents the absorption at 377 nm at different time intervals, A0 is the initial absorption value without illumination, and the light intensity is 10 mW/cm²) |
通过比较ABDA吸收下降的幅度, 可以评估PSs的光氧化能力强弱. 利用公式ln(A/A0)对ABDA在377 nm处的吸收变化进行拟合, 结果如图5(d)所示. 根据拟合直线的斜率可见, TC对应的直线斜率明显大于其他对照组, 说明TC的光氧化能力最强.
表1 PSs的(1O2)a的量子产率Table 1 The quantum yield of 1O2 for the PSsa |
| Photosensitizer | kobsb/s－1 | vic | Φ∆d |
|---|---|---|---|
| TC | 1.760 | 0.1760 | 0.766 |
| T-CHO YD | 0.072 0.048 | 0.0072 0.0048 | 0.152 —e |
| ICG | 0.045 | 0.0045 | 0.002 |
a In H2O, c=1.0×10－5 mol/L. b The rate constant kobs was calculated by the rule: ln(A/A0)=－kobst, in 10－3 s－1. c Initial consumption rate of ABDA, vi=kobs[ABDA], in 10－6 mol•L－1•s－1. d Quantum yield of 1O2, with ICG as standard (Φ∆=0.002 in H2O). e Not determined.[25] |
还研究了TC、T-CHO和YD的Ⅰ型ROS生成能力, 并与ICG进行了对比. 首先, 选用二氢罗丹明123 (DHR123)[17]作为化学传感器检测PSs的$\mathrm{O}_{2}^{g-}$的生成能力. DHR123能够被$\mathrm{O}_{2}^{g-}$氧化生成罗丹明123, 而罗丹明123在约525 nm处具有强荧光发射. 因此, 通过检测体系在525 nm处荧光强度的变化, 可以间接评估$\mathrm{O}_{2}^{g-}$的生成量. 实验结果如图6和辅助材料图S9所示, 在光照射下, 以TC为PS的DHR123溶液在525 nm的荧光强度在100 s内显著上升, 表现优于T-CHO、YD、ICG及空白对照组(H2O). 在光照100 s时以TC为PS的DHR- 123溶液在525 nm的荧光强度增加至初始值的6.45倍, 而在相同波长下以T-CHO和YD为PS的DHR123溶液的荧光强度分别增加至初始值的2.20和1.23倍, 增幅较小. 相比之下, 以ICG为PS的DHR123溶液和空白组的荧光强度分别仅增加至1.89和1.04倍. 由此可见, 具有D-π-A结构的TC在生成O2·−方面的能力显著优于单体分子(T-CHO和YD)以及对照光敏剂ICG.
图6 化合物TC (a)、T-CHO (b)和YD (c)作为PSs时DHR123在100 s内受到光照的荧光发射光谱图; (d)通过公式I/I0对DHR123在525 nm处的变化进行拟合图(测试时PSs的浓度: 1×10－5 mol/L, DHR123浓度: 1×10－5 mol/L. I和I0为525 nm处的荧光强度, 其中I是随着时间变化的荧光强度, I0是初始没光照的荧光强度, 光通量大小10 mW/cm2)Figure 6 Fluorescence emission spectra of DHR123 under illumination for 100 s when compounds TC (a), T-CHO (b), and YD (c) are used as PSs; (d) Fitting plot of the changes in fluorescence intensity of DHR123 at 525 nm using the equation I/I0 (during testing, the concentration of PSs and DHR123 are both 1×10－5 mol/L. I represents the fluorescence intensity at 525 nm at different time intervals, I0 is the initial fluorescence intensity without illumination, and the light intensity is 10 mW/cm²) |
其次, 采用羟基苯基荧光素(HPF)[18]作为化学传感器, 研究了TC、T-CHO和YD生成•OH的能力, 实验结果如图7和辅助材料图S10所示. •OH能够选择性氧化HPF, 生成的氧化产物在约515 nm处具有较强的荧光发射. 因此, 通过监测HPF与PS体系在515 nm处荧光强度的变化, 可以评估体系中•OH的生成能力. 由图7可见, 在100 s光照时间内, 含有TC的HPF溶液在515 nm处的荧光强度显著上升, 且优于含有T-CHO、YD, ICG及空白组的HPF溶液. 在光照100 s时, 含有TC的HPF溶液的荧光强度达到初始值的3.87倍, 而含有T-CHO和YD的HPF溶液荧光强度分别仅为初始值的1.47和1.23倍, 增幅较小. 相比之下, 含有ICG的HPF溶液和空白对照组的荧光强度分别仅为初始值的1.07和1.00倍. 可见, TC生成•OH的能力明显优于单体分子(T-CHO和YD)和ICG.
图7 化合物TC (a)、T-CHO (b)和YD (c)作为PSs时HPF在100 s内受到光照的荧光发射光谱图; (d)通过公式I/I0对HPF在515 nm处的变化进行拟合图(测试时PSs的浓度: 1×10－5 mol/L, HPF浓度: 1×10－6 mol/L. I和I0为515 nm处的荧光强度, 其中I是随着时间变化的荧光强度, I0是初始没光照的荧光强度, 光通量大小10 mW/cm2)Figure 7 Fluorescence emission spectra of HPF under illumination for 100 s when compounds TC (a), T-CHO (b), and YD (c) are used as PSs; (d) Fitting plot of the changes in fluorescence intensity of HPF at 515 nm using the equation I/I0 (during testing, the concentration of PSs was 1×10－5 mol/L, with a HPF concentration of 1×10－6 mol/L. Here, I represents the fluorescence intensity at 515 nm at different time intervals, I0 is the initial fluorescence intensity without illumination, and the light intensity is 10 mW/cm² |
除了上述几类ROS, PS还能够敏化生成其他类型的ROS. 因此, 使用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为化学传感器, 研究了TC、T-CHO和YD生成总ROS的能力. 在实验中, 随着光照时间的增加, 含有TC、T-CHO和YD的DCFH-DA溶液在525 nm处的荧光强度显著增强, 结果如图8和辅助材料S11所示. 在光照100 s时, 以TC为PS的DCFH-DA溶液荧光强度达到初始值的7.8倍, 显著高于单体分子(T-CHO和YD, 分别为2.89倍和2.12倍)以及ICG (2.11倍).
图8 化合物TC (a)、T-CHO (b)和YD (c)作为PSs时DCFH-DA在100 s内受到光照的荧光发射光谱图; (d)通过公式I/I0对DCFH-DA在525 nm处的变化进行拟合图(测试时PSs的浓度: 1×10－5 mol/L, DCFH-DA浓度: 4×10－5 mol/L. I和I0为525 nm处的荧光强度, 其中I是随着时间变化的荧光强度, I0是初始没光照的荧光强度, 光通量大小10 mW/cm2)Figure 8 Fluorescence emission spectra of DCFH-DA under illumination for 100 s when compounds TC (a), T-CHO (b), and YD (c) are used as PSs; (d) Fitting plot of the changes in fluorescence intensity of DCFH-DA at 525 nm using the equation I/I0 (during testing, the concentration of PSs was 1×10－5 mol/L, with an DCFH-DA concentration of 4×10－5 mol/L. I represents the fluorescence intensity at 525 nm at different time intervals, I0 is the initial fluorescence intensity without illumination, and the light intensity is 10 mW/cm²) |
综合Ⅰ型光动力、Ⅱ型光动力以及总ROS生成能力的测试结果可以得出结论: 具有D-π-A结构的TC展现了最好的ROS产生能力. 这种结构设计不仅使TC的吸收光谱相较于单体分子发生红移, 拓宽了其光捕获范围, 还有效降低了ΔES-T, 从而显著促进了非辐射跃迁(如ISC). 因此, TC的光氧化性能显著优于单体分子(T-CHO和YD)以及对照光敏剂ICG.
2 结论
综上所述, 本研究以三苯胺作为电子供体, 苯乙烯基作为π桥, 吲哚碘鎓作为电子受体, 成功合成了能够产生多种ROS的具有D-π-A结构的半花菁光敏剂TC. 通过稳态和瞬态吸收、荧光光谱测试、理论计算以及ROS生成实验等手段, 系统研究了TC的光物理性质及其ROS生成机制与能力. D-π-A的设计策略, 不仅使TC的吸收发生了明显的红移, 而且有效地拓展了其光捕获范围. 与单体分子(T-CHO: 400~456 nm; YD: 400~440 nm)相比, TC的光捕获范围显著拓展至400~745 nm. 此外, 与单体分子相比, TC的荧光强度和寿命也都大大降低了, 说明这种结构显著增加了其他非辐射通道的发生, 而且与T-CHO (1.50 eV)相比, TC的ΔES-T值降低到了0.73 eV. 这些因素显著提高了TC的ROS生成能力. TC不仅能够通过II型机制生成ROS, 还能够通过I型机制产生ROS. 其I型ROS、II型ROS以及总ROS的生成能力均远远高于单体分子和参照光敏剂ICG, 为其在乏氧环境中的PDT治疗提供了坚实基础. 本研究结果为PDT领域提供了新的分子设计策略和理论支持, 推动了新型高效PSs的开发及其在癌症治疗中的应用进程.
3 实验部分
3.1 仪器与试剂
AVANCE NEO 400型核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)、UV-1800紫外-可见分光光谱仪(中国上海美谱达公司)、FP-8500荧光光谱仪(日本JASCO公司)、FLS980稳态瞬态荧光光谱仪(英国Edinburgh公司)和激光器Q-Switched Nd:YAG laser (Dawa-100)(中国北京镭宝光电技术有限公司).
所有试剂均为商业来源. 2,3,3-三甲基-3H-吲哚、碘乙烷、4-(二苯基氨基)苯硼酸、4-碘苯甲醛、四(三苯基膦)钯[Pd(PPh3)4]、无水硫酸钠(Na2SO4)和无水碳酸钾(K2CO3)等购自上海麦克林生化科技股份有限公司. 三氯甲烷(CHCl3)、二氯甲烷(DCM)、石油醚(PE)、甲醇(MeOH)、氯化钠(NaCl)、乙酸酐(Ac2O)、乙醇(EtOH)、二甲基亚砜(DMSO)、甲苯(Tol)、无水乙腈(ACN)、氘代氯仿(CDCl3)和硅胶等购自中国上海的国药集团化学试剂有限公司.
3.2 化合物的合成
3.2.1 化合物YD[32]的合成
将2,3,3-三甲基-3H-吲哚(1.00 g, 6.28 mmol)和碘乙烷(1.47 g, 9.42 mmol)溶于无水乙腈(10 mL)中, 在室温下持续通入氮气30 min. 随后将混合物在80 ℃下回流搅拌12 h, 用薄层色谱(TLC)板监测反应进程直至原料消耗完毕. 反应结束后, 在减压条件下除去溶剂, 向残余物中加入100 mL的PE, 促使沉淀形成. 通过抽滤收集粉红色粉末YD, 产率为78% (1.54 g). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.73~7.71 (m, 1H), 7.59~7.56 (m, 3H), 4.75 (q, J=7.44 Hz, 2H), 3.14 (s, 3H), 1.64 (s, 6H), 1.61 (t, J=7.48 Hz, 3H).
3.2.2 化合物T-CHO[33]的合成
将4-(二苯基氨基)苯硼酸(1.00 g, 3.46 mmol)、4-碘苯甲醛(1.20 g, 5.18 mmol)、无水碳酸钾(1.43 g, 10.38 mmol)和四(三苯基膦)钯(0.23 g, 0.2 mmol)加入到100 mL单口圆底烧瓶中, 并加入20 mL由Tol/EtOH/H2O (V∶V∶V=8∶1∶1)混合的溶剂进行溶解. 在室温下持续通入氮气30 min后, 将反应混合物在110 ℃下回流搅拌8 h, 用TLC板监测反应进程直至原料消耗完毕. 反应完成后, 将混合物冷却至室温, 并用水/DCM (V∶V=2∶1)萃取三次. 有机层经无水Na2SO4干燥后, 在减压条件下除去溶剂. 通过硅胶柱色谱法使用PE/DCM (V∶V=2∶1)作为洗脱液纯化反应混合物, 得到淡黄色固体产物T-CHO, 产率为83% (1.00 g). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 10.03 (s, 1H), 7.93 (d, J=8.16 Hz, 2H), 7.73 (d, J=8.12 Hz, 2H), 7.52 (d, J=8.60 Hz, 2H), 7.29 (t, J=7.78 Hz, 4H), 7.15 (d, J=7.60 Hz, 6H), 7.07 (t, J=7.32 Hz, 2H).
3.2.3 化合物TC的合成
将化合物YD (0.68 g, 2.15 mmol)和T-CHO (0.60 g, 1.72 mmol)溶于乙酸酐(8 mL)中, 随后将混合物在70 ℃下回流搅拌12 h, 期间用TLC板监测反应进程直至原料消耗完毕. 反应完成后, 将混合物冷却至室温, 并用饱和NaCl溶液/DCM (V∶V=2∶1)萃取三次. 有机层经无水Na2SO4干燥后, 在减压条件下除去溶剂. 通过硅胶柱色谱法使用DCM/MeOH (V∶V=50∶1)作为洗脱液纯化反应混合物, 得到深紫色固体产物TC, 产率为52% (0.58 g). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.28 (d, J=8.32 Hz, 2H), 8.25 (d, J=16.56 Hz, 1H), 7.86 (d, J=16.04 Hz, 1H), 7.76 (d, J=8.24 Hz, 2H), 7.66~7.52 (m, 6H), 7.28 (t, J=7.86 Hz, 4H), 7.14~7.05 (m, 8H), 5.05 (q, J=7.17 Hz, 2H), 1.86 (s, 6H), 1.62 (t, J=7.24 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 181.22, 154.93, 148.93, 147.33, 146.60, 143.52, 140.52, 132.60, 132.14, 129.91, 129.58, 129.37, 128.10, 127.68, 127.28, 125.21, 124.46, 123.82, 122.89, 114.89, 111.94, 52.52, 44.65, 27.29, 14.50; FT-IR (KBr) ν: 2920, 2850, 1577, 1515, 1486, 1402, 1365, 1315, 1269, 1194, 1171, 1118, 1088, 1019, 949, 816, 752, 695 cm－1; HRMS (MALDI-TOF) calcd for C38H35N2 519.2795, found 519.2799.
3.3 荧光寿命的测试
所有待测样品化合物TC、T-CHO和YD均采用CHCl3作为溶剂, 配制成浓度为1×10－5 mol/L的溶液. 将装有待测样品溶液的比色皿放置于在FLS980稳态瞬态荧光光谱仪上, 从而获得相应的时间分辨的瞬态荧光光谱, 根据实验需求选择适当的激发波长、狭缝和测试范围(激发波长分别为400和540 nm, 能量分别为3.1和2.9 eV). 3.1和2.9 eV的激发光由脉冲宽度为6 ps、重复频率为5 MHz的SC400-2超连续激光源提供, 时间分辨荧光数据的采集基于TCSPC技术.
3.4 瞬态吸收的测试
纳秒瞬态吸收光谱采用自制的激光闪光光解系统获取. 实验前, 所有溶液均使用高纯度氮气吹扫20 min以去除氧气, 激发光源为Q-Switched Nd:YAG laser (Dawa-100)的二次谐波输出(355 nm), 具有8 ns的脉冲宽度和10 Hz的重复频率. 该激光束与来自500 W氙灯的白色光在10 mm石英比色皿内交汇. 为了达到最优的信噪比, 每个激光脉冲的能量设置约为10 mJ/pulse. 瞬态吸收信号由连接光电倍增管的单色仪记录, 确保了对光-物质相互作用动态过程的精确测量.
3.5 理论计算
理论计算使用了Gaussian 09W软件, 对所有分子的基态的计算使用了密度泛函理论(DFT)方法, 激发态的计算使用了时间依赖密度泛函理论(TD-DFT), 都采用了CAM-B3LYP泛函和6-31G(d)基组, 同时使用IEFPCM模型模拟水溶剂环境, 对分子轨道的贡献和电子空穴的转移特性进行了探究.
3.6 ROS的检测
3.6.1 1O2的检测
使用MeOH配制了1×10－3 mol/L的TC、T-CHO、YD和ICG溶液, 同时使用DMSO配制了1×10－3 mol/L的ABDA溶液. 然后取20 μL的待测溶液与25 μL的ABDA溶液混合, 加入到含有去离子水的比色皿中, 使总体积达到2 mL, MeOH/DMSO/H2O (V∶V∶V≈1∶1∶98)并确保溶液充分混合均匀. 随后, 使用LED (10 mW/cm2)照射溶液, 每隔10 s记录一次ABDA在320~420 nm区间的吸收强度的变化.
1O2的量子产率(ΦΔ)[25]使用以下公式确定:
$\Phi_{\Delta}(\mathrm{x})=\Phi_{\Delta}(\mathrm{std}) \frac{k_{\mathrm{obs}}(\mathrm{x}) \cdot I(\mathrm{std})}{k_{\mathrm{obs}}(\mathrm{std}) \cdot I(\mathrm{x})}$
在这个公式中, Φ∆(x)和Φ∆(std)是PSs和ICG产生1O2的量子产率. kobs(x)和kobs(std)分别是PSs和ICG光氧化ABDA的ln(A/A0)斜率与照射时间的绝对值. I(x)和I(std)分别是PSs和ICG吸收的总光强度.
3.6.2 $\mathrm{O}_{2}^{g-}$的检测
使用MeOH配制了1×10－3 mol/L的TC、T-CHO、YD和ICG溶液, 同时使用DMSO配制了1×10－3 mol/L的DHR123溶液, 然后取20 μL的待测溶液与20 μL的DHR123溶液混合, 加入到含有去离子水的比色皿中, 使总体积达到2 mL, 并确保溶液充分混合均匀. 随后, 用LED (10 mW/cm2)照射溶液, 使用488 nm的激发波长, 每隔10 s记录一次DHR123在525 nm处的荧光强度变化.
3.6.3 •OH的检测
使用MeOH配制了1×10－3 mol/L的TC、T-CHO、YD和ICG溶液, 同时使用DMF配制了1×10－3 mol/L的HPF溶液, 然后取20 μL的待测溶液与2 μL的HPF溶液混合, 加入到含有去离子水的比色皿中, 使总体积达到2 mL, 并确保溶液充分混合均匀. 然后用LED (10 mW/cm2)照射, 使用492 nm的激发波长, 每隔10 s记录一次HPF在515 nm处的荧光强度变化.
3.6.4 总ROS的检测
使用MeOH配制了浓度为1×10－3 mol/L的TC、T-CHO、YD和ICG溶液, 同时使用DMSO配制了2 mmol/L的DCFH-DA溶液, 并配制了4 mg/10 mL的NaOH溶液. 取50 μL的DCFH-DA溶液和0.4 mL的NaOH溶液, 混合后活化30 min. 之后, 取20 μL的待测溶液与40 μL活化后的DCFH-DA溶液混合, 加入到含有去离子水的比色皿中, 使总体积达到2 mL, 确保溶液充分混合均匀. 然后用LED (10 mW/cm2)照射, 使用488 nm的激发波长, 每隔10 s记录一次DCFH-DA在525 nm处的荧光增强情况.
辅助材料(Supporting Information) 化合物TC、T-CHO和YD的核磁共振光谱和高分辨质谱、ROS的测试数据和理论计算. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.
(Cheng, F.)