水产品的腐败变质主要是由内源性酶和微生物介导的蛋白质分解代谢引起, 这一过程会产生尸胺、腐胺、精胺和亚精胺等生物胺[1-2], 这些生物胺已被证实可作为评估水产品质量和新鲜度的重要指标[3-4]. 过量摄入这些化合物会引发头痛、过敏或低血压等不良反应, 严重时甚至导致休克或死亡[5]. 鉴于生物胺含量与食品安全密切相关, 建立高效的检测方法具有重要意义[6-7]. 目前, 生物胺的常规检测主要依赖于气相色谱-质谱联用、化学敏感电阻、酶联检测、电化学分析和化学发光等技术[8]. 尽管这些方法具有较高的检测精度, 但其复杂的样品前处理流程和较长的分析时间限制了其在现场快速检测中的应用, 难以满足水产品新鲜度实时监测的需求[9].
近年来, 荧光探针技术因其灵敏度高、选择性好和操作便捷等特点[10-11], 在食品安全检测领域展现出显著优势[12]. Zeng等[13]于2023年开发的间苯二酚基荧光探针(RFCC)能够特异性识别尸胺和腐胺, 表现出明显的荧光开启效应, 荧光由无色变为粉红色; 负载RFCC的试纸条的RGB值与尸胺浓度呈良好的线性关系, 这为水产品新鲜度监测提供了简便、经济的解决方案. 2024年, 本课题组[14]基于苯并吡喃类荧光团合成了一种可超快检测亚硫酸盐和生物胺的荧光探针HDXM, 所制得HDXM负载标签与琼脂糖水凝胶, 可通过比色和荧光双通道对三文鱼肉新鲜度进行实时可视化监测. 然而, 单纯依靠肉眼观察日光颜色和荧光变化来评估新鲜度可能存在一定误差, 为此, 我们提出将高分辨率智能手机与专业色彩分析软件相结合的策略, 通过精确量化红、绿及蓝(RGB)值来提升检测准确性. Wang等[15]设计两种香豆素-二氟硼β-二酮杂化探针, 成功地检测了虾和猪肉腐坏过程中提取物上清液中的生物胺, 并将两个探针与智能手机处理软件相结合, 实现了对食品腐败过程中生物胺的即时检测.
本研究以噻吩醛为荧光团, 引入吸电子基团2,4-噻唑烷二酮, 合成了一种具有典型供体(D)-π-受体(A)结 构[16]的噻吩醛衍生物类荧光探针PTD (Scheme 1). PTD在二甲基亚砜(DMSO)/H2O (V∶V=5∶5)溶液中能快速响应生物胺, 并发出橙红色荧光. 制备的负载PTD的便携式指示标签[17], 可以监测三文鱼肉腐败过程中总挥发性盐基氮(TVB-N)值以及指示标签颜色的变化. 此外, 将指示标签与智能手机软件结合, 构建了智能一体化传感平台, 可自动提取R/(B＋G)值, 并建立R/(B＋G)值与鱼肉TVB-N值之间的线性关系, 进而准确判断三文鱼肉的新鲜度等级[18]. 相较于仅凭肉眼观察标签颜色变化来判断三文鱼肉的新鲜度, 这种便携式指示标签与智能手机相结合的方式[19], 大大提高了检测结果的准确度, 为商家和消费者提供了极大的便利性. 此外, 探针PTD还与已报道的其他检测胺类物质的荧光探针进行了对比, 结果表现出优异的性能.
1 结果与讨论
1.1 PTD对胺的紫外响应
首先, 探究了探针PTD对不同挥发性胺的紫外选择性, 在DMSO/H2O (V∶V=5∶5)溶液中加入了探针PTD和13种胺(乙胺、二乙胺、氨水、三乙胺、二甲胺、三甲胺、色胺、苯胺、腐胺、尸胺、精胺、2-苯乙胺和酪胺)来测试PTD对其紫外识别效果. 如图1a所示, 除苯胺外, 其余12种胺类溶液的加入均会导致紫外吸收光谱的改变, 其中, 在460 nm处的吸收峰消失, 同时在425 nm处产生新的吸收峰, 并伴随着溶液颜色的变化, 由无色变为黄色. 以上结果表明, PTD能够对多种生物胺实现裸眼可视识别.
图1 (a) PTD溶液中加入不同胺的紫外-可见吸收光谱[内插图为日光颜色变化, 1: 色胺, 2: 氨水, 3: 二甲胺, 4: 三乙胺, 5: 乙胺, 6: 精胺, 7: 尸胺, 8: 酪胺, 9: 2-苯乙胺, 10: 二乙胺, 11: 三甲胺, 12: 腐胺(Put), 13: 苯胺)]; (b) PTD溶液中加入不同胺的荧光光谱(内插图为荧光变化); (c) PTD溶液中加入不同浓度腐胺后的荧光光谱[内插图为625 nm 波长下腐胺浓度(0~300 μmol/L)与荧光强度的线性关系图]Figure 1 (a) Ultraviolet-visible absorption spectra of different amines added to PTD solution (Inset: color changes of sunlight, 1: tryptamine, 2: ammonia water, 3: dimethylamine, 4: triethylamine, 5: ethylamine, 6: spermatine, 7: cothiamine, 8: tyramine, 9: 2-phenyl- ethylamine, 10: diethylamine, 11: trimethylamine, 12: putrescine (Put), 13: aniline); (b) fluorescence spectra of different amines added to PTD solution (Inset: fluorescence changes); (c) fluorescence spectra of PTD solution after adding different concentrations of putsamine (Inset: linear relationship graph between the concentration of putsamine (0~300 μmol/L) and fluorescence intensity at a wavelength of 625 nm) |
1.2 PTD对胺的荧光响应
为了探究PTD对不同胺的荧光响应, 测试了其对13种胺的荧光光谱变化. 如图1b所示, PTD在665 nm处有微弱的荧光发射, 加入胺溶液后, 除苯胺外, 其它胺均引起625 nm处不同程度的荧光增强, 溶液发出橙红色荧光. 由此可见, PTD对大多数生物胺都表现出优异的荧光响应.
1.3 响应时间和pH对PTD性能的影响
1.4 PTD对生物胺的响应机理
1.5 负载PTD的指示标签对胺的响应
为考察负载PTD的指示标签对胺类物质的敏感性, 选取二甲胺、三甲胺和氨水为代表性胺类, 将指示标签置于密封小瓶上方(瓶内含有上述胺溶液), 以模拟鱼肉变质时的胺释放环境, 并与空白组进行对照. 如图4a所示, 二甲胺、三甲胺和氨水经过熏2 h后, 指示标签的日光颜色均变为土黄色, 荧光均变为肉粉色. 实验结果表明, 负载PTD的指示标签能对胺表现出较好的传感能力, 这为后续指示标签用于三文鱼肉新鲜度可视化监测提供了实验依据.
1.6 风味物质、温度和时间对负载PTD的指示标签的影响
为了考察挥发性风味物质对指示标签性能的影响, 选取乙酸乙酯、苯乙醛和苯乙醇三种典型的风味物质进行测试. 如图4b所示, 初始状态(0 h)下指示标签在日光下呈橙色, 荧光为亮橙色, 随着时间推移, 12 h内标签的比色和荧光颜色均未出现明显改变. 以上结果表明, 挥发性风味物质对指示标签的日光和荧光影响不明显, 可有效避免挥发性风味物质的干扰.
1.7 负载PTD的指示标签对三文鱼肉新鲜度的监测
三文鱼肉质鲜嫩、营养丰富, 但容易腐败变质, 为了评估负载PTD的指示标签对三文鱼肉新鲜度监测的实际效果, 同时测了TVB-N、pH、菌落总数(TVC)和硫代巴比妥酸(TBA)四个新鲜度指标来验证指示标签的准确度[23].
根据国家标准《鲜鱼通则》, TVB-N值低于15 mg/ 100 g时为新鲜; TVB-N值介于15~30 mg/100 g时为合格; 当TVB-N值高于30 mg/100 g时, 鱼肉已经变质. TVB-N值越高, 说明鱼肉腐败程度越严重. 如图5a和5c所示, 在4 ℃下, 初始鱼肉的TVB-N值为6.75 mg/100 g, 此时指示标签的日光颜色为橙色, 荧光为亮橙色; 第4 d时, TVB-N值增加到16.67 mg/100 g, 鱼肉为合格, 指示标签的日光颜色为暗橙色, 荧光为浅橙色; 第6 d时, TVB-N值已经达到31.36 mg/100 g, 此时鱼肉已经变质, 指示标签的日光颜色变为土黄色, 荧光颜色为肉粉色. 因此, 可以依据指示标签的比色和荧光变化, 能够有效鉴别三文鱼肉的新鲜度等级.
在鱼肉贮藏初始阶段会因代谢产生乳酸, 导致pH值下降. 而随着贮藏时间的推移, 鱼肉中的蛋白质在微生物的作用下会逐步分解生成二甲胺、尸胺和腐胺等碱性含氮物质, 进而促使pH值升高. 由此可见, pH值的变化也可以反映鱼肉的新鲜程度. 如图5a所示, 新鲜三文鱼肉的pH值为6.83, 随着时间的延长, pH值呈现先降低后升高的趋势; 到第7 d达到7.67, 表明三文鱼肉已经腐败严重, 不可食用. 此外, TVC和TBA也是评价鱼肉新鲜度的两个重要指标. 如图5b所示, TVC初始值为3.50 lg CFU/g, TBA初始值为0.122 mg MDA/kg, 随着储存时间的增加, 二者也逐渐升高; 第7 d时, TVC和TBA值分别升高至9.30 lg CFU/g和1.125 mg MDA/kg, 均超过各自的安全阈值(7.0 lg CFU/g和1.0 mg MDA/kg), 表明三文鱼肉已经彻底腐败. 上述实验结果证明, 指示标签的比色和荧光变化与表征鱼肉新鲜度等级的四个指标变化一致, 因此, 可以使用负载PTD的指示标签来评估三文鱼肉的新鲜度.
1.8 智能一体化平台对三文鱼肉新鲜度的监测与验证
智能一体化检测平台因其便捷性和精准性, 可以有效避免肉眼观察对三文鱼肉新鲜度等级判断的主观误差. 我们采用自开发的智能手机软件(Visual Evaluation, VE)与负载PTD的指示标签构建智能一体化检测平台, 可以实现对三文鱼肉的TVB-N值进行定量检测, 从而准确评估新鲜度[24]. 如图6a所示, 在VE软件中将RGB值提取公式设置为R/(B＋G)后, 在365 nm紫外灯下提取负载PTD的指示标签的R/(B＋G)值, 根据拟合软件发现二者之间存在良好的线性关系(Y=－0.0152X＋1.28457, R2=0.99386), 表明该智能一体化检测平台可以实时定量监测鱼肉的TVB-N值, 从而方便地评估新鲜度等级.
图6 (a)智能手机VE软件示意图、智能手机的RGB提取功能及PTD指示标签的R/(B＋G)值与三文鱼肉TVB-N含量的线性关系; (b)在25 ℃条件下智能手机软件提取三个时间节点的R/(B＋G)值; (c)由图b得到的R/(B＋G)值自动输出相应的TVB-N值, 并与国标法测出的TVB-N值(括号内的数值)进行对比验证Figure 6 (a) Schematic diagram of the VE software of the smart phone, RGB extraction function of the smart phone, and the linear relationship between the R/(B＋G) value of the PTD indication label and the TVB-N content of salmon meat; (b) Under the condition of 25 ℃, the R/(B＋G) values of the three time nodes extracted by the smart phone software; (c) TVB‑N values automatically output from the R/(B+G) values obtained from Figure B and compared and verified with those determined by the national standard method (the values in parentheses) |
为了验证上述智能一体化平台监测三文鱼肉新鲜度的可靠性和准确性, 利用该智能检测平台对室温储存下的新鲜三文鱼肉进行跟踪监测, 并与采用中国国家标准方法测定的三文鱼肉TVB-N值进行对比验证. 随机选取5、20和30 h三个时间点, 使用VE软件对这三个时间点的指示标签进行扫描, 提取R/(B＋G)值(图6b), 随后自动输出TVB-N值, 分别为6.174、23.125、34.37 mg/100 g(图6c). 同时, 用中国国家标准方法测定三文鱼肉在这三个时间点的TVB-N值, 分别为7.23、25.65和35.12 mg/100 g. 两种方法测定的TVB-N值差异不大, 新鲜度等级判断一致, 表明构建的智能一体化检测平台准确度高、测量结果可靠, 可用于现场实时定量检测鱼肉的TVB-N值并准确评估新鲜度.
2 结论
开发了一种对生物胺特异性响应的“OFF-ON”型荧光探针PTD, 该探针在DMSO/H2O (V∶V=5∶5)体系中对胺响应迅速、灵敏度高、近红外发射, 能够通过比色和荧光开启识别多种胺. 制备的负载PTD的便携式指示标签是肉眼监测鱼肉新鲜度的有效工具. 此外, 将指示标签与智能手机软件结合, 实现了对三文鱼肉TVB-N值的自动获取, 并在室温条件下验证了该智能一体化平台对三文鱼肉新鲜度评价的准确性和可靠性. 本研究结果为水产品新鲜度的快速、准确评估提供了强有力的技术支持和智能化的解决方案.
3 实验部分
3.1 仪器与试剂
电子天平(JY12001)、手提式紫外灯(WFH-204B)、旋转蒸发仪(R-1001VN)、U-T1810DS紫外分光光度计(U-T1810DS)、F4700荧光分光光度计和S-25B pH计. 三文鱼肉购于锦州市水产市场. 2,4-噻唑烷二酮、4-溴- N,N-二甲基苯胺、5-醛基-2-噻吩硼酸、四(三苯基膦)钯、三甲胺、氨水、乙胺、二乙胺、三乙胺、苯胺、色胺、尸胺、精胺、腐胺、哌啶、二甲胺2-苯乙胺、酪胺、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、无水乙醇、甲醇、四氢呋喃、二甲基亚砜和碳酸钾等全部采购于安耐吉化学, 分析纯, 无需进一步纯化.
3.2 实验方法
3.2.1 探针PTD的合成
化合物PTC根据文献方法[25-26]合成. 在50 mL圆底烧瓶中, 将化合物PTC (2 mmo1, 71 mg)与2,4-噻唑烷二酮(2.2 mmo1, 70 mg)溶解于无水乙醇中, 加入一滴哌啶作为催化剂. 反应体系在氮气保护下于85 ℃, 通过磁力搅拌维持回流状态5 h. 待反应结束后, 将混合物冷却至室温, 利用减压旋蒸法除去溶剂, 得到粗产物. 随后用无水乙醇对粗产物进行洗涤, 干燥处理后得到暗红色固体PTD (52.3 mg, 产率52.3%). m.p. 178.3~179.9 ℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.52 (t, J=6.7 Hz, 1H), 7.33 (s, 1H), 6.73 (s, 1H), 3.34 (s, 6H), 3.00 (s, 1H), 2.94 (s, 2H), 1.58 (d, J=25.6 Hz, 2H); 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ: 150.43, 148.12, 137.44, 132.52, 126.55, 122.12, 121.42, 118.34, 112.64, 43.99, 22.49, 21.89; HRMS(ESI－) calcd for C16H13N2O2S2 [M－H]－ 329.0497, found 329.0502.
3.2.2 探针溶液的配制
将3.3 mg PTD溶于DMSO中, 用DMSO定容至10 mL, 得到1 mmol/L的PTD原液[27], 测试前将原液用DMSO/H2O (V∶V=5∶5)稀释至浓度为10 μmol/L. 测试条件: λex=430 nm, λem=670 nm, slits: 5/10 nm.
3.2.3 胺溶液的配制
将各种胺(二甲胺、三甲胺、氨水、乙胺、二乙胺、三乙胺、苯胺、色胺、尸胺、精胺、腐胺、2-苯乙胺、酪胺)分别溶解在10 mL的二次蒸馏水中, 配成50 mmol/L的胺溶液[28].
3.2.4 负载PTD的指示标签制备
取圆形滤纸(2 cm×2 cm)用PTD原液浸泡过夜后取出晾干, 即得PTD指示标签.
3.2.5 指示标签对胺的响应
实验选取二甲胺、三甲胺和氨水三种具有代表性的挥发性物质, 用于探究指示标签对胺蒸气的响应效果, 并记录指示标签反应前后的比色和荧光变化. 分别向小瓶中加入1 mL的浓度为50 mmol/L的二甲胺、三甲胺、氨水的储备液, 将圆形滤纸片指示标签悬挂于小瓶中, 然后密封, 在25 ℃下收集指示标签的图像信息[29].
3.2.6 风味物质、温度和时间对指示标签的影响
将指示标签置于密闭的装有乙酸乙酯、苯乙醛和苯乙醇的小瓶中, 每隔1 h采集指示标签的图像信息, 考察风味物质对指示标签的影响. 此外, 将指示标签分别置于室温(25 ℃)和冷藏(4 ℃)环境下的培养皿中, 每隔1 d采集指示标签的图像信息, 考察温度对指示标签的影响.
3.2.7 负载PTD的指示标签在监测三文鱼肉新鲜度中的应用
辅助材料(Supporting Information) 化合物PTD的表征数据, TVB-N、pH、TVC和TAB的测定方法, 以及智能手机平台测试参数. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.
(Zhao, C.)