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2025 , Vol. 83 >Issue 9: 1089 - 1102

DOI: https://doi.org/10.6023/A25050179

综述

纳米孔DNA单分子测序★

  • 白宏震 ,
  • 谭皓璟 ,
  • 冯建东 , *
展开
  • 浙江大学 化学系 物理生物学实验室 杭州 310058

★ “中国青年化学家”专辑.

白宏震, 浙江大学化学系副研究员, 主要从事功能高分子、纳米材料和单分子测量等方面研究. 发展面向生命科学和精准医学的分子传感技术和药物输送系统, 实现对生物过程和疾病通路的解析及调控.

谭皓璟, 浙江大学化学系博士研究生, 研究内容为基于纳米孔的单分子测量以及纳米尺度流体传输现象和物理机制探索.

冯建东, 浙江大学求是特聘教授, 化学、光学工程博导, 主要从事单分子操控、测量、超分辨成像方法和科学装置研究. 发展单分子电学、光学、化学、量子测量等实验手段, 研制精密测量科学装置, 实现面向物质、信息极限的分子测量和数字化认知.

收稿日期: 2025-05-19

  网络出版日期: 2025-07-11

基金资助

国家重点研发计划(2020YFA0211200)

国家自然科学基金面上(22175153)

新基石科学基金会科学探索奖资助

收起

Nanopore-based Single-molecule DNA Sequencing★

  • Hongzhen Bai ,
  • Haojing Tan ,
  • Jiandong Feng , *
Expand
  • Laboratory of Experimental Physical Biology, Department of Chemistry, Zhejiang University, Hangzhou 310058
* E-mail:

★ For the VSI “Rising Stars in Chemistry”.

Received date: 2025-05-19

  Online published: 2025-07-11

Supported by

National Key R&D Program of China(2020YFA0211200)

National Natural Science Foundation of China(22175153)

New Cornerstone Science Foundation through the XPLORER Prize

Fold

摘要

纳米孔测序技术作为一种革命性的单分子测序方法, 利用限域纳米孔与DNA分子的非共价相互作用解析碱基信息, 进而从单分子水平读取DNA序列. 这种直接的物理读取方法具有无标记、长读长、高通量、低成本和实时检测等独特优势, 在基因组学、医学研究等领域展现出巨大应用潜力. 本文系统性综述了纳米孔单分子测序的原理与发展历程, 重点阐述了纳米孔测量空间分辨率提升策略、基于马达蛋白的测序时间分辨率控制策略、纳米孔测序系统的构建, 并探讨这些关键因素之间的相互关系及影响. 在此基础上, 讨论纳米孔测序技术的应用现状与发展趋势.

关键词： 单分子测量; 生物纳米孔; DNA测序; 基因组学

本文引用格式

白宏震 , 谭皓璟 , 冯建东 . 纳米孔DNA单分子测序★[J]. 化学学报, 2025 , 83(9) : 1089 -1102 . DOI: 10.6023/A25050179

Abstract

As a revolutionary single-molecule sequencing technology, nanopore DNA sequencing technology leverages the non-covalent interactions between nano-confined sensing interfaces and DNA molecules to parse the base information, then reading the DNA sequence at the single-molecule level. This physical method for direct reading of DNA offers unique advantages such as label-free, long reads, high-throughput, cost-effective, and real-time detection, demonstrating immense potential in genomics research and medicine science. This review summarizes the principles and development history of biological nanopore-based single-molecule DNA sequencing, focusing on key aspects including the engineering of biological nanopores for spatial resolution improvement, motor protein-based strategies of DNA translocation for time resolution control, and the construction of nanopore sequencing systems, then going deep into the underlying connection of these factors. Based on these, the current application and future development of nanopore-based single-molecule sequencing technology has been discussed.

Key words： single-molecule measurement; biological nanopores; DNA sequencing; genomics

1 引言

DNA测序已成为目前生命医学最重要的研究方法之一. 测序技术的开发已经历了多轮技术迭代和革新: 第一代测序技术以Sanger双脱氧链末端终止法为主要代表, 其原理基于DNA聚合酶在模板上合成一条新DNA链的过程. 在合成过程中加入双脱氧核苷三磷酸(ddNTPs)来终止链合成, 通过测定这些终止位置确定DNA序列. 该测序技术的突出优点是稳定性好、准确性高, 但通量低, 难以实现大规模测序. 第二代测序技术以Roche的454焦磷酸测序、Illumina的Solexa测序和ABI公司的SOLiD测序为代表, 其原理主要为边合成边测序(454焦磷酸测序和Solexa测序技术)和连接法测序(SOLiD测序平台). 与第一代测序技术相比, 第二代测序技术真正意义上实现了高通量. 但读长较短, 同时测序准确性受到焦磷酸检测中同聚物生成或聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)中错配碱基引入的影响. 上述测序技术均是利用生化处理或标记手段来“放大”或“变换”核苷酸碱基信息, 再从这些信息中还原出序列信息, 本质上都属于间接读取DNA序列的技术且在“加工-还原”过程中易引入错读. 如何规避“加工-还原”步骤, 实现序列信息的直接、精准读取, 是测序领域需要解决的问题. 为此, 研究人员开发了基于单分子读取的第三代测序技术, 例如Pacific Biosciences公司的单分子实时测序技术(SMRT), 其原理是通过实时观测固定在纳米孔底部的DNA聚合酶在聚合过程中逐个识别DNA模板上的碱基而发出不同的荧光信号来读取序列信息. SMRT的突出特点是无需PCR扩增且具有较高测序速度, 但准确性有待提升[1-3]. 20世纪90年代, 以纳米孔作为核苷酸传感器, 利用DNA线性穿孔的特征信号读取序列信息的设想被提出. 历经发展, 基于纳米孔的单分子测序技术应运而生, 正推动DNA测序向低成本、高速率、高通量和便捷化的方向发展.
单分子测量作为一种直接、实时观测分子结构、动态行为和相互作用的分析化学技术, 从微观尺度揭示分子的本征信息和演进规律, 为揭示分子属性、化学反应和运行机制等提供更为精准的认知[4]. 基于纳米孔的DNA测序是一种重要的单分子测序技术, 其利用纳米孔的限域传感界面与DNA分子产生相互作用, 直接读取相互作用所产生的电流信号, 进一步解析核苷酸化学结构与信号特征的映射关系, 从而在分子水平刻画DNA序列信息. 这一单分子生物物理学测量技术突破了传统测序方法的“加工-还原”模式, 通过物理观测直接获取碱基信息, 正推动测序技术向无标记、长读长、高通量、低成本和实时检测迈进. 根据材质类型, 纳米孔可分为生物纳米孔和固态纳米孔, 前者是指利用自然界中的生物蛋白作为纳米孔结构对分子进行测量传感, 包括离子通道、蛋白通道、孔状毒素、病毒结构及DNA解旋酶; 后者则是在无机薄膜上制备的尺寸在纳米量级的小孔结构, 常见的固态纳米孔有氮化硅(SiNx)、二氧化硅(SiO2)、石墨烯、二硫化钼(MoS2)、氮化硼(h-BN)及氧化铪(HfO2)纳米孔等[5-6]. 生物纳米孔的几何结构、孔内壁的电荷分布以及氨基酸的排列位置等因素都会影响其传感灵敏度, 可通过蛋白工程在氨基酸水平进行孔结构改造和传感性能调控; 固态孔则具有孔道长度、孔径高度可控的特点, 其对于外部测试环境表现出更高的稳定性和耐受性. 2001年Li等[7]利用SiNx固态纳米孔对双链DNA进行过孔测试; 随后, 在双链DNA的固态纳米穿孔信号中, 研究人员解析了DNA单分子的折叠/非折叠形态所对应的电流阻塞特征, 这些研究为基于固态纳米孔的DNA单分子测量奠定基础[8]. 进一步研究表明, 固态纳米孔还能传感DNA分子的长度和“结”立体构型[9]. 伴随石墨烯、MoS2、h-BN等二维材料纳米孔在单分子测量领域的应用[10-12], 固态纳米孔的空间分辨率得到进一步提升, 实现了对DNA不同碱基信号的统计识别[13]. 尽管固态纳米孔尚未实现DNA单分子测序, 但其仍在核酸分叉识别、基因编辑检测以及基因信息存储等方面展现出应用潜力[14-16].
一些综述论文已经详细阐述了基于固态纳米孔的单分子测量技术及DNA传感研究[6,17-18], 本文将以生物纳米孔(以下简称纳米孔)的DNA单分子测序为主题展开综述. 围绕这一主题, 大量综述论文详细地阐述了纳米孔的空间结构及改造策略、测序技术的迭代及分析方法的创新[19-21]. 本文在简述纳米孔测序的基本原理和发展历程的基础上, 以纳米孔测序空间分辨率提升策略、测序时间分辨率控制策略为主线, 阐述纳米孔DNA单分子测序的关键技术和发展轨迹. 进一步系统综述纳米孔测序系统、测序策略及测序算法的发展现状, 并对其应用现状和发展方向展开讨论, 这为理解纳米孔单分子测序技术及该领域重要科学问题提供了重要支持.

2 纳米孔DNA测序技术及其发展历程概述

2.1 纳米孔测序技术原理

单分子DNA测序目前主要以生物纳米孔作为传感平台. 常见的生物纳米孔(以下简称纳米孔)测序平台包含两个由磷脂膜或其他人造膜分割的腔室以及一个位于膜上的生物纳米孔组成. 一对电极分别置于两个腔内用于施加驱动电压和读取电信号. 其测序原理可描述为: 生物纳米孔孔道内部存在一个短且狭窄的结构, 这个结构通常被称为传感区域. 当单链DNA分子在马达蛋白或外加电场的作用下穿过该区域时, 与敏感位点发生相互作用并引起纳米孔电生理特性的变化, 产生阻塞电流(图1). 限域传感区内的不同核苷酸结构会产生不同的信号特征, 对其进行解析即可获得相应的单碱基信息, 从而读取DNA分子的序列信息[22]. 由此可见, 纳米孔测序不依赖PCR等生化预处理, 也不需要荧光标记, 而是利用核苷酸孔内易位所产生的物理信号进行直接测序; 理论上只要DNA提取获得足够长度的序列, 这种限域单分子测量技术就可以对其进行检测和分析, 因此纳米孔测序技术可以实现无标记、长读长测序.
图1 纳米孔测序的基本概念与原理示意图. (a)纳米孔单分子测序平台示意图. 在测量槽中注入电解质溶液(通常为KCl缓冲液), 由一片特氟龙薄膜分割为两个腔室. 薄膜中间有一个直径约100 μm的支撑孔, 用来结合磷脂双分子层. 随后加入生物纳米孔, 使其自发插入磷脂层, 形成测量通道[86]. 灰色为磷脂膜, 蓝色孔道为生物纳米孔. (b) MspA纳米孔结构及传感区示意图. 在磷脂双分子层的两侧插入电极, cis侧为负电压, trans侧为正电压. I0表示没有分析物穿孔时的纳米孔内离子电流. (c) MspA纳米孔测序示意图: 单链DNA与DNA聚合酶phi29形成复合物, 这种复合物能稳定保持在纳米孔端口. 在聚合酶的作用下, 单链DNA开始合成双螺旋结构. 在该过程中, 聚合酶的引物延伸“力量”驱动单链DNA在纳米孔内的步进易位, 逐个碱基地从纳米孔向上拉出单链DNA. 单链DNA分子进入传感区后阻塞孔道使得离子电流降低, 从而产生阻塞电流信号Ib. (d)纳米孔阻塞电流与测序: 不同序列的单链DNA穿过纳米孔时产生不同持续时间和幅度的阻塞电流[31]. 通过分析堵孔深度和堵孔时间, 可以在单分子水平上对DNA进行直接传感, 通过碱基识别算法分析DNA序列信息.

Figure 1 Schematic illustration of the basic concepts and principles of nanopore DNA sequencing. (a) Schematic diagram of the nanopore single-molecule sequencing platform. The electrolyte solution (usually KCl buffer) is injected into the measurement tank, and the tank is divided into two chambers by a Teflon film. There is a support pore with a diameter of approximately 100 μm in the middle of the film, which is used to bind the phospholipid bilayer. Subsequently, biological nanopores are added in the solution to spontaneously insert into the phospholipid layer, forming a nanoscale measurement channel[86]. Phospholipid membrane is shown in gray, and the biological nanopores are presented as blue channels. (b) Schematic diagram of the structure and sensing area of MspA nanopores. A pair of electrodes is inserted into the two sides of the phospholipid bilayer, with a negative voltage on the cis side and a positive voltage on the trans side. I0 represents the ion current within the nanopores when no analyte is perforated. (c) Schematic of MspA nanopore sequencing. Single-stranded DNA (ssDNA) forms a complex with the DNA polymerase phi29, and this complex can stably remain at the nanopore port. Under the action of polymerase, ssDNA begins to synthesize the double helix structure. During this process, the primer extension "force" of the polymerase drives the stepped-translocation of ssDNA within the nanopores, pulling out the ssDNA from the nanopores one base at a time. When ssDNA molecules enter the sensing region, they block the nano-channels, reducing the ionic current and thereby generating the blocking current signal Ib. (d) Nanopore blockade current and sequencing. When ssDNA molecules with different sequences pass through nanopores, blocking currents with different durations and amplitudes are generated[31]. By analyzing the depth and time of blockade currents, DNA can be directly sensed at the single-molecule level, and the DNA sequence information can be analyzed through base calling algorithms.

2.2 纳米孔测序发展历程

实现纳米孔测序关键是如何在空间、时间维度提升纳米孔单分子传感体系的碱基识别分辨率, 而纳米孔测序的发展历程也正是围绕这一关键问题所展开的理论创新与技术迭代. 首先, 纳米孔结构属性直接决定其碱基识别的空间分辨率, 纳米孔的传感区需要具有与单链DNA分子大小相匹配的孔径(≈1 nm); 同时传感区也要尽可能小, 使得监测到的阻塞电流源于少量核苷酸; 在此基础上, 生物纳米孔还需具有良好的机械、电学与化学稳定性并且可以通过自发插入或自发组装的方式在磷脂膜或人造膜上形成纳米孔道结构. 1989年, Deamer等[23]提出了纳米孔测序的概念. 1996年, 他与Branton等[24]在α-Hemolysin (α-HL)纳米孔内检测到了单链RNA与单链DNA在电泳驱动下穿过纳米孔所产生的电流信号, 验证了纳米孔单分子测序的原理. 进一步研究表明, α-HL传感区的空间分辨率能够区分嘌呤与吡啶片段, 并识别DNA分子间单个核苷酸的差异[25-26]. 2005年, Bayley等[23]创立牛津纳米孔公司(Oxford Nanopore Technologies, ONT), 推进纳米孔测序技术的转化. 除了α-HL, Mycobacterium smegmatis Porin A (MspA)也是一种具有高空间分辨率的孔道蛋白, 并且其结构特征更适合测序研究. 2008年, Butler等[27]构建工程化改造的MspA纳米孔检测体系, 实现了单碱基分辨率的DNA检测.
其次, DNA在限域传感区内的易位动力学是影响纳米孔测序时间分辨率的关键因素. 研究表明, 单链DNA在电泳驱动的穿孔过程中, 单个碱基在传感区的停留时间小于10 μs, 不足以产生可区分的阻塞电流[28]. 使用调控溶液粘度、增强DNA-孔道相互作用等方法控制DNA孔内易位动力学仍无法满足测序时间分辨率要求[23,29]. 解决这一问题的重要策略是将马达蛋白引入纳米孔测序体系. 这一策略最早在1998年提出[30], 直到2012年Gundlach课题组[31]将DNA聚合酶phi29引入突变型MspA纳米孔体系, 真正实现了基于马达蛋白的DNA控速, 使DNA在纳米孔内进行步进易位. 几乎同时, ONT也将马达蛋白控速策略引入纳米孔测序体系, 开发了测序平台MinION, 标志着纳米孔从实验室探索验证阶段走向商业化应用阶段.
今天, 研究人员从优化孔道结构、改进马达蛋白以及升级平台软硬件等层面不断优化纳米孔测序技术, 使其在基因组学、疾病诊断、微生物研究等领域展现出广阔的应用空间. 接下来, 本文将从围绕纳米孔单分子测序技术的核心层面进行阐述, 并探讨其内在联系及面临的潜在挑战.

3 基于纳米孔改造的测序空间分辨率优化

纳米孔具有能够“感知”碱基结构的限域传感区, 是实现单分子测序的基础, 而传感区的物理结构、化学基团则在空间维度决定其碱基识别的分辨率. 用于单分子测序的孔道蛋白可以分为外膜孔蛋白和成孔毒素蛋白. 外膜孔蛋白常见于革兰氏阴性菌和分歧杆菌外膜上, 负责控制膜渗透性[32-33]. 成孔毒素蛋白是一类由细菌分泌的毒素蛋白, 通过自组装在磷脂膜上形成纳米级别的孔道结构[34-36]. 用于测序研究的生物纳米孔主要包括: α-HL、Aerolysin、MspA、FraC和CsgG(图2和表1), 本文将对上述纳米孔的结构、工程化改造和测序研究展开描述.
图2 五种生物纳米孔的发现时间、结构与关键位点. 从左到右依次为α-HL、Aerolysin、MspA、FraC和CsgG纳米孔. 纳米孔蛋白质骨架以灰色表示, 关键突变位点范德华面表示, 传感区以绿色透明区域表示. 图中蛋白结构来自RCSB Protein Data Bank数据库. α-HL纳米孔是最早被应用于DNA单分子测量的生物纳米孔[24], 其传感区的空间分辨率能够区分嘌呤与吡啶片段. Aerolysin纳米孔具有类似于α-HL纳米孔的长且狭窄的传感区. 但相较于α-HL纳米孔, Aerolysin纳米孔的传感区内部具有更多的关键位点, 有利于构建多样的功能化孔道[60]. 相比于前两者, MspA纳米孔具有更短和更窄的单分子传感区, 在DNA测序方面表现出高分辨率优势[31]. FraC纳米孔特点是其跨膜域由α-螺旋而非β-桶构成, 具有可调的孔径[77]. CsgG纳米孔被开发应用于牛津纳米孔的商业化DNA测序平台, 其特点是可与CsgF形成CsgG-CsgF复合纳米孔[85], 该复合孔具有一个次级传感区域用以增强传感性能.

Figure 2 Discovery, structure, and key mutation sites of five biological nanopores. From left to right: schematic diagrams of the structure and key mutation sites of α-HL, Aerolysin, MspA, FraC, and CsgG nanopores. Protein backbones of these nanopores are shown in grey, amino acids at key mutation sites are shown as van der Waals surfaces, and the sensing regions are presented with Green transparent areas. Protein structures in the schematic diagram are from RCSB PDB database. α-HL nanopores are the earliest biological nanopores to be applied in DNA single-molecule measurement[24], and the spatial resolution of their sensing regions can distinguish between purine and pyridine fragments. Aerolysin nanopores have long and narrow sensing regions similar to α-HL nanopores. Compared with α-HL nanopores, the sensing regions of Aerolysin nanopores have more key sites, which is conducive to the construction of diverse functional channels[60]. Compared with the former two, MspA nanopores exhibit high-resolution advantages in DNA sequencing due to their shorter and narrower single-molecule sensing regions[31]. Frac nanopores are characterized by their α-helix-typed transmembrane domains rather than β-folding structures[77], which endows the Frac nanopores with tunable pore sizes. CsgG nanopores have been developed and applied to the commercial DNA sequencing platform of ONT. They can form CsgG-CsgF composite nanopores with CsgF[85], and this kind of composite nanopores has a secondary sensing region to enhance the sensing performance.

表1 五种生物纳米孔的结构信息表. 结构数据源于RCSB Protein Data Bank数据库(α-HL, PDB ID: 3ANZ; Aerolysin, PDB ID: 5JZH; MspA, PDB ID: 1UUN; FraC, PDB ID: 4TSY; CsgG, PDB ID: 4UV3)

Table 1 Structural information table of five types of biological nanopores. The structural data is originated from the RCSB Protein Data Bank database (α-HL, PDB ID: 3ANZ; Aerolysin, PDB ID: 5JZH; MspA, PDB ID: 1UUN; FraC, PDB ID: 4TSY; CsgG, PDB ID: 4UV3)

纳米孔 直径/nm 长度/nm 孔径/nm 来源
α-HL 10 10 1.4 Staphylococcus aureus
Aerolysin 16 10 1.8 Aeromonas hydrophila
MspA 8.8 9.6 1.2 Mycobacterium smegmatis
FraC 11 7.0 1.6 Actinia fragacea
CsgG 9.4 9.6 1.2 Escherichia coli

3.1 α-HL纳米孔

α-HL是一种由金黄色葡萄球菌分泌的β-桶状七聚体成孔毒素蛋白, 单体序列长度为293个氨基酸, 分子量为33.2 kDa[37-38]. 电生理学测量表明α-HL电导约为1 nS (－120 mV, 1 mol/L KCl, pH 7.5)[24,39]. 其结构由膜外的边缘结构域(直径约10 nm), 帽结构域和跨膜的茎结构域组成(总长度约10 nm). α-HL的茎结构域与帽结构域组成较大的前庭空腔结构, 该空腔结构长度为4.8 nm, 最小直径为2.6 nm. 茎结构域是一个反平行β-桶状结构的跨膜通道, 最小直径为1.4 nm, 长度约为5.0 nm. 在β-桶的跨膜区域, 亲水氨基酸残基指向孔道内部而疏水氨基酸残基指向脂双层[37]. 这个长且狭窄的β-桶构成了α-HL的传感区, 内部可以容纳大约10个核苷酸, 其中关键位点K110, E111, M113, K147形成直径为1.4 nm的收缩区, 为单分子传感位点[26,40-44].
α-HL在1996年被用于验证纳米孔测序的概念. 在这项研究中, 研究人员检测到单链DNA和RNA穿过纳米孔时产生的电流信号的变化, 并且初步实现对单链DNA长度的检测, 奠定了纳米孔单分子测序的基础[24,45]. 随后, Akeson等[25]对α-HL传感区的空间分辨率展开深入研究, 测量RNA在α-HL孔内易位的阻塞信号特征与持续时间, 以此区分RNA分子中嘌呤与吡啶片段. 进一步研究表明, α-HL针对特殊结构的单链DNA可展现出单碱基区分能力[26].
为进一步强化α-HL的单分子读取能力, 研究人员对α-HL进行工程化改造, 以此优化其孔道结构并提升其空间分辨率. 例如, Bayley等[46-47]通过构建工程化改造的α-HL对阳离子和小分子进行测量分析, 并提出了随机传感的概念. 在后续研究中, 他们进一步提出DNA-纳米孔杂合策略: 在α-HL的C17位点共价连接一段DNA, 借助该序列与待测DNA的特异性结合提高纳米孔对待测物的捕获效率, 以此实现对特定序列的分析[48]. 结构优化带来的性能提升驱动更大规模的α-HL突变体设计, 例如E111N/K147N (NN突变体)优化了传感区的电荷分布和空间分辨率, 使纳米孔对polyA和polyC展现出较高的识别能力; M113R与E111N突变体则通过消除孔口负电荷和增强孔内正电荷来提高DNA孔内易位效率, 减少碰撞事件发生(DNA被捕获但不进入传感区)[43,49-50]. 此外, 将β环糊精作为分子适配体引入α-HL显著提升了纳米孔的空间分辨率, 该复合体系成功分辨了固定化单链DNA中的单碱基替代[51-52]. 这种基于结构改造的空间分辨率优化策略进一步衍生出个性化的α-HL单分子测量平台, 如用于传感pH、重金属离子和小分子等的纳米孔平台[53-56].

3.2 Aerolysin纳米孔

Aerolysin是一种由格兰氏阴性嗜水气单胞菌分泌、具有β-桶结构的孔形成毒素, 于2006年被引入单分子测量领域[57]. Aerolysin前体为水溶性二聚体蛋白, 经酶切后形成具有424个氨基酸、分子量52 kDa的活性单体, 并在磷脂膜上形成七聚体跨膜通道. Aerolysin结构呈铆钉构型, 其β-桶结构由膜外帽状结构(直径约为16 nm)和长且狭窄的颈状结构(长度为10 nm)组成, 孔内位点(R220与K238)收缩形成传感区, 孔径约为1.8 nm. 同时, Aerolysin具有稳定的电生理学特性, 这些特点使其在单分子测量领域表现出极大的应用潜力[35,58-59]. 研究表明, Aerolysin内具有大量带电位点, 有利于调节孔道- DNA分子间的相互作用, 这也为测序研究提供了基础[60]. 此外, 通过N226Q/S228K突变可以在限域传感区内构建一个额外的收缩区, 这将进一步提升Aerolysin的空间分辨率[61-63].
2006年, Stefureac等[57]利用Aerolysin对一系列修饰性α螺旋肽进行区分, 研究其单分子测量能力. 2016年, 基于Aerolysin的单分子测量被拓展至单链DNA测序研究, 解析短序列单链DNA穿过Aerolysin所产生的阻塞电流特征[64]. 在此基础上, 他们使用Aerolysin对不同长度的均聚单链DNA进行了区分, 进一步证明Aerolysin纳米孔对四种碱基的分辨能力[65].
为进一步提升Aerolysin的空间分辨率, 研究人员对其开展了工程化改造和传感区结构优化研究. 研究表明, R220和K238位点不仅与传感灵敏度相关, 还会影响单链DNA在限域传感区的动态行为, 例如R220E突变会造成与单链DNA的静电排斥而阻碍其穿孔; K238E突变则通过阻碍单链DNA离开纳米孔使其穿孔速度降低20倍[61]. 进一步研究表明, K238G/K238Q突变能够优化Aerolysin传感区的空间分辨率, 对短链DNA的甲胞嘧啶、8-氧代鸟嘌呤和肌苷表现出良好的区分效果[66]. T232K/K238Q突变能够增强传感区与多肽的相互作用, 从而区分多肽不同位置的赖氨酸的乙酰化和甲基化[67]. 此外, 高空间分辨率的Aerolysin突变体也被应用于分析蛋白结构和折叠/去折叠动力学等, 为研究生物分子提供有力的单分子测量平台.

3.3 MspA纳米孔

与α-HL和Aerolysin纳米孔不同, MspA是一种具有短而窄传感区的生物纳米孔[32,68]. MspA是分枝杆菌外膜上的八聚体跨膜蛋白, 其单体序列长度为184个氨基酸, 分子量约为20 kDa, 在菌外膜上组装形成纳米孔道结构. MspA纳米孔可分为三个部分, 分别是外端的入口、中部的前庭和位于跨膜域的收缩区(最大直径约8.8 nm, 长度约9.6 nm). 入口和前庭区域最大孔径为4.8 nm, 长度为5.9 nm; 收缩区最小孔径约为1.2 nm, 长度仅为0.6 nm, 与单个碱基的尺寸相匹配. 同时, MspA具有极好的稳定性, 其从膜上提取后可以自发插入其他磷脂膜上形成纳米孔道, 并且在很宽的pH范围内以及表面活性剂存在的条件下维持孔道活性[69-70]. MspA单体的D90-D93位点位于收缩区最狭窄处, 对纳米孔空间分辨率产生直接影响. 此外, 这些位点为负电性天冬氨酸, 对单链DNA产生静电斥力, 阻碍其穿孔易位[71-73]. 因此, 定向突变MspA收缩区的天冬氨酸位点, 是实现基于MspA的单分子测序的前提条件.
2008~2010年, 工程化改造的MspA纳米孔MspA M1和MspA M2问世: M1型将收缩区的天冬氨酸突变为天冬酰胺, 改变了传感界面的电荷分布, 提高了传感区与DNA的相互作用; M2型在M1型的基础上将前庭区和入口处的负电氨基酸突变为正电氨基酸, 进一步提高了纳米孔的DNA捕获效率[27]. 这种突变策略极大优化了MspA与DNA分子的匹配度, 使其高空间分辨率特性能够更好地服务于碱基识别. 在此基础上, DNA聚合酶phi29被引入MspA M2体系, 使单链DNA以受控的方式穿孔并且产生可分辨的台阶信号, 首次实现了基于MspA M2的DNA测序[31]. 这一集成MspA M2和phi29的测序平台进一步实现了DNA甲基化修饰位点识别[74].
为满足个性化单分子测量需求, 研究人员开发了系列突变型MspA, 以此调控其空间分辨率, 实现对不同生物分子的传感分析. 例如基于MspA M2的异聚体设计策略将一个单体的90号位点突变为半胱氨酸并在其上修饰苯硼氨酸, 构建异聚体纳米孔, 以此缩小MspA M2传感区并增强其与RNA的相互作用, 实现了对RNA磷酸化和翻译后修饰的区分. 此外, 基于镍离子-次氮基三乙酸适配体的纳米孔修饰策略使MspA M2的传感区具有氨基酸敏感特性, 能够高效区分20种氨基酸及其翻译后修饰类型[54,72-76].

3.4 FraC纳米孔

除了以α-HL为代表的β-桶结构纳米孔外, 一系列由α-螺旋构成的纳米孔也具有传感分析DNA及生物肽的能力. 其中, 海葵的孔形成毒素FraC在生物单分子测量领域取得了重要研究进展[77-83]. FraC属于放线孔素蛋白家族, 其单体序列长度为179个氨基酸, 分子量约为20 kDa[14]. FraC单体可以在含有鞘磷脂的脂质膜上自组装形成八聚体纳米孔道(最大直径约11 nm, 长度约7.0 nm). 与β-桶纳米孔不同, FraC跨膜域的孔道结构由α-螺旋构成(孔径为1.6 nm), 其限域传感区位于D10位点周围. FraC的孔道入口则由β-sheet组成(直径为6.5 nm), 在孔内部存在大量负电性氨基酸位点(如D10、D17、E24)[79,84]. 这种电荷分布不利于DNA孔内易位, 因此野生型FraC纳米孔无法直接用于单链DNA检测.
针对这一问题, 研究人员发展了系列基于工程化改造的FraC纳米孔, 从电荷分布和传感区优化两方面来提升FraC的空间分辨率. 以D10R/K159E双突变型ReFraC纳米孔为例, D10R突变能够有效降低纳米孔对DNA的静电排斥; K159E则可以平衡D10R突变对空间分辨率的影响, 以此提高纳米孔对均聚核苷酸的捕获和识别能力[84]. 此外, ReFraC纳米孔也被用于区分不同分子量的生物标签[79]. 基于突变的纳米孔改造策略也赋予FraC以可调的空间分辨率, 例如突变外环与脂质相互作用界面的关键位点W112和W116, 可以在0.84~1.1 nm范围内调控FraC传感区直径, 使其可以分辨分子量差异仅为44 Da的多肽链[78]. 此外, 通过在FraC传感区域附近引入芳香性氨基酸(例如G13F突变), 可以增强孔道与特定多肽的相互作用, 提高其对该多肽的检测能力[80].

3.5 CsgG纳米孔

CsgG纳米孔是一种源于大肠杆菌的Curli纤维亚基的分泌通道, 由分子量约35 kDa的单体组装而成的九聚体(最大直径约9.4 nm, 长度约9.6 nm). CsgG具有冠状外形, 跨膜域由β-桶组成, 形成一个直径约为4 nm的孔道, 孔道中心包含一个直径为1.2 nm的收缩区. 该收缩区由位点Y51, N55和F56参与形成, 长度约为1.5 nm, 是CsgG的核心传感区. CsgG的突出特点在于其可以与CsgF组装形成CsgG-CsgF复合纳米孔. 在组装过程中, CsgG-CsgF形成一个额外的收缩区, 该区域由CsgF蛋白的N17位点构成, 孔径约为1.5 nm. 研究表明, CsgG-CsgF的额外收缩区可以通过约束单链DNA构像进行重复读取, 进而提升碱基识别的准确度[85].
CsgG纳米孔具有适宜DNA测序的结构属性, 然而其孔道电导过低, 导致测序信号信噪比难以提升. 研究表明, CsgG的F56Q突变能够有效提高孔道电导, 这为其在单分子测序中的应用奠定基础[86]. 为进一步优化CsgG的空间分辨率和测序性能, 研究人员构建了4000余个工程化改造的CsgG纳米孔, 通过调整孔道尺寸、电荷分布、亲疏水性等筛选能够实现转化的CsgG纳米孔. 基于上述研究, ONT先后发展了基于CsgG突变体的R9测序平台和基于CsgG-CsgF复合纳米孔的R10测序平台, 后者具有双重收缩区和更高的空间分辨率, 在纳米孔测序技术的实际应用中发挥重要作用.
综上所述, 对纳米孔的限域传感区进行突变改造是提升测序空间分辨率的重要手段, 特别是对关键碱基敏感位点的突变极大提升了纳米孔对DNA单分子信息的读取能力. 然而纳米孔测序空间分辨率的提升还依赖于孔内的电荷分布、传感区长度等因素, 如何在增强孔道敏感位点与DNA相互作用的同时, 进一步改善孔内电荷特性、优化传感区长度, 以此进一步提升纳米孔的测序空间分辨率, 是纳米孔工程化改造面临的重要问题. 除了纳米孔单分子测序的空间分辨率, DNA在孔道传感区的运动方式和停留时间决定其与纳米孔在单分子水平相互作用的“时间窗口”, 这也是影响碱基识别能力和测序准确性的关键因素.

4 基于马达蛋白的测序时间分辨率控制

在早期纳米孔测序研究中, 单链DNA在电泳力作用下直接通过纳米孔, 这种不可控的驱动模式会导致DNA穿孔时间过短(1.5~10 μs/碱基)和易位行为不均匀[23]. 而为了检测不同碱基产生的pA级的信号差异, 则需要碱基在传感区内停留更长时间. 因此, 控制DNA孔内易位孔动力学, 在时间维度优化碱基识别分辨率是纳米孔测序面临的一个关键科学问题.
针对这一问题, 早期的研究工作聚焦于通过工程化改造生物纳米孔和优化测序溶液环境的化学条件, 通过调控DNA易位过程中的作用力降低DNA穿孔速率. 例如, Bhattacharya等[29]利用分子动力学模拟揭示了MspA的A96、L88、S116等一系列位点的正电突变可将DNA易位速率降低10~30倍. 同时, 调控纳米孔内的电渗流和溶液粘度, 也能在一定程度上减小DNA穿孔速率[49,87-90]. 然而, 上述方法依然无法精确控制DNA分子的穿孔动力学. 解决这一问题的重要策略是将马达蛋白(例如DNA聚合酶phi29和解旋酶Hel308)引入纳米孔体系, 使得DNA以棘轮式的运动模式完成孔内易位过程. 该策略的基本原理是: 在测序过程中, 酶与待测DNA形成复合物, 复合物中的酶由于无法通过纳米孔, 会停留在孔道的cis侧, 并通过棘轮运动使得待测单链DNA以步进的方式易位, 从而精准控制DNA分子孔内易位动力学, 在时间维度提升纳米孔对碱基的识别能力[23,31,86,91].

4.1 DNA聚合酶phi29

1998年提交的一份专利中阐述了利用马达蛋白实现DNA穿孔动力学控制的构想[29]. 2007年, Benner等[48]使用Klenow片段和大肠杆菌核酸外切酶1在α-HL纳米孔上展开研究, 发现核酸外切酶能够显著降低单链DNA在α-HL中的易位速度. 随后, A家族DNA聚合酶引入α-HL纳米孔体系, 观测到引物链以单核苷酸为步长的易位过程. 然而这类酶在电场作用下过早与DNA解离, 无法驱动DNA在纳米孔内的步进式棘轮运动[92-93]. DNA聚合酶phi29是第一个被发现能够驱动单链DNA在纳米孔内步进式易位的马达蛋白. Phi29属于B家族DNA聚合酶, 利用DNA模板链和dNTPs以5'至3'方向催化双链DNA的合成. 其结构包含两个主要的球状结构域: 一个具有3'至5'外切酶活性的N端结构域, 负责校对; 一个较大的C端结构域, 此结构域包含了经典的DNA聚合酶共有的亚结构域, 即“手指”(fingers)、“手掌”(palm)和“拇指”(thumb)亚结构域. 值得注意的是, phi29 DNA聚合酶还包含两个额外的亚结构域TPR1和TPR2, 其在持续链合成和链置换方面发挥重要作用[31,94-96].
研究表明, phi29在引入纳米孔体系后, 能够与单链DNA形成稳定的复合物phi29-DNA, 这种复合物能稳定保持在α-HL纳米孔端口, 其维持时间是Klenow-DNA复合物的10000倍[94]. 基于此, Schreiber等[95]进一步实现了使用phi29酶控制单链DNA以单核苷酸的步长穿过纳米孔(图3a). 由于phi29酶控速下DNA链的棘轮运动存在固有随机性并造成DNA往返运动, 使得部分碱基被反复读取并导致了24%的插入或者删除错误[96]. 随后, Gundlach课题组[31]将phi29与MspA M2相结合, 并设计一段与待测链配对的终止链, 保证phi29不会提前开始催化聚合反应, 以此精准控制DNA孔内易位动力学, 显著提高碱基识别的时间分辨率. 基于该项研究, 他们在2014年使用MspA M2纳米孔和phi29马达蛋白实现了对自然DNA链的测序: 在控速作用下, MspA M2体系实现对噬菌体phi X 174基因组的单分子测序, 测序结果与参考序列相匹配[97].
图3 马达蛋白调控DNA孔内易位动力学示意图. MspA纳米孔以蓝色表示, 马达蛋白以黄色表示. (a) phi29控速机制及特点: 通过聚合反应, phi29在合成DNA双链的同时将待测DNA单链步进牵引穿过纳米孔. 箭头指示待测DNA的运动方向. (b) Hel308控速机制及特点: 通过ATP水解循环, Hel308步进解开DNA双螺旋, 使得待测DNA步进易位穿过纳米孔. 箭头指示待测DNA链的运动方向.

Figure 3 Schematic diagram of motor proteins controlling the kinetics of DNA translocation within nanopores. MspA nanopores are presented in blue, and motor proteins are shown in yellow. (a) phi29 speed control mechanism and characteristics: Through polymerization reaction, phi29 gradually pulls the single strand of the DNA translocating through the nanopore while synthesizing the double strands of DNA. The arrow indicates the movement direction of the DNA. (b) Hel308 speed control mechanism and characteristics: Through the ATP hydrolysis cycle, Hel308 step by step unties the DNA double helix, allowing the DNA translocation in the nanopore. The arrow indicates the movement direction of the DNA.

4.2 DNA解旋酶Hel308

在建立MspA M2-phi29纳米孔测序体系的基础上, 研究人员进一步探究DNA解旋酶用于调控DNA孔内易位动力学的可行性. DNA解旋酶Hel308于2016年被引入纳米孔测序研究中[91]. Hel308属于DNA解旋酶超家族2, 可沿3'至5'方向解开双链DNA, 其核心结构是两个负责结合并催化ATP水解的RecA样结构域. ATP在两个RecA结构域间的动态循环会改变结构域间的距离, 在每个ATP循环中Hel308驱动DNA步进一个碱基. 2017年, Craig等[98]开发了单分子pm级分辨率纳米孔镊子技术(SPRNT), 并以MspA-M2为平台研究Hel308的运作机制. 在该项研究中, 他们观察到Hel308的ATP水解循环包含两个可分辨的、步进半个碱基的亚步骤, 同时观测DNA以单碱基为步长的孔内易位(图3b). 进一步, 他们使用SPRNT技术深入研究Hel308的序列依赖行为和回退行为, 揭示了DNA在Hel308酶作用下的运动模式, 为发展基于Hel308的DNA孔内易位控速策略和优化测序时间分辨率提供全新手段[99-101].
相较于聚合酶phi29, 解旋酶Hel308可以在不进行核苷酸聚合时可逆地解开DNA双螺旋, 还可以在DNA链上的多个位置结合, 这些特性使其更有利于优化测序时间分辨率和实现长读长测序[86]. 近年来, 研究人员也探索了数种不同的解旋酶, 例如ATP驱动解旋酶DDa (SF1B解旋酶家族)的突变体, 在其ATP水解循环中DDa沿5'至3'的方向解旋DNA双螺旋并驱动单链DNA的步进式穿孔. 对于纳米孔单分子测序体系, 马达蛋白的引入为控制DNA易位动力学提供了有效手段, 在时间维度上优化了纳米孔对碱基的识别能力.
无论是纳米孔的工程化改造还是基于马达蛋白的DNA控速策略, 其目的都是提升单分子测量的碱基分辨能力, 从时-空维度提高测序准确率. 尽管两种DNA限速酶的应用被认为是完成纳米孔单分子测序蓝图的最后两块拼图, 多个纳米孔体系的测序准确率仍有待提升, 这也是单分子测量所面临的共性问题, 即通过优化限域测量的时-空分辨率实现单分子信息的精准读取. 因此, 进一步发展基于马达蛋白的DNA控速策略, 特别是以本征结构和生物物理属性为出发点来改造马达蛋白、调控DNA孔内易位动力学, 是优化测序时间分辨率的重要方向. 同时, 时间分辨率的控制也要与空间分辨率的提升相“耦合”, 充分发挥二者在提高测序准确性方面的互补优势. 此外, 马达蛋白对DNA孔内易位的控制是以牺牲测序速度为代价, 如何在保证足够时-空分辨率和准确性的基础上尽可能提升测序效率, 这不仅依赖于纳米孔、马达蛋白的高效协作, 还与纳米孔测序系统设计和测序流程密切相关.

5 纳米孔DNA测序系统及应用

5.1 纳米孔测序系统降噪策略

在基于纳米孔的DNA单分子测序中, 孔道开孔电流处于100 pA级, 单链DNA孔内易位所产生的电流阻塞幅度在10 pA级, 阻塞持续时间从μs到ms不等, 这种微弱、高速的电流变化需要纳米孔测序系统实现高灵敏、高带宽的信号采集. 然而由于系统噪声的存在, 一方面需要对信号进行低通滤波以提高信噪比; 另一方面DNA易位的高频特征可能会损失, 因此需要明确系统噪声来源并对其进行降噪处理. 纳米孔测序系统噪声可分为低频闪烁噪声(<0.1 kHz)、中频热噪声(0.1~2 kHz)和高频电容噪声(>2 kHz). 其中, 低频噪声与高频噪声在系统噪声中占据主导地位[102-105], 前者主要源于纳米孔门控行为和孔内基团质子化等过程; 后者主要源于传感电路噪声和体系寄生电容噪声. 低频噪声的降噪主要依赖于测序环境的优化, 包括调节溶液环境和优化纳米孔结构等手段[106-109]. 而高频噪声的降噪则需要严格的系统硬件设计. 首先, 将微电流传感器与运算放大器进行集成化设计是降低系统噪声的重要策略. 其中微电流传感器具有降噪和信号补充模块, 运算放大器则通过跨阻放大法(如HEKA公司的EPC10)和电流积分-微分法(如Molecular Device公司的Axopatch 200B)将微电流转换为电压信号[110]. 其中基于反馈电容进行信号放大的Axopatch 200B还具有高带宽(100 kHz)和低噪声(0.13 pA RMS, 10 kHz)特点, 在纳米孔测序研究中应用广泛. 其次, 将纳米孔体系与电测量体系进行一体化设计能够有效减小系统的寄生电容. 为此, 基于芯片集成(in-chip)架构的系统设计策略被提出: 通过CMOS (complementary metal oxide Semiconductor, 互补金属氧化物半导体)集成电路工艺, 将纳米孔测序体系和测量放大电路集成在一个芯片上, 以此增强系统的降噪性能(高信噪比, >5)和信息读取能力(高带宽, 1 MHz)[111-113].

5.2 纳米孔高通量测序

在提高测序性能的基础上, 纳米孔测序系统还需要提升测序效率. 在目前的时-空分辨率条件下, 实施并行高通量的DNA单分子测量是提升测序效率的主要手段. 为此, 不仅需要设计支持多孔道并行工作的流体槽结构, 还需要开发用于高通量、高带宽信号读取的集成电路芯片. 针对纳米孔测序技术特点, 目前已发展出相应的ASIC (application specific integrated circuit)芯片和flow cell流通池, 二者的in-chip构建为实现纳米孔高通量测序提供了途径. ASIC芯片高度集成纳米孔多路控制、微电流并行读取和数据批量处理等功能[114-115]; flow cell流通池则从支持512个通道并行工作发展至最多支持3000个通道并行测序的高通量微流体系统[116-117]. 以ONT开发的MinION测序仪为例, 其flow cell流通池包含512个通道, 每个通道则装配4个被微流腔室隔离的独立纳米孔, 每个纳米孔产生的电流信号由ASIC芯片依次读取. 测序前, MinION调用Mux程序对通道内各纳米孔的传感性能进行测试和排序. 测序过程中, 系统优先从性能最佳的纳米孔中获取测序数据. 随后再从其他3个孔内读取数据, 通过数据的综合分析获取序列信息. 这种并行高通量运作的系统设计为提升纳米孔测序效率和准确率奠定了硬件基础[118].
配合高通量测序系统的设计, 纳米孔测序流程也需要进行相应改进. 现有的商业化测序流程将多核苷酸接头引入测序步骤, 使DNA分子首先与多核苷酸接头结合, 以此加速DNA-马达蛋白复合物的形成并提高纳米孔对复合物的捕获效率. 后续的DNA序列读取流程可分为以下三种: 1D、2D和1D2[119]. 1D流程要求DNA模板链和互补链并行穿孔易位, 通过读取信息的相互校验来提高测序准确性. 2D流程则用发卡结构将DNA模板链和互补链相连接, 以此进行串行测序. 1D2流程则在模板链和互补链分别接上多核苷酸接头后, 进行重复测序. 目前应用最为广泛的测序模式为1D, 该策略也被证明具有较高的准确率和测序效率.

5.3 碱基识别算法

在构建高时-空分辨率纳米孔和高通量测序平台基础上, 如何解码电流信号并从中精准读取碱基信息, 是实现纳米孔测序的关键挑战之一. 碱基识别(Base calling)是将测序原始信号转换成核苷酸序列的过程, 碱基识别算法则根据电流信号变化特征(均值、标准差和持续时间等)分析序列信息[120-121]. 伴随纳米孔测序发展, 碱基识别算法也从早期的隐式马尔科夫模型(HMM)发展为神经网络模型, 单次测序准确率从70%提升至97%. HMM法以信号分段为基础, 将原始信号分割为多个片段(k-mers), 而序列信息则隐藏在片段的事件(events)数据中. HMM法利用马尔科夫模型对具有依赖关系的相邻事件进行建模, 结合k-mer统计分布和维特比算法进行碱基识别, 代表性碱基识别算法为Metrichor和Nanocall, 单次测序准确率为约70%至约85%[122-123]. 随后神经网络模型也被应用于碱基识别算法以提高测序准确性, 代表性碱基识别算法为Nanonet和DeepNano[124-125]. 二者通过递归神经网络观察事件之间的依赖关系, 提取高维度k-mers特征, 然后利用事件特征进行碱基识别, 在多个测试场景中准确率可达85%以上.
然而对原始数据进行片段分割本身就会带来识别错误, 对事件特征进行提取也会在一定程度上造成信息损失. 为此, 随后发展的碱基识别算法舍弃信号分割和事件输入, 而是直接从原始信号中读取碱基信息, 代表性算法为ONT开发的Guppy和独立团队研发的Chiron、CausalCall. Chiron利用复合神经网络(卷积神经网络、递归神经网络和连接时间分类器)直接对原始测序信号进行建模, 卷积网络提取信号序列中的局部模式, 递归神经网络根据局部模式对每个序列位点预测碱基概率, 时间分类器则根据碱基概率利用束搜索算法计算DNA序列[126]. CausalCall是一种端到端的基于时间卷积深度神经网络的快速碱基识别算法, 其结合了时间卷积网络和连接时间分类器直接从原始电流信号识别出不同长度的碱基序列. 测序测试表明, 这类基于原始电流信号的碱基识别算法显著提升了测序准确率(大于95%), 相比于Chiron, CausalCall的基于时间卷积的矩阵计算策略则能进一步提高碱基识别速度[127].
伴随纳米孔时-空分辨率的提升和单分子测量技术的革新, 纳米孔测序系统构架和碱基识别算法也将迎来新的发展. 多层纳米孔或生物-固体杂化纳米孔设计、马达蛋白的生物物理学改造、单分子反复捕捉和信息重复读取等有望突破目前纳米孔时-空分辨率阈值, 同时也将推动测序系统构架的变革(如引入多回路反馈、自适应控制等构架)和碱基识别算法的进步(如图神经网络、物理信息神经网络和迁移学习模型等的有机结合)(图4). 这种多维度的技术创新必将协同驱动纳米孔单分子测序技术的进步, 拓展其在科研、医疗、卫生等领域的应用空间.
图4 影响纳米孔单分子平台的测序准确性和测序效率的关键因素, 包括: 基于纳米孔结构改造的测序空间分辨率优化(正上, 突变型CytK纳米孔, 蛋白结构数据来自RCSB PDB网站 https://www.rcsb.org)、基于马达蛋白的DNA易位动力学控制及测序时间分辨率优化(左中, phi29聚合酶-DNA复合物, 结构数据来自Alamy网站 https://www.alamy.com)、碱基识别算法及测序程序(右中, base calling算法流程示意图)、基于多通道流体槽并行工作的高通量测序技术(左下, 高通量测序系统示意图)、基于in-chip构架的集成化测序系统(右下, 集成化纳米孔测序平台示意图).

Figure 4 The key factors affecting the sequencing accuracy and efficiency of nanopore single-molecule platforms include: Sequencing spatial resolution optimization based on nanopore structure modification (top, mutant CytK nanopore, protein structure data from RCSB PDB website, https://www.rcsb.org), DNA translocation dynamics control and sequencing time resolution optimization based on motor proteins (middle left, phi29 polymerase-DNA complex, structural model data from Alamy website, https://www.alamy.com), base calling algorithm and sequencing program (middle right, schematic diagram of base calling algorithm flow), high-throughput sequencing technology based on the parallel operation of multi-channel fluid channels (lower left, high-throughput sequencing system schematic diagram) and integrated sequencing system based on in-chip architecture (lower right, integrated nanopore sequencing platform).

5.4 纳米孔测序技术的应用

伴随纳米孔单分子测序技术的蓬勃发展, 其在诸多领域都展现出巨大的应用价值(图5). 在科学研究方面, 纳米孔测序技术推动基因组学、转录组学和表观遗传学的发展和助力重要研究成果的产生[128]. 例如, 纳米孔测序技术已成功闭合人类参考基因组中的12个间隙(每个间隙>50 kb)、快速读取人类端粒重复序列长度和解析人类Y染色体的着丝粒区域序列[129-130]. 除人类基因, 纳米孔测序技术也用于闭合多种模式生物(如大肠杆菌、果蝇等)和非模式生物(如克氏锥虫)的基因组间隙[131-133]. 值得注意的是, 纳米孔测序技术的长读长特性在建立非模式生物参考基因组上展现出巨大优势, 已成功建立墨瑞鳕、小丑鱼、科莫多巨蜥等生物的参考基因组[134-137]. 得益于其直接测序RNA的能力, 纳米孔测序技术绘制了一系列RNA病毒的基因谱, 如马雅罗病毒、寨卡病毒等[119]. 同时, 纳米孔测序技术也被广泛用于RNA测序和表观遗传学中, 例如人源和鼠源B细胞的转录组测序、多种属mRNA的poly(A)尾长度测定、DNA修饰(6mA、5mC和5hmC)的识别等[138-141].
图5 纳米孔DNA测序技术应用场景, 包括: 基因组学、精准医学与疫情监测和实时实地测序. 基因组学研究示意图及新型冠状病毒序列示意图分别引用自参考文献[137]、[143]并获得许可. 空间站测序示意图来自网站新闻图片(www.nasaspaceflight.com).

Figure 5 The application scenarios of nanopore DNA sequencing technology include: genomics research, precision medicine and epidemic supervision, and real-time on-site sequencing. The schematic diagrams of genomic research and the sequence diagrams of the novel coronavirus are respectively cited from references [137] and [143] and have been granted permission. The schematic diagram of the space station's sequencing is from the news photo at www.nasaspaceflight.com.

在疫情防控方面, 纳米孔测序因其技术优势发挥了重要作用. 在新冠疫情期间, 纳米孔测序技术通过cDNA测序和直接RNA测序建立新冠病毒的全长基因组, 这为深入理解新冠病毒生物学特性、致病能力和进化方向提供了重要信息[142-143]. 同时, 具有实时、高通量特性的纳米孔测序技术也对新冠疫情期间的感染监测、疫情控制、快速响应、流行病学研究和治疗策略制定等做出突出贡献. 据统计, 疫情期间全球的新冠病毒核酸检测中有约25%来自于ONT纳米孔测序平台, 这些核酸检测结果不仅用于疫情监测, 也为鉴定感染类型、发现病毒基因突变等提供了重要的数据支持[143-146]. 此外, 纳米孔测序平台也被应用于监测几内亚埃博拉病毒疫情、巴西寨卡病毒和登革病毒疫情[147-149], 在传播风险评估、病毒变异确定和治疗靶点筛选等方面起到了积极作用.
在医疗领域, 纳米孔测序技术为多种疾病诊断和个性化治疗方案制定提供了有力手段. 纳米孔测序技术通过对基因组致病位点(如p53、BRCA1、p16等)突变情况的快速检测为癌症诊断提供重要信息, 目前已应用于多种高发性癌症的筛查, 如血癌、乳腺癌和胰腺癌等[150-152]. 对于遗传疾病, 纳米孔测序技术则展现出更为广阔的应用空间. 对于一些由基因突变、染色体异常引起的疾病(如自闭症、帕金森病和免疫失调类疾病等)[153-155], 纳米孔测序能够快速定位不同个体的致病基因, 不仅为遗传病诊断提供关键信息, 也为治疗靶点的确定提供准确依据.
在现场实时测序场景下, 纳米孔测序作为一种单分子生物物理学测量技术能够在复杂、极端环境下完成测序工作. 除在疫情中用于实时监测, 纳米孔测序平台也用于环境微生物测序, 以此表征环境污染情况. 例如基于纳米孔测序平台的水源感染性微生物种类评估、农作物病毒感染的现场实时监测等[156]. 2016年, ONT测序系统成功地在国际空间站内实现了病毒以及老鼠基因的测序, 并与地面结果取得一致结果. 在未来, 纳米孔测序平台有望在火星和月球等微重力、高辐射环境下进行现场测序[157], 这将进一步拓展纳米孔测序技术的应用空间.

6 总结与展望

历经近四十年, 纳米孔DNA测序从概念提出发展到实际应用, 凭借其超长读长、简易流程和灵活便捷等特点受到了市场的广泛关注. 目前相对成熟的纳米孔单分子测序系统来自于ONT, 包括MinION、GridION和PromethION等多种类型、尺寸的测序仪. 近年来, 我国研发的纳米孔单分子测序仪也焕发出巨大的市场竞争力, 包括华大智造CycloneSEQ系列测序仪、普译生物PolyseqOne测序仪、齐碳科技Qnome、QPursue系列测序仪和安序源AXP100测序仪等. 这些纳米孔测序仪在长读长、实时性和稳定性方面接近国际领先水平, 而在数据吞吐量、测序通量和测序效率等方面各具特性, 因此适用于不同的测序场景(表2)[19,158], 在组学研究、病原检测和临床诊断等方面具有广阔的应用空间.
表2 近三年我国企业研发的纳米孔单分子测序仪仪器信息表. CycloneSEQ-WT02发布于2024年9月, PolyseqOne发布于2024年1月, QNome-3841hex发布于2022年6月, QPursue-6khex发布于2023年8月, AXP100发布于2023年5月.

Table 2 Information table of nanopore single-molecule sequencers developed by Chinese enterprises in the past three years. CycloneSEQ-WT02 was released in September 2024, PolyseqOne in January 2024, QNome-3841hex in June 2022, QPursue-6khex in August 2023, and AXP100 in May 2023.

公司 测序仪 读长 吞吐量 准确率 应用举例
华大智造 CycloneSEQ-WT02 Mb 50 Gb×2 97% 病原检测
普译生物 PolyseqOne 200 kb 20 Gb 97% 环境测序
齐碳科技 QNome-3841hex Mb 5 Gb×6 90% 组学研究
QPursue-6khex Mb 60 Gb×6 97% 临床诊断
安序源 AXP100 100 kb 100 Gb 99% 基因筛查
尽管如此, 目前纳米孔测序仪的单碱基错误率分布在1%~10%, 如何提升测序准确性, 仍是纳米孔单分子测序技术面临的重要挑战[159]. 首先, 纳米孔结构的优化与变革, 如纳米孔结构的合理改造、多层纳米孔的精准构建等, 将促进纳米孔测序空间分辨率的提高; 其次, DNA孔内易位控速方法的改进与创新, 如马达蛋白的生物物理学改造和运作模式改进, 将深化纳米孔测序时间分辨率的优化; 再次, 软硬件技术的迭代与发展, 如芯片集成化水平的提高、微流控技术的进步、人工智能与测序算法的融合等, 将赋能测序系统的性能提升. 上述技术策略的有机结合有望进一步提升测序准确性, 驱动纳米孔单分子测序平台的发展并为其开辟更为广阔的应用前景. 纳米孔单分子测序技术正在组学研究、精准医疗、公共卫生和环境保护等领域发挥重要作用, 也正为这些领域带来技术变革. 纳米孔测序技术的下一个目标是实现单分子水平的蛋白质测序, 推动蛋白质组学的进步[86,160]. 在全长基因组测序、特定基因片段读取和基因修饰识别等方面, 纳米孔测序技术展现出独特优势, 将序列特征、疾病类型、治疗靶点建立联系, 这将进一步赋能精准医疗的发展. 同时, 结合其高通量和实时检测优势, 纳米孔测序平台有望在个体健康管理、环境污染监测和食品安全评估等领域发挥更重要的作用.
(Cheng, B.)

参考文献

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