资源化学是一门探索和利用自然资源中化学物质的学科. 它通过从植物、矿物及微生物等自然界的丰富资源中提取、分析和改造化学物质, 推动了众多领域的发展[1]. 在新药研发过程中, 资源化学发挥了不可替代的作用, 发现天然来源的生物活性化合物, 成为许多药物开发的基础. 例如, 青蒿素是从植物中分离的天然产物, 并成为了抗疟药物研发的突破点[2]. 吲哚咔唑类天然产物因其独特的结构和广泛的生物活性备受关注. 1977年, 吲哚咔唑类天然产物十字孢碱(staurosporine, STA)被从放线菌的次级代谢产物中分离出来, 是首个获得的[2,3-a]吲哚咔唑生物碱[3], 其对肿瘤细胞和蛋白激酶C具有强抑制活性, 而且也有抗真菌活性[4-5], 但由于其毒性过强未能开发为药物. 然而, 十字孢碱仍被视作重要的先导化合物. 以十字孢碱为模板, 通过结构修饰获得的3'-N-苯甲酰基十字孢碱, 最终被开发为具有临床治疗作用的抗肿瘤药物米哚妥林(Midostaurin), 该药物于2017年获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准, 用于治疗急性髓细胞性白血病(AML)[6].
我们课题组专注于海洋放线菌资源化学的研究[7-9], 重点探索吲哚咔唑类生物碱[10-16]和浅蓝霉素类生物 碱[17-23]的结构多样性及其生物活性. 为拓展吲哚咔唑生物碱的化学空间, 我们利用其在λmax 290 nm附近尖锐的特征紫外吸收为标准, 筛选出吲哚咔唑生物碱的新产生菌. 其中, 海洋来源的链霉菌OUCMDZ-5522富产以十字孢碱为代表的吲哚咔唑生物碱. 通过对该菌株的大规模发酵, 从其发酵产物中分离并鉴定了11个吲哚咔唑生物碱(1~11, 图1). 对于无法通过常规手段确定其绝对构型的化合物, 我们通过化学转化十字孢碱为相应的天然产物加以确认. 在对9株人体致病菌、7株水产致病菌和1株农业致病菌的抑制活性测试中, 发现化合物1对迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、化合物6对创伤弧菌(Vibrio vulnificus)以及化合物9对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)具有抑菌活性, 而化合物10对创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)显示出抑菌活性, 最小抑菌浓度(MIC)值均为32 μg•mL－1.
1 结果与讨论
1.1 菌株鉴定
将菌株OUCMDZ-5522的16S rDNA序列上传至NCBI GenBank(登录号PQ479231), 通过BLAST比对GenBank中的菌株基因序列, 利用软件MEGA4构建系统发育树(图2). 结果显示其亲缘关系接近的均为链霉菌属(Streptomyces), 故鉴定菌株OUCMDZ-5522为链霉菌(Streptomyces sp.).
1.2 化合物的结构鉴定
新化合物1为黄色油状物, HRMS (ESI)在m/z 522.1770显示出分子离子峰[M－H]－ (calcd 522.1782), 提示其分子式为C29H25N5O5. 其在λmax 291.8 nm处的紫外吸收与7-氧代十字孢碱(3)相似, 提示其为吲哚咔唑生物碱[24], 但分子组成比化合物3多1个CHNO. 详细对比后发现, 两者之间的NMR数据极为相似(表1与2), 但化合物1比化合物3多1个羰基碳信号(δC 158.9)和1个伯氨基信号(δH 6.02), 推测其可能链接为氨基酰基片段. 此外, 糖环部分C-3'、C-4'和C-5'的碳信号发生明显位移(位移值δ依次为－4.9、＋4.7和＋1.9). 多键异核相关谱(HMBC)显示关键的远程H→C相关, 即CH3N-3'氢信号(δH 2.63)与δC 158.9的羰基碳和C-3' (δC 48.5)相关(表1、图3), 并且, NOESY谱显示了CH3N-3'氢信号(δH 2.63)与伯氨基氢信号(δH 6.02)的远程相关, 这些数据表明化合物1为化合物3的N-3'氨基酰基取代衍生物(图1). NOESY谱还显示H-1'与H-3'、H-3'与H-6'以及H-4'与H-11的远程相关, 提示其相对构型与化合物3和4相同. 此外, 化合物1展现出与十字孢碱(4)类似的电子圆二色谱(ECD) Cotton效应, 表明其绝对构型相同[4]. 为了进一步确定化合物1的绝对构型, 本工作通过3'-N的氨甲酰化以及7-氧化反应, 将十字孢碱(4)转化为化合物1(两步反应总收率为57.1%)(Scheme 1). 手性柱的LC-MS混合针分析(图4)以及核磁共振分析, 两者具有相同的保留时间和NMR数据, 表明合成化合物1与分离化合物1为同一化合物, 因此确认了化合物1的结构.
表1 化合物1的1H NMR (600 MHz)和13C NMR (150 MHz)数据(DMSO-d6)Table 1 1H NMR (600 MHz) and 13C NMR (150 MHz) sata for compound 1 (DMSO-d6) |
| Position | δC (type) | δH (mult. J in Hz) | COSY | HMBC | NOESY |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 109.9 (CH) | 7.75 (d, 8.2) | 2 | 3, 4a | |
| 2 | 127.2 (CH) | 7.61 (t, 7.4) | 1, 3 | 4, 13a | |
| 3 | 120.7 (CH) | 7.43 (t, 7.8) | 2, 4 | 1, 4a | |
| 4 | 124.9 (CH) | 9.07 (d, 8.1) | 3 | 2, 4b, 13a | |
| 4a | 121.4 (C) | ||||
| 4b | 115.2 (C) | ||||
| 4c | 119.5 (C) | ||||
| 5 | 171.2 (C) | ||||
| 6 | — | 11.1 (s) | 4c | ||
| 7 | 170.9 (C) | ||||
| 7a | 120.9 (C) | ||||
| 7b | 116.1 (C) | ||||
| 7c | 122.8 (C) | ||||
| 8 | 124.9 (CH) | 9.25 (d, 7.9) | 9 | 10, 7b, 11a | 10 |
| 9 | 120.6 (CH) | 7.39 (t, 7.3) | 8, 10 | 11, 7c | |
| 10 | 126.9 (CH) | 7.56 (t, 7.8) | 9, 11 | 8, 11a | 8 |
| 11 | 113.7 (CH) | 7.71 (d, 8.1) | 10 | 9, 7c | |
| 11a | 139.9 (C) | ||||
| 12a | 130.5 (C) | ||||
| 12b | 128.8 (C) | ||||
| 13a | 137.7 (C) | ||||
| 1' | 82.6 (CH) | 7.03 (td, 5.8, 2.1) | 2' | 12b 13a, 5' | 3' |
| 2' | 27.4 (CH2) | 2.68~2.71 (m); 2.22 (td, 5.8, 12.8) | 1', 3' | 3', 4' | |
| 3' | 48.3 (CH) | 4.85 (d, 12.8) | 2', 4' | 4' | 1', 6' |
| 4' | 84.0 (CH) | 4.22 (d, 3.0) | 3' | 2', 6', 4'-OCH3 | 11 |
| 5' | 95.2 (C) | ||||
| 6' | 29.2 (CH3) | 2.35 (s) | 4' | 3' | |
| 3'-NCH3 | 30.2 (CH3) | 2.63 (s) | 3', 3'-NCO | ||
| 4'-OCH3 | 60.2 (CH3) | 2.68 (d, 3.0) | 4' | ||
| 3'-NCO | 158.9 (C) | 3'-NCH3 | |||
| NH2 | 6.02 (s) | 3', 3'-NCH3 |
表2 化合物3和4的1H NMR (400 MHz)和13C NMR (100 MHz)数据(DMSO-d6)Table 2 1H NMR (400 MHz) and 13C NMR (100 MHz) data for compounds 3 and 4 (DMSO-d6) |
| Position | 3 | 4 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| δC (type) | δH (mult. J in Hz) | δC (type) | δH (mult. J in Hz) | |||
| 1 | 110.0 (CH) | 7.60 (d, 8.0) | 108.4 (CH) | 7.57 (d, 8.2) | ||
| 2 | 125.2 (CH) | 7.45 (dd, 8.0, 7.4) | 124.9 (CH) | 7.42 (dd, 8.2, 7.4) | ||
| 3 | 119.3 (CH) | 7.63 (dd, 8.2, 7.4) | 118.8 (CH) | 7.27 (dd, 7.9, 7.4) | ||
| 4 | 125.0 (CH) | 9.25 (d, 8.2) | 125.6 (CH) | 9.29 (d, 7.9) | ||
| 4a | 122.9 (C) | 122.5 (C) | ||||
| 4b | 115.0 (C) | 113.5 (C) | ||||
| 4c | 121.0 (C) | 119.0 (C) | ||||
| 5 | 171.1 (C) | 172.3 (C) | ||||
| 6 | 11.1 (s) | 8.54 (s) | ||||
| 7 | 170.9 (C) | 45.4 (CH2) | 4.95 (s) | |||
| 7a | 131.0 (C) | 132.1 (C) | ||||
| 7b | 114.9 (C) | 114.1 (C) | ||||
| 7c | 121.0 (C) | 123.9 (C) | ||||
| 8 | 121.5 (CH) | 9.05 (d, 8.0) | 120.9 (CH) | 7.97 (d, 8.6) | ||
| 9 | 121.1 (CH) | 7.45 (dd, 8.0, 7.4) | 119.8 (CH) | 7.27 (dd, 8.6, 8.2) | ||
| 10 | 127.2 (CH) | 7.63 (dd, 8.5, 7.4) | 124.4 (CH) | 7.45 (dd, 7.9, 8.2) | ||
| 11 | 112.7 (CH) | 8.05 (d, 8.5) | 115.3 (CH) | 7.96 (d, 7.9) | ||
| 11a | 138.9 (C) | 139.5 (C) | ||||
| 12a | 129.8 (C) | 130.0 (C) | ||||
| 12b | 127.3 (C) | 126.7 (C) | ||||
| 13a | 137.6 (C) | 136.4 (C) | ||||
| 1' | 81.0 (CH) | 6.95 (dd, 2.7, 9.3) | 80.0 (CH) | 6.69 (t, 3.7) | ||
| 2' | 27.0 (CH2) | 2.13 (td, 1.8, 2.7); 3.33~3.35 (m) | 29.4 (CH2) | 3.17~3.20 (m); 2.49~2.51 (m) | ||
| 3' | 53.2 (CH) | 4.04~4.06 (m) | 50.1 (CH) | 3.22~3.25 (m) | ||
| 4' | 79.3 (CH) | 4.46 (d, 2.0) | 82.8 (CH) | 4.04 (d, 3.4) | ||
| 5' | 93.3 (C) | 91.1 (C) | ||||
| 6' | 27.8 (CH3) | 2.48 (s) | 29.8 (CH3) | 2.30 (s) | ||
| 3'-NH | 9.01~9.04 (m) | |||||
| 3'-NCH3 | 30.7 (CH3) | 2.20 (s) | 33.4 (CH3) | 1.44 (s) | ||
| 4'-OCH3 | 59.9 (CH3) | 2.71 (s) | 57.3 (CH3) | 3.32 (s) | ||
图3 化合物1和2的1H-1H COSY、HMBC和NOESY相关Figure 3 1H-1H COSY, HMBC and NOESY correlations of compounds 1 and 2 |
图式1 化合物1、2和8的化学合成Scheme 1 Synthesis of compounds 1, 2 and 8 Condition and reagents: (i) 1.5 equiv. BTC, 5 equiv. DMAP, 6 equiv. DIEA, CH2Cl2, r.t., 12 h; (ii) 50 equiv. NH4HCO3, 40 °C, 2 h; (iii) 10 equiv. t-BuOK, DMSO, air, r.t., 12 h; (iv) 10 equiv. DMAP, 3 equiv. Ms2O, CH2Cl2, r.t., 1 h; (v) 4 equiv. Na2WO4, 30 equiv. H2O2, MeOH/CH2Cl2 (V∶V = 1∶1), r.t., 2 h; (vi) Py, NH2OH, r.t., 0.5 h; (vii) 10 equiv. H2SO4, 1,4-dioxane, air, 100 °C,1 h; (viii) 10 equiv. NaBH3CN, 6 equiv. HCHO, MeOH, r.t., 0.5 h. |
化合物2为白色粉末状固体. HRMS (ESI)在m/z 545.1864 [M＋H]＋ (calcd 545.1864)处显示分子离子峰, 提示其分子式为C29H28N4O5S. 其紫外吸收和NMR数据与十字孢碱(4)(表2)非常相似, 推测其为十字孢碱的衍生物, 分子式比化合物4多一个CH2O2S. 仔细对比化合物2(表3)和化合物4(表2)的NMR数据发现, 化合物2只比化合物4多1个连有吸电子基的甲基信号(δC/H 36.7/3.12), 且糖环部分NMR信号的化学位移有明显变化, 其中H-3'和CH3N-3'氢化学位移变化尤为明显. 结合分子式和分子量, 推测化合物2为化合物4的3'-N-甲磺酰化衍生物, 即为3'-N-甲磺酰十字孢碱. 在NOESY谱图中, H-1'与H-3'以及H-4'与H-6'相关, 推测其相对构型与化合物4相同. 此外, 化合物2的ECD与化合物4展现出相同的趋势, 说明其绝对构型与化合物4相同. 尽管化合物2的结构已被合成, 但文献中没有报道相关的核磁共振数据以及比旋光和ECD立体化学数据[25]. 为了确认化合物2的结构, 对化合物4进行了甲磺酰化(Scheme 1). 通过手性柱LC-MS检测反应产物(混合针分析), 结果显示化合物4被成功转化为化合物2(图4), 进一步的核磁共振分析表明合成化合物2与天然化合物2的氢谱和碳谱数据相同, 因此确认了化合物2的结构. 这是首次从自然界中分离得到的化合物2.
表3 化合物2的1H NMR (600 MHz)和13C NMR (150 MHz)数据(DMSO-d6)Table 3 1H NMR (600 MHz) and 13C NMR (150 MHz) data for compound 2 (DMSO-d6) |
| Position | δC (type) | δH (mult. J in Hz) | COSY | HMBC | NOESY |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 109.0 (CH) | 7.61 (d, 8.4) | 2 | 3, 4a | 1' |
| 2 | 125.1 (CH) | 7.50 (dd, 8.4, 7.5) | 1, 3 | 4, 13a | |
| 3 | 119.6 (CH) | 7.31 (dd, 8.0, 7.5) | 2, 4 | 1, 4a | |
| 4 | 125.8 (CH) | 9.29 (d, 8.0) | 3 | 2, 4b, 13a | |
| 4a | 122.7 (C) | ||||
| 4b | 115.2 (C) | ||||
| 4c | 119.5 (C) | ||||
| 5 | 172.0 (C) | ||||
| 6 | 8.60 (s) | 5, 7, 7a, 4c | |||
| 7 | 45.5 (CH2) | 5.00 (s) | 5, 4c, 7a, 7b | 8 | |
| 7a | 132.7 (C) | ||||
| 7b | 114.2 (C) | ||||
| 7c | 123.8 (C) | ||||
| 8 | 121.6 (CH) | 8.04 (d,7.6) | 9 | 10, 7a, 11a | 7, 10 |
| 9 | 120.5 (CH) | 7.37 (dd, 7.6, 7.5) | 8, 10 | 11, 7c | |
| 10 | 125.1 (CH) | 7.50 (dd, 8.3, 7.5) | 9, 11 | 8, 11a | 8 |
| 11 | 113.7 (CH) | 8.06 (d, 8.3) | 10 | 9, 7c | |
| 11a | 138.8 (C) | ||||
| 12a | 129.2 (C) | ||||
| 12b | 125.4 (C) | ||||
| 13a | 136.3 (C) | ||||
| 1' | 82.3 (CH) | 7.04 (dd, 8.5, 5.9) | 2' | 12b, 2', 5' | 1, 3' |
| 2' | 26.9 (CH2) | 2.22 (dt, 12.7, 5.9), 2.81~2.83 (m) | 1', 3' | 3' | 4'-CH3 |
| 3' | 51.4 (CH) | 4.40 (dt, 12.7, 3.5) | 2' | 3'-NCH3 | 1' |
| 4' | 85.2 (CH) | 4.29 (brs) | 2', 4'-OCH3 | 4'-OCH3 | |
| 5' | 94.9 (C) | 6' | |||
| 6' | 29.2 (CH3) | 2.36 (s) | 5' | 4' | |
| 3'-NCH3 | 30.4 (CH3) | 2.67 (s) | 3' | ||
| 4'-OCH3 | 60.5 (CH3) | 2.78 (s) | 4' | ||
| 3'-NSO2CH3 | 36.8 (CH3) | 3.12 (s) |
化合物3为黄绿色油状物, MS (ESI)在m/z 481.2 [M＋H]＋处显示分子离子峰, 提示分子量为480, 结合1H NMR和13C NMR推测其分子式为C28H24N4O4. 其紫外与核磁共振光谱与化合物4非常相似(表2), 表明该化合物可能是十字孢碱的衍生物. 但与化合物4相比, 化合物3的NMR少了1个亚甲基信号(δC/H 45.5/4.95)、多了1个羰基信号(δC 170.9), 且可交换质子NH-6信号明显移向低场(＋2.56). 结合其比化合物4少2个氢、多1个氧的事实, 推测化合物3是化合物4的7-羰基化产物, 即7-氧代十字孢碱. 其核磁数据与文献值[24]相符, 化合物3的结构因此得以鉴定.
化合物4为淡黄色粉末状固体, MS (ESI)在m/z 467.2 [M＋H]＋处显示分子离子峰, 提示其分子量为466, 结合1H NMR和13C NMR推测其分子式为C28H26N4O3. 化合物4在λmax 291.8 nm处有尖锐的紫外吸收峰, 提示其为吲哚咔唑类化合物. 1H NMR给出26个氢信号, 13C NMR给出28个碳信号. 文献查阅表明, 这些NMR数据(表2)和相对构型以及比旋光与文献[26]报道的十字孢碱相符. 此外, NOESY测试表明, H-6'与H-1'和H-4'以及H-1'、H-3'和H-4'均与H-2'a有远程相关, 即H-1'、H-3'、H-4'和H-6'位于糖环的同一侧, 其相对构型与十字孢碱相同, 从而鉴定化合物4为十字孢碱.
化合物5为白色粉末状固体, MS (ESI)在m/z 470.2 [M＋H]＋处显示分子离子峰, 提示分子量为469, 结合1H NMR和13C NMR(表4)推测其分子式为C27H23N3O5. 化合物5的紫外与核磁共振光谱与化合物4类似, 表明该化合物亦为十字孢碱的衍生物; 但分子式比化合物4多2个氧、少1个氮和1个CH3. 仔细比对NMR数据发现, 化合物5比化合物4多1个可交换质子信号(δH 6.21)和1个连氧次甲基信号(δC/H 71.8/4.13)、少1个甲基信号(δC/H 33.4/1.44)和一个亚甲基信号(δC/H 29.4/3.19, 2.07), 且糖环部分的C-3'、C-4'和C-5'发生明显的低场位移, 位移值分别为15.6、0.3和4.5. 推测可能是2个羟基分别取代糖环的2'-H和3'-NHCH3. 查阅文献发现, 化合物5的NMR数据与文献[27]中的3'-去甲氨基- 2'α,3'α-二羟基十字孢碱(MLR-52)相吻合. 因此, 化合物5的结构得以鉴定.
表4 化合物5和6的1H NMR (400 MHz)和13C NMR (100 MHz)核磁数据(DMSO-d6)Table 4 1H NMR (400 MHz) and 13C NMR (100 MHz) data for compounds 5 and 6 (DMSO-d6) |
| Position | 5a | 6 | |||
|---|---|---|---|---|---|
| δC (type) | δH (mult. J in Hz) | δC (type) | δH (mult. J in Hz) | ||
| 1 | 108.8 (CH) | 7.65 (d, 8.2) | 109.9 (CH) | 7.69 (d, 8.5) | |
| 2 | 125.5 (CH) | 7.54 (dd, 8.2, 7.0) | 125.2 (CH) | 7.49 (dd, 8.5, 7.5) | |
| 3 | 119.9 (CH) | 7.33 (dd, 7.9, 7.0) | 119.3 (CH) | 7.27 (dd, 7.9, 7.5) | |
| 4 | 125.8 (CH) | 9.31 (d, 7.9) | 125.6 (CH) | 9.47 (d, 7.9) | |
| 4a | 122.8 (C) | 122.3 (C) | |||
| 4b | 114.9 (C) | 117.6 (C) | |||
| 4c | 119.3 (C) | 118.6 (C) | |||
| 5 | 171.9 (C) | 172.3 (C) | |||
| 6 | 8.61 (s) | 8.55 (s) | |||
| 7 | 45.5 (CH2) | 4.98 (dd, 17.6, 24.0) | 45.2 (CH2) | 5.00 (dd, 18.8, 22.1) | |
| 7a | 132.7 (C) | 133.9 (C) | |||
| 7b | 114.4 (C) | 114.9 (C) | |||
| 7c | 123.7 (C) | 121.9 (C) | |||
| 8 | 121.0 (CH) | 8.00 (d, 7.8) | 121.2 (CH) | 8.07 (d, 7.7) | |
| 9 | 120.3 (CH) | 7.33 (dd, 7.8, 7.0) | 119.9 (CH) | 7.31 (dd, 7.7, 7.5) | |
| 10 | 125.0 (CH) | 7.46 (dd, 7.0, 8.5) | 125.2 (CH) | 7.49 (dd, 7.5, 8.0) | |
| 11 | 115.5 (CH) | 7.98 (d, 8.5) | 77.2 (CH) | 7.60 (d, 8.0) | |
| 11a | 140.3 (C) | 139.0 (C) | |||
| 12 | 11.69 (s) | ||||
| 12a | 127.9 (C) | 127.6 (C) | |||
| 12b | 124.7 (C) | 124.6 (C) | |||
| 13a | 136.5 (C) | 140.3 (C) | |||
| 1' | 87.3 (CH) | 6.60 (d, 1.8) | 77.2 (CH) | 6.39 (dd, 2.7, 9.5) | |
| 2' | 71.8 (CH) | 4.13 (dd, 3.1, 1.8) | 67.0 (CH) | 4.49 (dt, 2.5, 9.5) | |
| 3' | 65.7 (CH) | 3.57 (dd, 3.1, 10.5) | 71.7 (CH) | 4.18 (q, 3.4) | |
| 4' | 83.1 (CH) | 4.13 (d, 10.5) | 71.5 (CH) | 4.05 (t, 3.5) | |
| 5' | 95.6 (C) | 76.5 (CH) | 4.48 (q, 6.1) | ||
| 6' | 29.1 (CH3) | 2.39 (s) | 15.4 (CH3) | 1.70 (dd, 2.6, 7.1) | |
a The NMR data for 2'-OH, 3'-OH and 4'-OCH3 were δH 6.21 (d, 3.7, 1H), 5.10 (d,5.7, 1H), and δC/H 61.7 (CH3)/3.63 (s, 3H), respectively. |
化合物6为白色粉末状固体, MS (ESI)在m/z 458.2 [M＋H]＋处显示分子离子峰, 提示其分子量为457; 结合1H NMR和13C NMR数据(表4), 推测其分子式为C26H23N3O5. 其紫外光谱和核磁共振光谱与化合物5非常相似, 表明化合物6同样为吲哚咔唑生物碱, 但分子式比化合物5少一个碳原子. 与化合物5的NMR数据相比(表4), 化合物6少了1个甲氧基信号, 并且1个连氧次甲基信号(δH/C 4.48/76.5)替代了糖环上相应的缩酮信号(δC 95.6), 推测其为桥连糖环开环而形成的简单糖苷类化合物. 文献检索表明, 化合物6的NMR数据及比旋光与文献[28]报道的K252d相符, 故鉴定化合物6为K252d.
化合物7为白色粉末状固体, MS (ESI)在m/z 468.2处显示分子离子峰[M＋H]＋, 结合1H NMR和13C NMR数据(表5), 推测其分子式为C27H21N3O5. 其紫外吸收与十字孢碱(4)相似, 表明它也是吲哚咔唑生物碱, 但分子式比化合物4多2个氧原子、少1个碳和5个氢原子. 两者吲哚咔唑母核部分的NMR数据相似, 差别在于糖环部分. 化合物7比化合物4多1个连氧季碳信号(δC 85.0)和1个羰基碳信号(δC 172.9), 少了相应的甲氨基次甲基信号, 可能是化合物4中的C(3')-C(5')片段发生了氧化缩环反应[29]. 文献调查表明, 化合物7的NMR数据与比旋光值与文献[30]报道的K252a基本一致, 因此鉴定化合物7为K252a.
表5 化合物7和8的1H NMR (400 MHz)和13C NMR (100 MHz)数据(DMSO-d6)aTable 5 1H NMR (400 MHz) and 13C NMR (100 MHz) data for compounds 7 and 8 (DMSO-d6) |
| Position | 7 | 8 | |||
|---|---|---|---|---|---|
| δC (type) | δH (mult. J in Hz) | δC (type) | δH (mult. J in Hz) | ||
| 1 | 109.2 (CH) | 7.94 (d, 8.5) | 109.2 (CH) | 7.92 (d, 8.3) | |
| 2 | 125.5 (CH) | 7.50 (dd, 8.5, 7.4) | 125.4 (CH) | 7.48 (dd, 8.3, 7.2) | |
| 3 | 119.6 (CH) | 7.29 (dd, 7.4, 8.0) | 119.6 (CH) | 7.29 (dd, 7.2, 8.0) | |
| 4 | 125.7 (CH) | 9.22 (d, 8.0) | 125.6 (CH) | 9.21 (d, 8.0) | |
| 4a | 122.6 (C) | 122.6 (C) | |||
| 4b | 115.8 (C) | 115.9 (C) | |||
| 4c | 120.5 (C) | 119.7 (C) | |||
| 5 | 171.8 (C) | 171.8 (C) | |||
| 6 | 8.65 (s) | 8.66 (s) | |||
| 7 | 45.5 (CH2) | 5.01 (dd, 17.8, 23.0) | 45.6 (CH2) | 5.00 (dd, 16.0, 20.0) | |
| 7a | 133.0 (C) | 133.0 (C) | |||
| 7b | 114.9 (C) | 114.7 (C) | |||
| 7c | 124.0 (C) | 124.0 (C) | |||
| 8 | 121.3 (CH) | 8.07 (d, 7.6) | 121.4 (CH) | 8.05 (d, 7.8) | |
| 9 | 119.6 (CH) | 7.37 (dd, 7.4, 7.6) | 120.6 (CH) | 7.36 (dd, 7.4, 7.8) | |
| 10 | 125.1 (CH) | 7.50 (dd, 8.5, 7.4) | 125.7 (CH) | 7.49 (dd, 8.5, 7.4) | |
| 11 | 114.6 (CH) | 7.91 (d, 8.5) | 114.9 (CH) | 8.09 (d, 8.5) | |
| 11a | 140.0 (C) | 139.7 (C) | |||
| 12a | 128.4 (C) | 128.5 (C) | |||
| 12b | 124.2 (C) | 124.2 (C) | |||
| 13a | 136.9 (C) | 136.8 (C) | |||
| 1' | 85.1 (CH) | 7.15 (dd, 5.0, 7.1) | 85.9 (CH) | 7.20 (dd, 5.1, 7.3) | |
| 2' | 42.6 (CH2) | 2.02 (dd, 5.0, 14); 3.40 (t, 7.1) | 40.1 (CH2) | 2.03 (dd, 5.1, 13.8); 3.43 (dd, 7.3, 13.8) | |
| 3' | 85.0 (C) | 78.1 (C) | |||
| 4' | 99.4 (C) | 100.5 (C) | |||
| 5' | 172.9 (C) | 173.0 (C) | |||
| 6' | 22.9 (CH3) | 2.16 (s) | 23.9 (CH3) | 2.17 (s) | |
| 5'-OCH3 | 52.8 (CH3) | 3.94 (s) | 53.0 (CH3) | 3.94 (s) | |
a The NMR data for 3'-OH (7) and 3'-NHCH3 (8) was δH 6.37 (s, 1H), and δC/H 32.4 (CH3)/1.94 (d, 5.9, 3H), respectively. |
化合物8为白色粉末状固体, MS (ESI)在m/z 481.2处显示分子离子峰[M＋H]＋, 结合1H NMR和13C NMR数据(表5), 推测其分子式为C28H24N4O4. 其紫外光谱和核磁共振数据与化合物7极为相似, 但分子式比化合物7多1个NCH3、少1个氧原子, NMR比化合物7少1个羟基信号(δH 6.37)、多1个氮甲基信号(δC/H 32.4/1.94), 且C-3'信号显著向高场位移(δ －6.9). 推测化合物8是化合物7的3'-甲氨基取代羟基的产物, 即3'-methyl- amino-3'-deoxy K252a. NMR数据与文献值相符, 但文献中没有旋光等立体化学数据[31-32], 为了进一步鉴定化合物8的结构, 我们参考文献方法[33]合成了化合物8. 即通过氧化成肟(8a)[34]、氧化重排(8b)[33]以及氮甲基化反应, 将化合物4转化为化合物8(总收率49.7%) (Scheme 1). 通过手性柱的LC-MS混合针分析发现化合物4被转化为化合物8(图4), 进一步的核磁分析表明合成化合物8与天然化合物8具有相同的NMR数据, 因此确认了化合物8的结构.
化合物9为白色粉末状固体, MS (ESI)在m/z 441.0处显示分子离子峰[M＋H]＋, 提示其分子量为440. 结合其1H NMR和13C NMR数据(表6), 推测其分子式为C26H24N4O3. 紫外光谱和NMR谱与化合物6的相似性, 表明其同样为桥连糖环打开的吲哚咔唑生物碱, 但分子式比化合物6少了2个氧原子、多了1个NH. 仔细比对两者的NMR数据, 发现显著差异在于糖环部分. 化合物9比化合物6多了1个伯氨基信号[δH 8.19~8.21 (m, 2H)], 且1个亚甲基信号(δC/H 30.7/2.02, 2.55)替代了连氧次甲基信号(δC 67.0/4.49). 此外, 1个次甲基碳信号向高场位移(δC 65.7→45.8), 推测是由于2'-脱氧和3'-OH被-NH2取代. 进而通过文献调查, 发现化合物9的NMR数据和比旋光与文献[35]报道的holyrine A基本一致, 由此鉴定化合物9为holyrine A.
表6 化合物9~11的1H NMR (400 MHz)和13C NMR (100 MHz)数据(DMSO-d6)Table 6 1H NMR (400 MHz) and 13C NMR (100 MHz) data for compounds 9~11 (DMSO-d6) |
| Position | 9 | 10a | 11a | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| δC (type) | δH (mult. J in Hz) | δC (type) | δH (mult. J in Hz) | δC (type) | δH (mult. J in Hz) | |||
| 1 | 109.5 (CH) | 7.95 (d, 8.5) | 109.7 (CH) | 8.02 (d, 8.4) | 110.5 (CH) | 8.14 (d, 8.5) | ||
| 2 | 125.5 (CH) | 7.52 (dd, 8.5, 7.3) | 125.4 (CH) | 7.50 (dd, 8.4, 7.3) | 126.9 (CH) | 7.60 (dd, 7.6, 8.5) | ||
| 3 | 120.0 (CH) | 7.32 (dd, 7.9, 7.3) | 119.7 (CH) | 7.29 (dd, 7.3, 7.9) | 120.2 (CH) | 7.37 (dd, 7.6, 8.0) | ||
| 4 | 125.9 (CH) | 9.47 (d,7.9) | 125.7 (CH) | 9.46 (d, 7.9) | 124.6 (CH) | 9.10 (d, 8.0) | ||
| 4a | 122.3 (C) | 122.2 (C) | 121.1 (C) | |||||
| 4b | 117.5 (C) | 117.3 (C) | 117.3 (C) | |||||
| 4c | 118.6 (C) | 118.5 (C) | 119.2 (C) | |||||
| 5 | 172.2 (C) | 172.3 (C) | 171.1 (C) | |||||
| 6 | 8.58 (s) | 8.55 (s) | 11.11 (s) | |||||
| 7 | 45.2 (CH2) | 5.00 (dd, 16.9, 20.3) | 45.2 (CH2) | 5.00 (dd, 17.4, 20.2) | 171.2 (C) | |||
| 7a | 134.3 (C) | 134.1 (C) | 120.8 (C) | |||||
| 7b | 115.1 (C) | 114.9 (C) | 116.5 (C) | |||||
| 7c | 121.8 (C) | 121.8 (C) | 121.0 (C) | |||||
| 8 | 121.2 (CH) | 8.08 (d, 7.7) | 121.2 (CH) | 8.07 (d, 7.9) | 124.7 (CH) | 9.20 (d, 8.1) | ||
| 9 | 120.0 (CH) | 7.32 (dd, 7.7, 7.5) | 119.8 (CH) | 7.32 (dd, 7.9, 7.4) | 120.9 (CH) | 7.42 (dd, 7.4, 8.1)) | ||
| 10 | 125.1 (CH) | 7.49 (dd, 7.2, 8.8) | 125.0 (CH) | 7.50 (dd, 7.4, 8.1) | 127.1 (CH) | 7.61 (dd, 7.4, 8.3) | ||
| 11 | 113.6 (CH) | 8.01 (d, 8.5) | 111.7 (CH) | 7.71 (d, 8.1) | 111.8 (CH) | 7.73 (d, 8.3) | ||
| 11a | 139.2 (C) | 139.3 (C) | 139.8 (C) | |||||
| 12 | 11.79 (s) | 12.13 (s) | 12.34 (s) | |||||
| 12a | 127.2 (C) | 127.4 (C) | 127.6 (C) | |||||
| 12b | 124.0 (C) | 124.2 (C) | 128.7 (C) | |||||
| 13a | 138.5 (C) | 138.6 (C) | 140.4 (C) | |||||
| 1' | 75.1 (CH) | 6.71 (dd, 11.2, 4.1) | 75.9 (CH) | 6.73 (dd, 4.3, 11.3) | 76.1 (CH) | 6.77 (dd (3.3, 11.5) | ||
| 2' | 30.7 (CH2) | 2.02 (dt, 4.1, 12.7); 2.55 (dd, 11.2, 12.7) | 32.2 (CH2) | 1.80 (dt, 4.3, 12.9); 2.52 (d, 12.9) | 32.0 (CH2) | 1.85 (dt, 3.3, 12.4); 2.50 (m) | ||
| 3' | 45.8 (CH) | 4.12~4.15 (m) | 44.3 (CH) | 4.70 (dd, 3.3, 7.7) | 44.1 (CH) | 4.71 (dd, 5.7, 7.8) | ||
| 4' | 66.1 (CH) | 4.08~4.10 (m) | 68.2 (CH) | 3.92 (d, 3.3) | 68.2 (CH) | 3.92 (brs) | ||
| 5' | 76.5 (CH) | 4.62 (q, 6.9) | 76.7 (CH) | 4.52 (q, 6.7) | 77.0 (CH) | 4.53 (q, 7.1) | ||
| 6' | 14.0 (CH3) | 1.60 (d, 7.2) | 14.4 (CH3) | 1.61 (d, 7.1) | 14.3 (CH3) | 1.61 (d, 7.1) | ||
| 3'-NH | 8.19~8.21 (m, 2H, NH2) | 7.92 (d, 7.7) | 7.93 (d, 7.8) | |||||
| 4'-OH | 7.67 (m) | 6.96 (s) | 7.02 (s) | |||||
a The NMR data of N3'-acetyl for both 10 and 11 were δC 168.8 (C) and δH/C 1.82 (s, 3H)/22.7 (CH3), respectively |
化合物11为黄色粉末状固体, MS (ESI)在m/z 497.2处显示分子离子峰[M＋H]＋. 结合1H NMR和13C NMR数据(表6), 推测其分子式为C28H24N4O5, 比化合物10多1个氧原子、少2个氢原子. 化合物11比化合物10少1个亚甲基信号(δC/H 45.2/5.00)、多1个羰基信号(δC 171.2), 且H-6信号显著移向低场(＋2.56)之外, 两者的NMR数据也极为相似, 推测化合物11是化合物10的7-羰基化产物. 文献检索表明, 化合物11的NMR和比旋光数据与文献[36]报道的7-oxo-3'-N-acetylholyrine A (13G-31G)相一致, 因此鉴定化合物11为13G-31G.
当吲哚咔唑母核与糖形成氮杂糖苷类天然产物时, 表现出不同的ECD Cotton效应. 根据作者前文的ECD计算[11]与八隅体规则分析[10], 十字孢碱等具有桥联糖环的化合物(存在C-1'与C-5'两个氮杂糖苷键), C-5'的手性决定了吲哚咔唑母核的特征π→π*跃迁(λmax 290 nm) 的ECD效应: 5'S-构型呈现正Cotton效应(化合物1~5、7、8)、5'R-构型呈现负Cotton效应. 而桥联糖环开环的简单糖苷类化合物, 距离发色团最近的端基碳(C-1')决定λmax 290 nm附近的ECD效应, 其中1'R-构型呈现负Cotton效应(化合物6、9~11), 但吲哚咔唑母核上引入共轭基团时将红移, 比如化合物1 (λmax 315.2 (Δε＋1.17) nm)、化合物3 (λmax 314 (Δε＋0.79) nm)和化合物11 (λmax 305 (Δε＋1.87) nm). 因此, λmax 290 nm附近的ECD Cotton效应可判断十字孢碱类化合物分子中糖的构型.
1.3 化合物活性测试结果
采用微量稀释法测试了化合物1~11对16种人体致病菌和水产致病菌抑菌活性, 结果表明, 化合物1对迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)、化合物6对创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、化合物9对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)有抑菌活性, MIC值均为32 μg•mL－1; 化合物10对创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)有抑菌活性, MIC值均为32 μg•mL－1; 化合物1、6、9和10对其他致病菌以及其他化合物没有显示出抑菌活性(MIC>64 μg•mL－1), 阳性药环丙沙星对V. vulnificus、V. paraha- emolyticus、E. aerogenes、B. cereus和B. thuringiensis的MIC值均为4 μg•mL－1.
活性化合物1、6、9和10的分子中的糖环部分均为六元糖环, 推测六元糖环的吲哚咔唑糖苷可能比五元糖环吲哚咔唑糖苷具有更好的抑菌活性. 此外, 化合物6、9和10对水产致病菌均表现出抑菌活性, 暗示桥联的糖环开环后形成的简单糖苷类化合物可能表现出更强的活性, 而糖环上的4'-羟基可能是其活性的关键位点. 化合物11与化合物10的结构十分相似, 区别仅在于化合物11的7-位亚甲基被羰基化, 从而导致其抑菌活性丧失. 最后, 化合物1与化合物3相比, 化合物1因含有脲基而对迟缓爱德华菌E. tarda表现出抑菌作用, 推测脲基可能对化合物1的抑菌作用具有重要作用.
2 结论
本研究充分利用海洋链霉菌OUCMDZ-5522菌株这一生物资源, 探索其次级代谢产物的化学多样性, 成功获得11个吲哚咔唑类化合物. 并且以主产物十字孢碱原料, 定向合成了新化合物1以及新天然来源的化合物2和化合物8, 确定了他们的绝对构型, 也进一步拓展了主产物十字孢碱的化学空间. 本研究还首次发现3'-N-acetylholyrine A (10)展现出对4种致病菌(E. aerogenes、B. cereus、V. vulnificus、B. thuringiensis)的抑菌作用, 化合物1对迟缓爱德华菌(E. tarda)的抑菌作用, 为这些病原菌的防治提供了潜在的先导化合物.
3 实验部分
3.1 仪器与试剂
自动过柱机(SPBT-191569, Sepa Bean公司); 高效液相色谱仪(岛津公司, Shimadzu LC-6AD型号, SPD-M10Avp检测器, YMC-pack ODS-A C18柱: 4.6 mm×250 mm, 5 μm, 12 nm, 1 mL/min); 半制备型高效液相色谱仪(LC-6AD泵, SPD-10AVP检测器, ClassVP型系统控制器, 日本岛津公司); ODS-A色谱柱(10 mm×250 mm, 5 µm, 日本YMC公司); 液-质联用仪(Wasters公司, Q-TOF Ultima Global GAA076 LC型); 紫外光谱仪(DU640型, 美国Beckman公司); 红外光谱仪(Nicolet NEXUS 470型, 美国Nicolet公司); 旋光仪(MCP-5100型, 奥地利Anton Paar公司); 电子圆二色谱仪(JASCOJ-715型, 日本IASCO公司); 核磁共振仪(Agilent DD2 500型, 美国Agilent公司; JNM-ECZ600R/ SI, 日本JEOL公司); 天平(ME204, 梅特勒-托利多仪器有限公司); 超声仪(VC750, Sonics公司); 超净工作台(MCV-131 BNF(T)型, Sanyo公司); 恒温摇床(ZHWY211B, 上海智诚分析仪器制造有限公司); 超净台(Air Tech, 苏州安泰空气技术有限公司); 便携式pH计(FiveGo2, 梅特勒-托利多仪器有限公司); 高压灭菌锅(LDZX-75KBS, 上海爱宝医疗器械有限公司); 旋转蒸发仪(N-1100型, EYELA公司); 循环水式多用真空泵(SHB-Ⅲ型, 郑州长城科工贸有限公司).
发酵所用的可溶性淀粉、甘油、葡萄糖、豆粉以及各类无机盐均购自国药集团; 蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏及玉米浸膏购自北京双旋微生物培养基制品厂; 琼脂购自Solarbio公司; 高效液相色谱以及液-质联用所用的甲醇和乙腈均为色谱纯溶剂; 常规提取分离用二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、丙酮和石油醚均为工业用化学纯产品; 核磁测试溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6) (Merck); 洗脱剂添加分析纯三氟乙酸(TFA).
3.2 菌株的分离鉴定
菌株Streptomyces sp. OUCMDZ-5522分离自海南东寨港红树林自然保护区的红树林植物海桑(Sonneratia caseolaris)的根际土壤. 取海桑根际土壤样品1 g置于无菌研钵中, 加入10 mL无菌水进行充分研磨, 制得样品母液. 将样品母液稀释为10－2倍稀释液, 吸取100 μL稀释液涂布于分离用琼脂培养基中(具体配方见表7), 于28 ℃孵育培养, 将单菌落挑至纯化用琼脂培养基进行纯化后, 于－80 ℃下甘油管保藏菌种.
表7 培养基配方一览表Table 7 List of Culture Medium Formulations |
| 培养基名称 | 配方 |
|---|---|
| A1 | 可溶性淀粉10 g, 酵母浸膏4 g, 蛋白胨2 g, Fe2(SO4)3•4H2O 0.04 g, KBr 0.1 g, 海水1 L, 自然pH |
| Kazuo | 可溶性淀粉25 g, 酵母浸膏2 g, 豆粉15 g, CaCO3 2 g, Amberlite XAD-16N 10 g, 海水1 L, 自然pH |
| LB | 胰蛋白胨10 g, NaCl 5 g, 酵母浸膏5 g, 自来水1 L, 自然pH |
| YPD | 酵母浸膏10 g, 蛋白胨20 g, 葡萄糖20 g, 海水1 L, 自然pH |
| 分离培养基 | 可溶性淀粉10 g, 干酪素0.3 g, 硝酸钾2 g, 七水合硫酸镁0.05 g, 氯化钠2.0 g, 磷酸氢二钾2.0 g, 碳酸钙0.02 g, 七水合硫酸亚铁0.01 g, 海水500 L, 水500 L, 琼脂20 g, 重铬酸钾50 mg, pH 7.2~7.4 |
| 纯化培养基 | 葡萄糖4.0 g, 酵母膏4.0 g, 麦芽浸粉10.0 g, 海盐27.0 g, 水1000 mL, pH 7.0 |
按下列程序提取样品的16S rDNA并进行聚合酶链式反应(PCR)扩增[37]: 用无菌牙签挑取复苏的菌株OUCMDZ-5522单菌落, 置于1.5 mL EP管中; 加入100 μL的MightyPrep reagent for DNA (TaKaLa)裂解液, 涡旋混合; 并进行30个PCR循环, 94 ℃金属浴5 min、94 ℃金属浴45 s、55 ℃金属浴45 s、72 ℃金属浴1 min为一个循环, 最后延伸10 min. PCR产物纯化由青岛擎科生物科技有限公司进行测序.
3.3 菌株的发酵和提取
配制咔唑(Kazuo)液体培养基(具体配方见表7), 并将其分装在500 mL三角瓶中, 每瓶装入150 mL培养基, 并置于高压灭菌锅中灭菌(121 ℃, 21 min). 将生长于A1琼脂培养基上(含琼脂)的单菌落接种到A1液体培养基中, 在28 ℃恒温震荡培养箱中以180 r/min培养3 d, 获得种子液. 用无菌吸管吸取种子液, 接种到灭菌的咔唑液体培养基中(6 mL/瓶); 在28 ℃恒温震荡培养箱中以180 r/min发酵培养10 d, 总共发酵780瓶. 发酵结束后, 分离菌丝体(含大孔树脂)和发酵液. 将菌丝体用丙酮-水(V∶V=80∶20)体系浸泡后进行机械破碎, 超声处理30 min, 过滤出丙酮; 如此反复三次, 合并滤液并减压浓缩除去丙酮. 剩余的水相用等体积的乙酸乙酯萃取三次, 合并乙酸乙酯相并减压浓缩蒸干; 发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取三次, 合并乙酸乙酯相并减压浓缩蒸干; 合并浸膏, 得到172.7 g乙酸乙酯提取物.
3.4 菌株代谢产物的分离纯化
上述乙酸乙酯提取物经过正相减压柱色谱分离 (拌样硅胶为100~200目, 过柱硅胶为200~300目, 柱直径为14.5 cm, 柱高为20 cm), 使用石油醚/CH2Cl2 (V∶V=100∶1~0∶1]、CH2Cl2/MeOH [V∶V=100∶1~0∶1]依次进行减压梯度洗脱, 洗脱液经薄层色谱 (TLC)检测, 合并浓缩得到14个组分(Fr.1~Fr.14). 经高效液相色谱(HPLC)检测, 组分Fr.7~Fr.9富含吲哚咔唑生物碱, 进行进一步的分离纯化.
组分Fr.7 [V(CH2Cl2)∶V(MeOH)=80∶1、70∶1、60∶1, 各9 L, 共10 g]经过加压反相硅胶柱色谱分离(柱型号为SW120), 使用H2O/MeOH (V∶V=90∶10~0∶100]作为流动相梯度洗脱, 并通过TLC检测, 合样得到10个亚组分(Fr.7.1~Fr.7.10). 亚组分Fr.7.5 (400 mg)通过ToyopearlHW-40F凝胶柱色谱分离(柱高90 cm、柱直径2 cm、纯MeOH洗脱)、TLC检测及合样, 进一步分离为8个亚组分Fr.7.5.1~Fr.7.5.8. 其中亚组分Fr.7.5.2 (26 mg)通过半制备HPLC (YMC-ODS-A, 以下同)分离、使用乙腈/酸水[V∶V=50∶50, 3 mL/min, 酸水为含体积分数为0.05%三氟乙酸(TFA)的双蒸水, 以下同]洗脱, 得到化合物5 (3.6 mg, tR=21.2 min). 亚组分Fr.7.5.6 (55 mg)通过半制备HPLC分离[V(乙腈)∶V(酸水)=47∶53, 3 mL/min]洗脱得到化合物8 (2.2 mg, tR=18.5 min).
组分Fr.8 [V(CH2Cl2)∶V(MeOH)=50∶1、40∶1, 各9 L, 共20.4 g]经过减压正相硅胶色谱柱色谱分离[柱直径为5 cm、柱高为21 cm、使用CH2Cl2/MeOH (V∶ V=80∶1~0∶1)梯度洗脱], 得到8个亚组分(Fr.8.1~8.8). 其中亚组分Fr.8.3 (1.2 g)经加压反相硅胶柱色谱分离[柱型号为SW080、使用H2O/MeOH (V∶V 90∶10~0∶100)梯度洗脱]、TLC检测合样, 得到12个亚组分(Fr.8.3.1~Fr.8.3.12). 其中亚组分Fr.8.3.5 (66 mg)通过半制备HPLC分离[V(乙腈)∶V(酸水)=43∶57, 3 mL/min]得到化合物6 (8.6 g, tR=18.7 min)和9 (4.1 mg, tR=22.3 min), 亚组分Fr.8.3.7 (75 mg)通过半制备HPLC分离[V(乙腈)∶V(酸水)=34∶66, 3 mL/min]得到化合物7 (2.2 mg, tR=11.5 min). 亚组分Fr.8.6 (560 mg)通过ToyopearlHW-40F凝胶柱色谱分离(柱高90 cm, 柱直径2 cm)、V(CH2Cl2)∶V(MeOH)=1∶1洗脱)、TLC检测合样, 得到10个亚组分(Fr.8.6.1~Fr.8.6.10). 其中亚组分Fr.8.6.8 (25 mg)通过半制备HPLC分离[V(乙腈)∶V(酸水)=50∶50, 3 mL/min]得到化合物1 (3.2 mg, tR=24.5 min)和3 (2.0 mg, tR=11.2 min). 亚组分Fr.8.7 (3 g)以十字孢碱为主要成分, 经丙酮回流得到纯度>95%的化合物4 (1.0 g).
组分Fr.9 (CH2Cl2/MeOH, V∶V=30∶1、20∶1, 各9 L, 共13.5 g)经过减压正相硅胶色谱柱色谱分离[柱直径4 cm、柱高18 cm、CH2Cl2/MeOH (V∶V=60∶1~0∶1)梯度洗脱]、TLC检测合样, 得到10个亚组分, 即Fr.9.1~Fr.9.10. 亚组分Fr.9.5 (620 mg)通过Toyopearl HW-40F凝胶柱色谱分离(柱高90 cm、柱直径2cm、纯MeOH洗脱)、TLC检测合样, 得到10个亚组分(Fr.9.5.1~Fr.9.5.10). 其中亚组分Fr.9.5.8 (60 mg)通过半制备HPLC分离[V(乙腈)∶V(酸水)=50∶50, 3 mL/min]得到化合物11 (2.5 mg, tR=27.5 min)和10 (0.9 mg, tR=12.8 min), 亚组分Fr.9.5.9 (22 mg)通过半制备HPLC分离[V(乙腈)∶V(酸水)=48∶52, 3 mL/min]得到化合物2 (2.0 mg, tR=42.5 min).
7-氧代-3'-N-氨甲酰基十字孢碱(7-oxo-3'-N-car- bamoylstaurosporine, 1): 黄色油状物. $[\alpha]_{\mathrm{D}}^{18}$＋55.2 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH) λmax: 239, 287, 318, 383 nm; IR (KBr) νmax: 3370, 2941, 1715, 1698, 1573, 1473, 1318 cm－1; ECD (0.96 mmol/L, MeOH) λmax [Δε/(L•mol－1• cm－1)]: 210.5 (－4.27), 231.0 (＋2.49), 244.5 (＋0.76), 262.5 (＋1.89), 315.2 (＋1.17), 336.6 (－0.62) nm; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)和13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)见表1; HRMS (ESI) calcd for C29H24N5O5 [M－H]－ 522.1782, found 522.1770.
3'-N-甲磺酰基十字孢碱(3'-N-mesylstaurosporine, 2): 白色粉末状固体. m.p. 265~267 ℃; $[\alpha]_{\mathrm{D}}^{18}$＋43.1 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH) λmax: 245, 292, 334, 372 nm; IR (KBr) νmax: 3414, 1675, 1456, 1320, 1119, 1075 cm－1; ECD (0.92 mmol/L, MeOH) λmax [Δε/(L•mol－1•cm－1)]: 208 (－8.86), 230 (＋2.97), 241 (＋1.22), 249 (＋2.18), 263 (－0.90), 300 (＋2.37) nm; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)和13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)见表3; HRMS (ESI) calcd for C29H29N4O5S [M＋H]＋ 545.1853, found 545.1864.
7-氧代十字孢碱(7-oxostaurosporine, 3): 黄绿色油状物. $[\alpha]_{\mathrm{D}}^{18}$＋50.2 (c 0.06, CH2Cl2); UV (MeOH) λmax: 238, 286, 317, 380 nm; ECD (1.04 mmol/L, MeOH) λmax [Δε/(L•mol－1•cm－1)]: 205 (－7.24), 230 (＋4.18), 242 (－0.35), 262 (＋2.31), 283 (＋2.85), 314 (＋0.79) nm; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)和13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)见表2; MS (ESI) m/z: 481.2 [M＋H]＋.
十字孢碱(staurosporine, 4): 淡黄色粉末状固体. m.p. 270 ℃; $[\alpha]_{\mathrm{D}}^{18}$＋40.1 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH) λmax: 244, 292, 333, 355, 434 nm; ECD (1.07 mmol/L, MeOH) λmax [Δε/(L•mol－1•cm－1)]: 208.5 (－6.45), 230.5 (＋3.33), 249.5 (＋1.35), 265 (－1.80), 297 (＋2.63), 374 (－0.24) nm; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)和13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)见表2; MS (ESI) m/z: 467.2 [M＋H]＋.
3'-去甲氨基-2'α,3'α-二羟基十字孢碱(MLR-52, 5): 白色粉末状固体. m.p. 263~265 ℃; $[\alpha]_{\mathrm{D}}^{18}$＋24.4 (c 0.093, MeOH); UV (MeOH) λmax: 236, 290, 334, 370 nm; ECD (1.06 mmol/L, MeOH) λmax [Δε/(L•mol－1•cm－1)]: 205 (－1.93), 230 (＋0.38), 248 (＋0.64), 270 (＋0.14), 294 (＋1.67), 327 (＋0.27) nm; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)和13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)见表4; MS (ESI) m/z: 470.2 [M＋H]＋.
K252d (6): 白色粉末状固体. m.p. 240~242 ℃; $[\alpha]_{\mathrm{D}}^{18}$＋30.0 (c 0.02, MeOH); UV (MeOH) λmax: 234, 289, 335, 347 nm; ECD (1.09 mmol/L, MeOH) λmax [Δε/(L• mol－1•cm－1)]: 208 (＋3.31), 231 (－0.92), 257 (＋0.92), 288 (－0.66), 362 (＋0.88) nm; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)和13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)见表4; MS (ESI) m/z: 458.2 [M＋H]＋.
K252a (7): 白色粉末状固体. m.p. 262~265 ℃; $[\alpha]_{\mathrm{D}}^{18}$＋37.0 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH) λmax: 208, 229, 290, 334 nm; ECD (1.07 mmol/L, MeOH) λmax [Δε/(L• mol－1• cm－1)]: 211.5 (－3.51), 250 (＋2.47), 298.5 (＋1.17), 310 (＋0.55), 334.5 (＋1.23), 366 (＋0.60) nm; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)和13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)见表5; MS (ESI) m/z: 468.2 [M＋H]＋.
3'-甲氨基-3'-去氧K252a (3'-methylamino-3'- deoxyK252a, 8): 白色粉末状固体. m.p. 152~155 ℃; $[\alpha]_{\mathrm{D}}^{18}$＋73.3 (c 0.03, MeOH); UV (MeOH) λmax: 245, 292, 334, 355 nm; ECD (1.04 mM, MeOH) λmax [Δε/(L•mol－1• cm－1)]: 201 (＋1.47), 214 (－4.81), 245 (＋4.54), 272 (－1.04), 299 (＋1.91), 313 (＋1.11), 333 (＋2.49) nm; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)和13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)见表5; MS (ESI) m/z: 481.2 [M＋H]＋.
Holyrine A (9): 白色粉末状固体. m.p. 247 ℃; $[\alpha]_{\mathrm{D}}^{18}$－30 (c 0.05, MeOH); UV (MeOH) λmax: 232, 289, 334, 375 nm; ECD (1.14 mM, MeOH) λmax [Δε/(L•mol－1• cm－1)]: 208 (＋4.31), 231 (－2.22), 242 (＋0.73), 256 (＋1.23), 276 (＋1.25), 293 (＋0.59), 359 (＋2.05) nm; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)和13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)见表6; MS (ESI) m/z: 441.0 [M＋H]＋.
3'-N-乙酰holyrine A (3'-N-acetylholyrine A, 10): 淡黄色粉末状固体. m.p. 252 ℃; $[\alpha]_{\mathrm{D}}^{18}$－94 (c 0.05, MeOH); UV (MeOH) λmax: 234, 287, 235, 348 nm; ECD (1.04 mmol/L, MeOH) λmax [Δε/(L•mol－1•cm－1)]: 201 (＋2.21), 233 (－0.51), 258 (＋0.82), 272 (－0.98), 305 (＋1.85), 375 (－0.48) nm; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 和13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)见表6; MS (ESI) m/z: 483.2 [M＋H]＋.
7-氧代-3'-N-乙酰holyrine A (13G-31G, 11): 黄色粉末状固体. m.p. 232~35 ℃; $[\alpha]_{\mathrm{D}}^{18}$－30.5 (c 0.2, MeOH); UV (MeOH) λmax: 233, 317, 380 nm; ECD (1.01 mmol/L, MeOH) λmax [Δε/(L•mol－1•cm－1)]: 203 (＋5.24), 222 (－19.6), 251 (－2.13), 275 (－8.46), 305 (＋1.87), 316 (－7.63), 336 (＋5.47) nm; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)和13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)见表6; MS (ESI) m/z: 497.2 [M＋H]＋.
3.5 化合物1、2、8的化学沟通与LC-MS分析
3.5.1 化学沟通
将化合物4 (5 mg, 0.011 mmol)溶于2 mL CH2Cl2中, 在－20 ℃下依次缓慢加入溶于1 mL CH2Cl2中的三光气(BTC, 4.8 mg, 0.16 mmol)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA, 0.01 mL, 0.66 mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP, 6.7 mg, 0.055 mmol). 室温下搅拌反应12 h后, 加入碳酸氢铵(43 mg•mL－1, 0.55 mmol), 在40 ℃下反应2 h至反应完成. 然后加入100 mL乙酸乙酯, 用水洗涤(20 mL×3), 将乙酸乙酯层减压浓缩后得到中间体1a(图4, m/z 510.1 [M＋H]＋). 中间体1a未经进一步纯化, 直接溶于1 mL DMSO中, 加入叔丁醇钾(t-BuOK, 12.3 mg, 0.11 mmol), 室温反应12 h, 直到TLC检测反应完全. 然后加入100 mL乙酸乙酯, 用水洗涤(20 mL×3), 将乙酸乙酯层减压浓缩后, 通过半制备高效液相色谱[YMC-pack ODS-A, 10 mm×250 mm, V(MeCN)∶V(H2O)=1∶1]分离, 得到黄色固体化合物1 (tR=24.5 min, 3.2 mg, 收率57.1%).
将化合物4 (5.0 mg, 0.011 mmol)溶于3 mL CH2Cl2中, 依次加入DMAP (13.1 mg, 0.11 mmol)和甲磺酸酐(Ms2O, 5.6 mg, 0.033mmol), 室温下反应1 h至TLC检测反应完毕. 向反应液中加入5 mL CH2Cl2萃取反应产物, 减压浓缩CH2Cl2相得到粗提物, 用半制备高效液相色谱[YMC-pack ODS-A, 10 mm×250 mm, V(MeCN)∶V(H2O)=48∶52]分离, 得到化合物2 (2.9 mg, tR 42.5 min, 收率48.5%).
取化合物4 (200 mg, 0.42 mmol)溶于10 mL的MeOH/CH2Cl2 (V∶V=1∶1)溶液中, 分别依次加入钨酸钠(566.5 mg, 1.72 mmol)和双氧水(1.3 mL, 12.9 mmol), 室温下避光搅拌反应2 h至反应完全. 然后, 在－20 ℃下用饱和亚硫酸氢钠水溶液淬灭反应. 加入乙酸乙酯(600 mL), 乙酸乙酯层用水洗涤(100 mL×4)后减压浓缩至干. 所得浸膏重新溶于3 mL吡啶中, 加入盐酸羟胺(43.8 mg, 0.63 mmol), 室温搅拌反应0.5 h至反应结束, 加入600 mL乙酸乙酯. 乙酸乙酯层用水洗涤(300 mL×4)后减压浓缩至干, 所得浸膏经过半制备HPLC分离纯化[V(乙腈)∶V(酸水)=55∶45, 4 mL/min], 得到白色粉末状固体TAN-1030A (8a) (tR=16.8 min, 186.4 mg, 收率95.2%). $[\alpha]_{\mathrm{D}}^{18}$－12.0 (c 0.05, THF), －6.4 (c 0.025, MeOH); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 2.43 (s, 3H, H-6'), 2.97 (dd, J=5.8, 14.0 Hz, 1H, H-2'a), 3.39 (s, 3H, 4'-OCH3), 3.60 (t, J=14.0 Hz, 1H, H-2'b), 4.69 (s, 1H, H-4'), 4.94 (dd, J=17.9, 20.6 Hz, 1H, H-7), 7.00 (d, J=5.8 Hz, 1H, H-1'), 7.28 (dd, J=7.9, 7.6 Hz, 1H, H-9), 7.31 (dd, J=7.4, 7.6 Hz, 1H, H-3), 7.41 (dd, J=7.6, 8.5 Hz, 1H, H-10), 7.47 (dd, J=8.3, 7.4 Hz, 1H, H-2), 7.76 (d, J=8.3 Hz, 1H, H-1), 7.95 (d, J=8.5 Hz, 1H, H-11), 7.98 (d, J=7.9 Hz, 1H, H-8), 8.55 (s, 1H, H-6), 9.29 (d, J=7.6 Hz, 1H, H-4), 10.45 (s, 1H, 3'-NOH); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 29.2 (CH3, C-6'), 30.4 (CH2, C-2'), 46.0 (CH2, C-7), 59.0 (CH3, 4'-OCH3), 82.8 (CH, C-1'), 84.2 (CH, C-4'), 96.8 (C, C-5'), 109.6 (CH, C-1), 114.7 (C, C-7b), 115.6 (C, C-4b), 116.3 (CH, C-11), 119.8 (C, C-4c), 120.2 (CH, C-3), 120.8 (CH, C-8), 121.4 (CH, C-9), 123.5 (C, C-4a), 124.4 (C, C-7c), 125.2 (CH, C-2), 125.3 (CH, C-10), 125.9 (CH, C-4), 126.3 (C, C-12b), 128.7 (C, C-12a), 133.0 (C, C-7a), 136.6 (C, C-13a), 140.5 (C, C-11a), 145.8 (C, C-3'), 172.5 (C, C-5); ESIMS m/z 467.2 [M＋H]＋.
取化合物8a (30 mg, 0.064 mmol)溶于3 mL二氧六环中, 加入浓硫酸(0.034 mL, 0.64 mmol), 于100 ℃下搅拌反应1 h至反应结束. 在－20 ℃下加入无水碳酸钠调节pH 7~8, 加入200 mL乙酸乙酯, 乙酸乙酯溶液用水洗涤(40 mL×4)后减压浓缩至干. 所得浸膏通过半制备HPLC分离纯化[V(乙腈)∶V(酸水)=45∶55, 4 mL/min], 得到白色粉末状固体3'-氨基-3'-去氧K252a (8b, tR=10.6 min, 18.5 mg, 收率61.6%). $[\alpha]_{\mathrm{D}}^{18}$＋26.5 (c 0.05, THF); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 2.05 (dd, J=5.5, 14.1 Hz, 1H, H-2'a), 2.11 (s, 3H, H-6'), 2.23 (s, 2H, 3'-NH2), 3.31 (dd, J=7.6, 14.1 Hz, 1H, H-2'b), 3.91 (s, 3H, 5'-OCH3), 5.01 (dd, J=17.6, 32.0 Hz, 1H, H-7), 7.12 (dd, J=5.5, 7.6 Hz, 1H, H-1'), 7.28 (dd, J=7.4, 8.1 Hz, 1H, H-3), 7.35 (dd, J=7.8, 8.5 Hz, 1H, H-9), 7.47 (dd, J=7.8, 8.2 Hz, 1H, H-10), 7.47 (dd, J=7.8, 7.4 Hz, 1H, H-2), 7.89 (d, J=8.2 Hz, 1H, H-11), 8.05 (d, J=7.8 Hz, 1H, H-1), 8.11 (d, J=8.5 Hz, 1H, H-8), 8.67 (s, 1H, H-6), 9.21 (d, J=8.1 Hz, 1H, H-4); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 22.5 (CH3, C-6'), 42.5 (CH2, C-2'), 45.1 (CH2, C-7), 52.4 (CH3, 5'-OCH3), 71.8 (C, C-3'), 84.6 (CH, C-1'), 100.3 (C, C-4'), 108.6 (CH, C-1), 114.2 (C, C-7b), 114.6 (CH, C-11), 115.3 (C, C-4b), 119.0 (CH, C-3), 119.1 (C, C-4c), 120.0 (CH, C-9), 120.8 (CH, C-8), 122.1 (C, C-4a), 123.7 (C, C-12b), 123.8 (C, C-7c), 124.7 (CH, C-10), 125.0 (CH, C-2), 125.2 (CH, C-4), 128.2 (C, C-12a), 132.5 (C, C-7a), 136.3 (C, C-13a), 139.6 (C, C-11a), 171.4 (C, C-5), 173.0 (C, C-5'); MS (ESI) m/z: 467.2 [M＋H]＋.
取化合物8b (1 mg, 0.002 mmol)溶于1 mL甲醇中, 室温下加入氰基硼氢化钠(NaBH3CN, 1.3 mg, 0.02 mmol)和甲醛(0.001mL, 0.012 mmol), 搅拌反应0.5 h至反应结束. 之后, 向反应体系中加入30 mL乙酸乙酯, 所得溶液用水洗涤(5 mL×4), 分出乙酸乙酯层. 将乙酸乙酯层减压浓缩至干, 所得浸膏经过半制备HPLC分离纯化[V(乙腈)∶V(酸水)=50∶50, 4 mL/min], 得到白色固体8 (tR=12.8 min, 0.9 mg, 收率87.4%).
3.5.2 LC-MS分析
将上述所合成的化合物1、2和8分别与分离鉴定的天然产物1、2和8进行手性LC-MS混合针分析, LC-MS条件为: 手性色谱柱(Chiral INA、4.6 mm×250 mm), 洗脱溶剂MeCN/H2O (0~15 min: V∶V 10∶90~100∶0, 15~20 min: V∶V 100∶0, 20~25 min: V∶V 100∶0~10∶90), 流速1 mL/min, 质谱检测: 正离子ESI m/z 524.1(化合物1)、545.1(化合物2)、481.2(化合物8). 结果表明, 天然产物1、2和8分别与所合成化合物1、2和8为同一化合物(图4), 即7-氧代-3'-N-氨甲酰基十字孢碱(1)、3'-N-甲磺酰基十字孢碱(2)和3'-甲氨基-3'-去氧K252a (8).
3.6 化合物活性测试
制备菌悬液: 从固体培养基上挑选活力较好的8株人体致病菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、副伤寒杆菌(Paratyphoidfever)及结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和8株水产致病细菌迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)及苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis), 并将其接种于无菌的LB培养基中; 挑选2株人体致病真菌白色念珠菌(Canidia albicans)和光滑假丝酵母菌(Candida glabrata)接种于无菌的YPD培养基中. 每株菌对应培养基的装液量均为20/50 mL(配方见表8), 在28 ℃、180 r/min条件下摇床培养12 h, 至菌液呈现明显浑浊. 用0.22 μm的无菌微孔滤膜过滤培养基, 以对应的培养基将培养好的菌液稀释1000倍, 备用.
样品配置: 用细胞级二甲基亚砜(DMSO)将待测化合物和阳性药(细菌用环丙沙星、真菌用酮康唑)配制成0.64 μg•mL－1的溶液, 备用.
加样: 实验设置了空白对照(纯培养基200 μL)、阳性对照(稀释的菌悬液100 μL、培养基90 μL和阳性药10 μL)、阴性对照(稀释的菌悬液100 μL、培养基90 μL和细胞级DMSO 10 μL)和测试组(稀释的菌悬液100 μL、培养基90 μL和待测化合物溶液10 μL), 此时化合物的浓度为32 μg•mL－1, 每组设置3个平行复孔.
抑菌活性初筛: 按照上述加样方法, 将阳性药和待测化合物配置成32 μg•mL－1的浓度, 加入装有菌液的96孔板中, 在28 ℃恒温培养箱内静置培养24 h后, 如观察到培养基澄清且没有菌株生成, 即代表该浓度下化合物具有抑菌作用.
微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度(MIC): 对于初筛中显示抑菌作用的化合物, 在96孔板中相应的培养基进行连续二倍稀释, 将待测化合物的浓度依次稀释至32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg•mL－1. 每个孔中再加入合适菌液, 在28 ℃恒温培养箱内静置培养24 h后, 观察菌液由浑浊变为澄清的第一个浓度梯度, 即为化合物的MIC.
辅助材料(Supporting Information) 化合物1~11、8a和8b的谱图数据、质谱数据及部分化合物的ECD数据. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.
(Zhao, C.)