苯磺酰哌嗪类化合物的合成及活性研究

刘江钰; 刘洪涛; 巫晔翔; 张国盛; 王玉杰; 张煜皓; 雷丽娟; 许艳妮; 李文燕

doi:10.6023/cjoc202409007

有机化学 >

2025 , Vol. 45 >Issue 7: 2406 - 2415

DOI: https://doi.org/10.6023/cjoc202409007

研究论文

苯磺酰哌嗪类化合物的合成及活性研究

刘江钰 ^a^,^† ,
刘洪涛 ^b^,^c^,^† ,
巫晔翔 ^d ,
张国盛 ^a ,
王玉杰 ^a ,
张煜皓 ^d ,
雷丽娟 ^d ,
许艳妮 ^,^d^,^* ,
李文燕 ^,^a^,^*

展开

^a 河北师范大学化学与材料科学学院河北省有机功能分子重点实验室石家庄 050024
^b 河北医科大学第一医院药剂科石家庄 050000
^c 河北省人民医院临床医学研究中心石家庄 050017
^d 中国医学科学院医药生物技术研究所国家新药(微生物)筛选实验室北京 100050

^† 共同第一作者

收稿日期: 2024-11-08

修回日期: 2025-02-28

网络出版日期: 2025-03-10

基金资助

河北省自然科学基金(H2022307031)

河北省自然科学基金(H2024205002)

河北省科技厅省级重点实验室绩效补助经费(22567622H)

收起

Synthesis and Activity of Benzenesulfonyl Piperazines

Jiangyu Liu ^a ,
Hongtao Liu ^b^,^c ,
Yexiang Wu ^d ,
Guosheng Zhang ^a ,
Yujie Wang ^a ,
Yuhao Zhang ^d ,
Lijuan Lei ^d ,
Yanni Xu ^,^d^,^* ,
Wenyan Li ^,^a^,^*

Expand

^a Hebei Key Laboratory of Organic Functional Molecules, College of Chemistry and Materials Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024
^b Department of Pharmacy, the First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000
^c Clinical Medical Research Center, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050017
^d National Laboratory for Screening of New Drugs (Microbial), Institute of Medical Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050

*E-mail: xuyanniwendeng@hotmail.com;

wyli8512@mail.hebtu.edu.cn

^† These authors contributed equally to this work

Received date: 2024-11-08

Revised date: 2025-02-28

Online published: 2025-03-10

Supported by

Natural Science Foundation of Hebei Province(H2022307031)

Natural Science Foundation of Hebei Province(H2024205002)

Project of Science and Technology Department of Hebei Province(22567622H)

Fold

摘要

腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)结合盒转运蛋白A1 (ABCA1)是胆固醇逆转运(RCT)中介导巨噬细胞胆固醇和其它亲脂性物质外流的关键蛋白, 是RCT的起始和限速步骤. 提高ABCA1的表达水平有利于抑制和延缓动脉粥样硬化(AS), 合成了一类含有苯磺酰哌嗪骨架的化合物, 并对其ABCA1上调表达活性进行了评价. 其中5-[4-(2,6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪甲基]-2-呋喃甲酸(4b)和2-[4-(2,6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪基]噻唑-5-甲酸(4c)对ABCA1的最高上调表达率可达308%和223%, EC₅₀值分别为0.03和0.008 μmol/L, 是良好的ABCA1上调表达剂. 同时对此类化合物的构效关系也进行了简单的总结.

关键词： 动脉粥样硬化; 腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)结合盒转运蛋白A1 (ABCA1); ABCA1上调表达剂; 苯磺酰哌嗪

本文引用格式

刘江钰 , 刘洪涛 , 巫晔翔 , 张国盛 , 王玉杰 , 张煜皓 , 雷丽娟 , 许艳妮 , 李文燕 . 苯磺酰哌嗪类化合物的合成及活性研究[J]. 有机化学, 2025 , 45(7) : 2406 -2415 . DOI: 10.6023/cjoc202409007

Abstract

Adenosine triphosphate (ATP) binding cassette transporter A1 (ABCA1) is a critical transporter that mediates cellular cholesterol and other lipophilic substances efflux from macrophages in reverse cholesterol transport (RCT). ABCA1 is the initiation and rate-limiting step of RCT. Therefore, increasing the expression level of ABCA1 is beneficial to inhibit and delay atherosclerosis (AS). ABCA1 expression up-regulator is expected to be a new method for the treatment of AS. A class of compounds containing benzenesulfonyl piperazine skeleton were synthesized and their up-regulated expression activities of ABCA1 were evaluated based on ABCA1-promoter-luc-HepG2 stable transfection cell model. Among them, 5-(4-(2,6- dichlorophenylsulfonyl)-1-piperazinomethyl)-2-furancarboxylic acid (4b) and 2-(4-(2,6-dichlorophenylsulfonyl)-1-piperazi- nyl)thiazole-5-carboxylic acid (4c) had the highest up-regulated expression rates of 308% and 223%, and the EC₅₀ values were 0.03 and 0.008 μmol/L, respectively. They were good up-regulated expression agents of ABCA1. The structure-activity relationship of these compounds was also briefly summarized.

Key words： atherosclerosis; adenosine triphosphate (ATP) binding cassette transporter A1 (ABCA1); ABCA1 up-regulated expression agent; benzenesulfonyl piperazine

心血管疾病(CVD)是全球范围内最主要死亡原因, 严重威胁人类健康安全^[1-2]. 动脉粥样硬化(AS)是CVD的主要病理基础, 血浆中的高密度脂蛋白(HDL)可通过多种机制去除机体中多余的胆固醇, 从而延缓甚至逆转AS的发展进程^[3-5]. HDL发挥抗AS作用的主要机制是通过胆固醇逆运转(RCT)将外周组织细胞中多余的胆固醇转运至肝脏, 并以胆汁酸的形式排出体外^[6-7]. 因此, 促进RCT循环有利于提高血浆HDL水平, 从而达到治疗AS的目的.

ATP结合盒转运蛋白A1 (ABCA1)是RCT循环中介导巨噬细胞胆固醇和其他亲脂性物质外流到细胞外载脂蛋白A1 (Apo A1), 从而形成HDL的关键蛋白, 是RCT的起始和限速步骤^[8-10]. 研究表明, ABCA1的过表达具有促进巨噬细胞中胆固醇的外排和抗炎作用, 抵消了AS的两个关键驱动因素^[11]. 丹吉尔病是由ABCA1基因的致病性变异引起的, 功能丧失的ABCA1变异导致ABCA1合成或活性降低, 并表现出胆固醇外排能力降低, 引起动脉粥样硬化性心血管疾病发病率增加^[12-13]. ABCA1已确定为治疗心血管疾病的潜在靶点, 提高ABCA1的表达有利于预防和治疗AS.

本课题组^[14]前期研究发现了一类苯磺酰哌嗪类化合物具有较好的ABCA1上调表达活性, 且哌嗪环4-位取代基团对活性影响较大. 本工作对哌嗪4位大体积取代基团进行了研究, 着重考察苯环和杂环及其上取代基对活性的影响, 设计合成了27个苯磺酰哌嗪类衍生物(图1), 并对其ABCA1上调表达活性进行了评价.

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图1 苯磺酰哌嗪类化合物的结构

Figure 1 Structures of benzenesulfonyl piperazines

1 结果与讨论

1.1 目标化合物的合成

化合物3a~3j、4a~4f合成如Scheme 1所示, 取代的苯磺酰氯与1-叔丁氧羰基哌嗪在吡啶催化下发生磺酰化反应得到中间体1a, 1b, 再用三氟乙酸脱去Boc保护基得到中间体2a, 2b. 中间体2a, 2b分别与不同的取代单杂环卤代化合物反应得到目标化合物3a~3j, 部分化合物再经水解得到对应的酸4a~4f. 化合物7a~7f、8a~8e的合成如Scheme 2所示, 4-溴苯甲酸乙酯与1-叔丁氧羰基哌嗪在Pd(OAc)₂/1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(BINAP)/Cs₂CO₃体系催化下反应得到中间体5. 再以四氢呋喃(THF)为溶剂, 浓H₂SO₄为催化剂, N-氯代丁二酰亚胺(NCS)或N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)与中间体5在低温下反应得到3位氯或溴取代的中间体6, 最后用不同取代基的苯磺酰氯酰化得到目标化合物7a~7f, 部分化合物进一步水解得到酸8a~8e.

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图式1 化合物3a~3j和4a~4f的合成

Scheme 1 Synthesis of compounds 3a~3j and 4a~4f

Reaction conditions: (i) pyridine, THF; (ii) TFA, DCM; (iii) TEA, DCM; (iv) Cs₂CO₃, DMF, 120 ℃; (v) THF, 10% NaOH, EtOH, 60 ℃.

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图式2 化合物7a~7f, 8a~8e的合成

Scheme 2 Synthesis of compounds 7a~7f, 8a~8e

Reaction conditions: (i) Pd(OAc)₂, BINAP, Cs₂CO₃, toluene, 100 ℃; (ii) THF, conc. H₂SO₄, NBS, －25 ℃/NCS, 40 ℃; (ⅲ) DCM, TFA, r.t.; (ⅳ) 2,6-dichlorobenzene sulfonyl chloride or 2,6-difluorobenzene sulfonyl chloride, THF, pyridine; (ⅴ) THF, aq. NaOH (ω=10%), EtOH, 60 ℃.

1.2 目标化合物的活性评价

首先在含ABCA1启动子的荧光素酶报告基因的HepG2细胞(ABCA1-promoter-luc-HepG2)的稳定转染细胞模型中测定化合物的ABCA1上调表达率, 并对最高上调表达率大于150%的化合物进行了EC₅₀值的测定^[15], 结果如表1所示. 测试的27个目标化合物中有16个化合物对ABCA1的最高上调表达率大于150%, 具有明显的ABCA1上调表达活性. 其中化合物3d、4b~4e、7d~7e、8d~8e等9个化合物上调表达率大于200%, 优于对照化合物4-氨基-N-(6-氯苯并噻唑-2-基)-N-(氰甲基)苯磺酰胺(6i)^[16]. 化合物4b和4c具有良好的量效关系, EC₅₀值分别达到0.03和0.008 μmol/L. 对酯(3a~3j, 7a~7f)和羧酸(4a~4f, 8a~8e)两种形式的目标化合物进行了评价, 从表1可以看出羧酸形式的化合物, 如4a~4e活性均明显优于其相应的酯类化合物3a、3e、3g~3i, 这可能与羧基和靶标之间的直接相互作用有关, 酯类前体的优势可能在整体动物实验中才能显现, 但这一现象在苯环与哌嗪环直接相连的化合物7a~8e中并不明显, 可能与其溶解度不佳导致透膜率较差有关. 将哌嗪环4-位用苯环取代得到化合物3a~3d、4a、7a~7f和8a~8e, 用噻唑或呋喃环取代得到化合物3e~3j、4b~4f. 由活性结果来看杂环取代的化合物(如4b~4e)活性普遍优于苯环取代的化合物(如4a、8a等), 但若在苯环3位引入卤素取代基, 可使活性明显改善(如8d~8e). 实验中还发现在目标化合物磺酰苯环上引入2,6-二氟取代, 活性仍可保持, 2,6-二氟取代基和2,6-二氯取代基能发挥相似作用, 可以相互替换.

表1 目标化合物的ABCA1上调表达活性

Table 1 ABCA1 upregulatory activity of target compounds

Compd.	Highest up-regulated expression rate/%	EC₅₀/(μmol•L^－1)
3a	105±8	—
3b	142±5	—
3c	129±3	—
3d	210±2	0.40±0.14
3e	198±1	0.15±0.09
3f	179±6	0.58±0.21
3g	137±4	—
3h	145±3	—
3i	150±1	—
3j	117±2	—
4a	182±1	4.19±0.17
4b	308±1	0.03±0.01
4c	223±1	0.008±0.001
4d	201±6	0.17±0.06
4e	227±5	0.11±0.04
4f	140±4	—
7a	169±3	10.18±0.18
7b	179±2	17.54±0.39
7c	172±8	6.98±0.11
7d	212±2	11.47±0.32
7e	203±4	4.89±0.71
7f	145±7	—
8a	146±2	—
8b	129±3	—
8c	164±2	32.25±1.86
8d	215±1	0.14±0.03
8e	210±5	3.73±0.19
6i	200±6	0.41±0.05

为进一步验证化合物对ABCA1基因表达的影响, 采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)考察了优选化合物4b和4c对RAW264.7细胞中ABCA1 mRNA表达的影响(图2). 结果显示化合物4b和4c在10 μmol/L浓度下能显著增加RAW264.7细胞中ABCA1 mRNA的表达水平. 其中化合物4b组细胞的mRNA表达量是空白对照组的3.81倍, 4c组细胞的mRNA表达量是空白对照组的2.54倍, 二者均为ABCA1的高效基因表达上调剂.

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图2 化合物4b和4c对RAW264.7细胞中ABCA1 mRNA表达的影响

Figure 2 Effects of compounds 4b and 4c on ABCA1 mRNA expression in RAW264.7 cells

ABCA1介导巨噬细胞胆固醇外流到细胞外载脂蛋白, 因此其基因表达上调剂可促进巨噬细胞内胆固醇的流出. 为验证化合物4b和4c对细胞胆固醇流出的影响, 以bodipy-cholesterol为探针, 激光共聚焦法检测了RAW264.7细胞中胆固醇的流出(图3). 模型组用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导RAW264.7细胞, 可观察到细胞内有明显的脂质堆积(绿色), 而与模型组相比, 经化合物4b和4c处理的细胞胆固醇(绿色)水平明显降低, 这表明, 化合物4b和4c可以显著促进巨噬细胞中胆固醇的流出. 同时我们还用油红O染色观察了细胞内脂质的积累情况, 化合物4b和4c组细胞内脂质(红色)含量明显少于模型组(图4). 因此可以判断化合物4b和4c能明显促进巨噬细胞内胆固醇的流出.

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图3 化合物4b和4c对RAW264.7细胞胆固醇流出的影响

Figure 3 Effects of compounds 4b and 4c on cholesterol efflux in RAW264.7 cells

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图4 化合物4b和4c的油红O染色实验

Figure 4 Oil red O staining experiment of compounds 4b and 4c

2 结论

设计并合成了27个苯磺酰哌嗪类化合物, 并对其ABCA1上调表达活性进行了评价, 发现其中9个化合物的活性优于对照化合物6i, 尤其是化合物4b和4c, 最高上调表达率可达308%和223%, EC₅₀值分别为0.03和0.008 μmol/L. 化合物4b和4c在10 μmol/L浓度下能显著增加RAW264.7细胞中ABCA1 mRNA的表达水平, 且可有效促进巨噬细胞内胆固醇的流出. 4b和4c是ABCA1的高效基因表达上调剂, 有进一步研究价值.

3 实验部分

3.1 仪器与试剂

中科牛津WNMR-I 400MHz核磁共振波谱仪; 安捷伦1290 Infinity II-6545高分辨质谱仪; 柱层析硅胶(300~400目)购自中国青岛海洋化工厂(青岛, 中国); RY-1G熔点仪(天津光学仪器厂); DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市创远仪器制造有限公司); EYELA型旋转蒸发仪(东京理化器械独资工厂); 101-OAB型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司). 所用试剂均为市售分析纯或化学纯, 化学反应所用原料购买自北京伊诺凯科技有限公司.

3.2 合成方法

3.2.1 化合物1的合成

将1-叔丁氧羰基哌嗪(1.14 g, 6.11 mmol)溶入20 mL THF, 再将吡啶(9.28 mL, 117.32 mmol)和2,6-二氯苯磺酰氯(3.29 mL, 40.73 mmol)分三次加入反应液中, 在室温条件下反应, 由薄层色谱(TLC)监测反应进程. 反应结束后, 减压蒸馏除去THF, 向反应液中加入20 mL蒸馏水, 用乙酸乙酯萃取(20 mL×3), 合并有机相, 依次用水、饱和食盐水洗涤, 无水MgSO₄干燥. 抽滤, 滤液减压浓缩, 得到黄色油状化合物1a 1.34 g, 产率为83.0%. 得到的粗品未经纯化直接投入下步反应.

化合物1b的合成方法与化合物1a相同, 也是将得到的粗品未经纯化直接投入下一步反应. 化合物1b的粗品产率为81.7%.

3.2.2 化合物2的合成

将4-(2,6-二氯苯磺酰基)哌嗪甲酸叔丁酯(1.00 g, 2.53 mmol)溶于10 mL CH₂Cl₂中, 向反应瓶中加入三氟乙酸(TFA, 2.73 mL, 35.42 mmol), 室温搅拌, TLC检测反应进程. 反应结束后, 冰浴条件下用饱和Na₂CO₃水溶液调节pH至中性. 用CH₂Cl₂萃取(20 mL×3), 合并有机相, 依次用水、饱和食盐水洗涤, 无水MgSO₄干燥. 抽滤, 滤液减压浓缩, 得粗产品黄棕色油状化合物0.70 g, 产率为94.0%. 得到的粗品未经纯化直接投入下步反应.

化合物2b的合成方法与化合物2a相同, 也是得到的粗品未经纯化直接投下一步反应. 化合物2b的粗品产率为83.6%.

3.2.3 化合物3a, 3b和3e~3j的合成

将4-溴甲基苯甲酸甲酯(0.52 g, 2.26 mmol)溶于5 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中, 加入Cs₂CO₃ (1.47 g, 4.52 mmol), 再将1-(2,6-二氯苯磺酰基)哌嗪(0.83 g, 3.39 mmol)加入至反应液中, 将温度升至120 ℃, TLC监测反应进程. 反应完全后, 向反应液中加入20 mL蒸馏水, 用乙酸乙酯萃取(20 mL×3), 依次用蒸馏水、饱和食盐水洗涤, 有机相用无水MgSO₄干燥. 抽滤, 滤液减压浓缩, 柱层析分离提纯, 得到0.76 g白色粉末固体3a, 收率为75.6%. 以同样的方法合成化合物3b, 3e~3j.

4-[6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪甲基]苯甲酸甲酯(3a): m.p. 226~227 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.02 (d, J=6.2 Hz, 2H), 7.66 (s, 2H), 7.44 (d, J=7.8 Hz, 2H), 7.33 (t, J=7.9 Hz, 1H), 4.11 (s, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.78 (s, 4H), 3.02 (s, 4H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 166.14, 135.49, 134.24, 133.30, 132.02, 131.94, 131.72, 130.51, 60.63, 52.49, 51.71, 42.86; HRMS calcd for C₁₉H₂₁Cl₂N₂O₄S [M＋H]^＋ 443.0594, found 443.0593.

4-[6-二氟苯磺酰基)-1-哌嗪甲基]苯甲酸甲酯(3b): 白色粉末固体, 收率为76.3%. m.p. 164~165 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.97 (d, J=7.6 Hz, 2H), 7.58~7.48 (m, 1H), 7.35 (d, J=7.2 Hz, 2H), 7.04 (t, J=8.8 Hz, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.56 (s, 2H), 3.28 (s, 4H), 2.55 (s, 4H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 167.00, 159.93 (dd, J₁=259.2 Hz, J₂=3.9 Hz), 142.92 (d, J=9.0 Hz), 134.86 (t, J=10.9 Hz), 129.82, 129.41, 129.01, 114.98, 113.35 (dd, J₁=24.0 Hz, J₂=3.4 Hz), 62.27, 52.36, 52.23, 45.72; HRMS calcd for C₁₉H₂₁F₂N₂O₄S [M＋H]^＋411.1185, found 411.1181.

5-[6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪甲基]-2-呋喃甲酸甲酯(3e): 白色粉末固体, 收率为70.2%. m.p. 104~106 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.46 (s, 1H), 7.44 (s, 1H), 7.33~7.26 (m, 1H), 7.11 (d, J=4.0 Hz, 1H), 6.33 (d, J=4.0 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.62 (s, 2H), 3.43 (s, 4H), 2.56 (s, 4H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 159.04, 155.63, 144.20, 135.70, 134.70, 132.53, 131.72, 118.80, 111.14, 54.55, 52.34, 51.92, 45.60; HRMS calcd for C₁₇H₁₉Cl₂N₂O₅S [M＋H]^＋ 433.0386, found 433.0386.

5-[6-二氟苯磺酰基)-1-哌嗪甲基]-2-呋喃甲酸甲酯(3f): 白色粉末固体, 收率为85.6%. m.p. 179~180 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.57~7.47 (m, 1H), 7.10 (d, J=3.2 Hz, 1H), 7.02 (t, J=8.8 Hz, 2H), 6.32 (d, J=2.4 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.61 (s, 2H), 3.27 (s, 4H), 2.60 (s, 4H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 159.94 (dd, J₁=259.3 Hz, J₂=3.7 Hz), 159.13, 155.74, 144.33, 134.89 (t, J=11.1 Hz), 118.88, 114.88, 113.34 (dd, J₁=24.1 Hz, J₂=3.5 Hz), 111.23, 54.52, 52.04, 45.66; HRMS calcd for C₁₇H₁₉F₂N₂O₅S [M＋H]^＋ 401.0977, found 401.0977.

2-[6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪基]噻唑-4-甲酸甲酯(3g): 白色粉末固体, 收率为75.3%. m.p. 158~160 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.85 (s, 1H), 7.48 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.35 (t, J=8.0 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.71~3.66 (m, 4H), 3.58~3.53 (m, 4H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 174.17, 162.33, 147.72, 135.85, 134.58, 133.02, 131.96, 117.55, 52.13, 48.38, 44.96; HRMS calcd for C₁₅H₁₆O₄Cl₂N₃S₂ [M＋H]^＋ 435.9954, found 435.9925.

2-[6-二氟苯磺酰基)-1-哌嗪基]噻唑-4-甲酸甲酯(3h): 白色粉末固体, 收率为83.7%. m.p. 198~200 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.83 (s, 1H), 7.59~7.49 (m, 1H), 7.04 (t, J=8.8 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.73~3.68 (m, 4H), 3.43~3.37 (m, 4H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 174.08, 162.30, 159.82 (dd, J₁=259.5 Hz, J₂=4.0 Hz), 147.88, 135.27 (t, J=11.0 Hz), 117.61, 115.08 (t, J=16.3 Hz), 113.49 (dd, J₁=23.9 Hz, J₂=3.5 Hz), 52.08, 47.99, 44.87; HRMS calcd for C₁₅H₁₆O₄F₂N₃S₂ [M＋H]^＋ 404.0545, found 404.0540.

2-[6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪基]噻唑-5-甲酸乙酯(3i): 白色粉末固体, 收率为84.3%. m.p. 138~140 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.47 (d, J=5.4 Hz, 3H), 7.34 (t, J=8.0 Hz, 1H), 4.33 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.62 (d, J=4.9 Hz, 4H), 3.54 (d, J=4.8 Hz, 4H), 1.35 (t, J=7.1 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 170.44, 161.65, 144.13, 135.80, 134.66, 132.92, 131.92, 117.25, 61.33, 48.52, 45.02, 14.43; HRMS calcd for C₁₆H₁₇Cl₂N₃- O₄S₂Na [M＋Na]^＋ 471.9930, found 471.9942.

2-[6-二氟苯磺酰基)-1-哌嗪基]噻唑-5-甲酸乙酯(3j): 白色粉末固体, 收率为82.6%. m.p. 178~180 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.53 (dq, J=8.4, 5.9 Hz, 1H), 7.47 (s, 1H), 7.04 (t, J=8.7 Hz, 2H), 4.33 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.70~3.63 (m, 4H), 3.43~3.36 (m, 4H), 1.35 (t, J=7.1 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 170.25, 161.60, 159.83 (dd, J₁=260.6 Hz, J₂=4.0 Hz), 144.11, 135.17 (t, J=11.1 Hz), 117.28, 114.62, 113.46 (dd, J₁=24.1 Hz, J₂=3.5 Hz), 61.34, 48.23, 44.97, 14.42; HRMS calcd for C₁₆H₁₇F₂N₃O₄S₂Na [M＋Na]^＋ 440.0521, found 440.0525.

3.2.4 化合物3c和3d的合成

将三乙胺(0.41 mL, 4.89 mmol)加入到1-(2,6-二氯苯磺酰基)哌嗪(0.4 g, 1.63 mmol)的CH₂Cl₂ (10 mL)溶液中, 然后加入4-氯甲酰基苯甲酸甲酯(0.42 g, 2.12 mmol), 于室温下反应. 反应结束后, 加入10 mL蒸馏水, 用乙酸乙酯萃取(10 mL×3), 合并有机相, 用无水Na₂SO₄干燥, 经柱层析分离得到0.62 g白色粉末固体3c, 收率为84.3%. 以相同的方法合成化合物3d.

4-(4-((2,6-二氯苯基)磺酰基)哌嗪-1-羰基)苯甲酸甲酯(3c): m.p. 133~134 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.07 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.45 (dd, J=13.4, 8.0 Hz, 4H), 7.38~7.32 (m, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.86 (s, 2H), 3.44 (d, J=37.5 Hz, 6H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 169.63, 166.26, 139.26, 135.82, 134.54, 132.98, 131.93, 131.72, 130.09, 127.18, 52.52, 47.74, 45.93, 42.37; HRMS calcd for C₁₉H₁₉Cl₂N₂O₅S [M＋H]^＋ 457.0386, found 457.0370.

4-(4-((2,6-二氟苯基)磺酰基)哌嗪-1-羰基)苯甲酸甲酯(3d): 白色粉末固体, 收率为80.8%. m.p. 181~182 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.08 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.61~7.52 (m, 1H), 7.43 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.06 (t, J=8.8 Hz, 2H), 3.94 (s, 5H), 3.53 (s, 2H), 3.37 (s, 2H), 3.24 (s, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 169.61, 166.25, 159.82 (dd, J₁=259.3 Hz, J₂=3.9 Hz), 139.09, 135.26 (t, J=11.0 Hz), 131.76, 130.09, 127.21, 115.06 (t, J=16.2 Hz), 113.51 (dd, J₁=23.9 Hz, J₂=3.3 Hz), 52.55, 47.37, 45.59, 41.81; HRMS calcd for C₁₉H₁₉O₅F₂N₂S [M＋H]^＋ 425.0977, found 425.0954.

3.2.5 化合物4的合成

将200 mg 4-[6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪甲基]苯甲酸甲酯溶于5 mL THF溶液中, 加入5 mL质量分数为10%的NaOH水溶液, 搅拌5 min后, 向反应瓶中加入5 mL EtOH, 于60 ℃下反应, TLC监测反应进行, 40 min后结束反应. 减压蒸馏除去混合溶剂, 冰浴条件下用1 mol/L HCl的水溶液调节剩余反应液的pH至酸性, 有大量白色固体析出. 减压抽滤, 蒸馏水洗涤滤饼, 滤饼经真空干燥后得到0.17 g白色粉末固体4a, 收率为90.0%. 以相同的方法制备了化合物4b~4f.

4-[6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪甲基]苯甲酸(4a): m.p. 246~247 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.17 (s, 1H), 8.02 (d, J=8.0 Hz, 3H), 7.76 (d, J=8.0 Hz, 3H), 7.69~7.65 (m, 1H), 4.46 (s, 2H), 3.92 (s, 4H), 3.14 (s, 4H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 167.36, 135.00, 134.84, 133.82, 132.70, 131.95, 129.99, 51.04, 42.88; HRMS calcd for C₁₈H₁₉Cl₂N₂O₄S [M＋H]^＋ 429.0437, found 429.0453.

5-[6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪甲基]-2-呋喃甲酸(4b): 白色粉末固体, 收率为76.4%. m.p. 242~243 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.69~7.64 (m, 2H), 7.57 (dd, J=8.8, 7.1 Hz, 1H), 7.12 (d, J=3.3 Hz, 1H), 6.46 (d, J=3.3 Hz, 1H), 3.58 (s, 2H), 3.30 (s, 4H), 2.45 (s, 4H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 159.33, 155.50, 144.60, 134.46, 133.95, 133.84, 132.14, 118.23, 111.20, 53.54, 51.62, 45.26; HRMS calcd for C₁₆H₁₇Cl₂N₂O₅S [M＋H]^＋ 419.0230, found 419.0249.

2-[6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪基]噻唑-5-甲酸(4c):白色粉末固体, 收率为82.1%. m.p. 194~196 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.76 (s, 1H), 7.74 (s, 2H), 7.66 (dd, J=12.0, 7.8 Hz, 1H), 3.58~3.60 (m, 4H), 3.51~3.50 (m, 4H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 170.26, 162.59, 144.14, 134.98, 134.08, 132.66, 48.27, 44.95; HRMS calcd for C₁₄H₁₄Cl₂N₃O₄S₂ [M＋H]^＋ 421.9917, found 421.9915.

2-[6-二氟苯磺酰基)-1-哌嗪基]噻唑-5-甲酸(4d): 白色粉末固体, 收率为76.8%. m.p. 235~238 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.89~7.81 (m, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.42 (t, J=9.2 Hz, 2H), 3.63~3.61 (m, 4H), 3.35~3.34 (m, 4H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ 169.46, 162.90, 158.94 (dd, J₁=256.9 Hz, J₂=3.7 Hz), 146.05, 136.47 (t, J=11.1 Hz), 116.55, 113.83 (dd, J₁=23.8 Hz, J₂=2.8 Hz), 113.61, 47.46, 44.54; HRMS calcd for C₁₄H₁₄F₂N₃O₄S₂ [M＋H]^＋ 390.0388, found 390.0406.

2-[6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪基]噻唑-4-甲酸(4e):白色粉末固体, 收率为72.4%. m.p. 158~160 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.83 (s, 1H), 7.75 (d, J=7.8 Hz, 2H), 7.65 (dd, J=8.8, 7.2 Hz, 1H), 3.67~3.65 (m, 4H), 3.52~3.50 (m, 4H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 174.01, 163.03, 134.98, 134.06, 132.79, 132.65, 118.26, 48.07, 44.87; HRMS calcd for C₁₄H₁₄Cl₂- N₃O₄S₂ [M＋H]^＋ 421.9917, found 421.9917.

2-[6-二氟苯磺酰基)-1-哌嗪基]噻唑-4-甲酸(4f):白色粉末固体, 收率为87.5%. m.p. 194~196 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.85 (m, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.41 (t, J=9.2 Hz, 2H), 3.72~3.69 (m, 4H), 3.35~3.33 (m, 4H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 173.09, 162.83, 158.94 (dd, J=257.0, 4.0 Hz), 146.26, 136.45 (t, J=11.3 Hz), 119.59, 113.81 (dd, J=23.8, 3.0 Hz), 113.63, 47.21, 44.42; HRMS calcd for C₁₄H₁₄F₂N₃O₄S₂ [M＋H]^＋ 390.0428, found 390.0408.

3.2.6 化合物5的制备

将4-溴苯甲酸乙酯(1.10 g, 5.48 mmol)溶于2 mL甲苯中, 加入1-叔丁氧羰基哌嗪(1.53 g, 8.38 mmol)和Cs₂CO₃ (3.57 g, 10.96 mmol), 加入微量的Pd(OAc)₂和BINAP, 升温至100 ℃. TLC监测反应进程, 2 h后反应结束, 向反应液中加入20 mL蒸馏水, 用乙酸乙酯萃取(20 mL×3), 依次用蒸馏水、饱和食盐水洗涤, 有机相无水MgSO₄干燥. 抽滤, 滤液减压浓缩, 柱层析分离提纯得到白色粉末固体4-(4-叔丁氧羰基哌嗪)苯甲酸乙酯(5) 1.29 g, 收率为70.6%. m.p. 120~122 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.93 (d, J=8.8 Hz, 2H), 6.86 (d, J=8.8 Hz, 2H), 4.32 (q, J=7.2 Hz, 2H), 3.59~3.57 (m, 4H), 3.30~3.28 (m, 4H), 1.48 (s, 9H), 1.36 (t, J=7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 166.57, 154.67, 153.88, 131.22, 120.80, 114.12, 80.14, 60.44, 47.74, 28.44, 14.45; HRMS calcd for C₁₈H₂₇N₂O₄ [M＋H]^＋ 335.1893, found 335.1892.

3.2.7 化合物6的制备

将4-(4-叔丁氧羰基哌嗪)苯甲酸乙酯(5, 1.20 g, 3.58 mmol)溶于10 mL THF中, 加入催化量的浓H₂SO₄, 将NCS (0.48 g, 3.58 mmol)溶于THF中, 25 ℃下缓慢加入反应液中, 再移至40 ℃反应. TLC进行反应进程的监测, 反应结束后, 减压蒸馏除去THF, 向反应液中加入20 mL蒸馏水, 用乙酸乙酯萃取(20 mL×3), 依次用蒸馏水、饱和食盐水洗涤, 有机层用无水MgSO₄干燥. 蒸干, 柱层析分离得到1.16 g白色固体6a, 收率为87.6%. 以相同方法合成化合物6b.

2-氯-4-(4-叔丁氧羰基哌嗪)苯甲酸乙酯的制备(6a): m.p. 80~82 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.03 (d, J=1.8 Hz, 1H), 7.88 (dd, J=8.4, 1.8 Hz, 1H), 7.00 (d, J=8.4 Hz, 1H), 4.34 (q, J=7.2 Hz, 2H), 3.62~3.59 (m, 4H), 3.08~3.05 (m, 4H), 1.48 (s, 9H), 1.37 (t, J=7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 165.43, 154.80, 152.94, 132.14, 129.24, 128.03, 125.70, 119.69, 79.99, 61.09, 50.83, 28.46, 14.36; HRMS calcd for C₁₈H₂₆ClN₂O₄ [M＋H]^＋ 369.1503, found 369.1516.

2-溴-4-(4-叔丁氧羰基哌嗪)苯甲酸乙酯(6b): 白色固体, 收率为78.3%. m.p. 72~73 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.23 (d, J=1.8 Hz, 1H), 7.93 (dd, J=8.4, 1.8 Hz, 1H), 7.00 (d, J=8.4 Hz, 1H), 4.34 (q, J=7.2 Hz, 2H), 3.63~3.60 (m, 4H), 3.07~3.04 (m, 4H), 1.48 (s, 9H), 1.37 (t, J=7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 165.25, 154.82, 154.34, 135.36, 129.88, 126.28, 120.12, 118.71, 79.97, 61.12, 51.27, 28.46, 14.36; HRMS calcd for C₁₈H₂₆BrN₂O₄ [M＋H]^＋ 413.1076, found 413.1104.

3.2.8 化合物7的合成

将4-(4-叔丁氧羰基哌嗪)苯甲酸乙酯(5, 0.54 g, 1.62 mmol)溶于10 mL THF中, 再将吡啶(1.83 mL, 22.73 mmol)和2,6-二氯苯磺酰氯(0.59 mL, 2.42 mmol)分三次加入反应液中, TLC监测反应进程. 反应结束后, 向反应液中加入20 mL蒸馏水, 用乙酸乙酯萃取(20 mL×3), 依次用蒸馏水、饱和食盐水洗涤, 有机相用无水MgSO₄干燥. 抽滤, 滤液减压浓缩, 柱层析分离提纯得到淡黄色粉末固体0.52 g, 产率为77.8%.

4-[6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪基]苯甲酸乙酯(7a): m.p. 128~130 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.93 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.48 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.34 (dd, J=8.6, 7.6 Hz, 1H), 6.87 (d, J=9.0 Hz, 2H), 4.32 (q, J=7.2 Hz, 2H), 3.58~3.55 (m, 4H), 3.40~3.38 (m, 4H), 1.36 (t, J=7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 166.52, 153.55, 135.85, 134.66, 132.83, 131.90, 131.34, 121.62, 114.75, 60.63, 48.26, 45.41, 14.52; HRMS calcd for C₁₉H₂₁Cl₂N₂O₄S [M＋H]^＋ 443.0594, found 443.0593.

4-[6-二氟苯磺酰基)-1-哌嗪基]苯甲酸乙酯(7b): 黄色粉末固体, 收率为87.5%. m.p. 208~209 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.96 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.60~7.50 (m, 1H), 7.06 (t, J=8.8 Hz, 2H), 6.96 (d, J=8.8 Hz, 2H), 4.34 (q, J=7.2 Hz, 2H), 3.47 (d, J=7.6 Hz, 8H), 1.37 (t, J=7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 166.54, 159.95 (dd, J₁=260.5 Hz, J₂=4.1 Hz), 153.41, 135.14 (t, J=11.0 Hz), 131.39, 121.71, 114.78, 113.48 (dd, J₁=24.0 Hz, J₂=3.5 Hz), 60.70, 47.97, 45.41, 14.56; HRMS calcd for C₁₉H₂₁O₄F₂N₂S [M＋H]^＋ 411.1185 found 411.1165.

3-氯-4-[6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪基]苯甲酸乙酯(7c): 黄色粉末固体, 收率为89.7%. m.p. 178~179 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.03 (d, J=4.0 Hz, 1H), 7.89 (dd, J=8.4, 4.0 Hz, 1H), 7.49 (d, J=8.2 Hz, 2H), 7.36~7.32 (m, 1H), 7.01 (d, J=8.0 Hz, 1H), 4.35 (q, J=7.2 Hz, 2H), 3.62~3.60 (m, 4H), 3.20~3.18 (m, 4H), 1.37 (t, J=7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 165.30, 152.35, 135.78, 134.74, 132.65, 132.13, 131.79, 129.29, 128.11, 126.17, 119.91, 61.16, 50.80, 45.88, 14.34; HRMS calcd for C₁₉H₂₀O₄Cl₃N₂S [M＋H]^＋ 477.0200, found 477.0172.

3-氯-4-[6-二氟苯磺酰基)-1-哌嗪基]苯甲酸乙酯(7d): 黄色粉末固体, 收率为75.2%. m.p. 148~149 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.03 (s, 1H), 7.91 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.61~7.51 (m, 1H), 7.11~7.03 (m, 3H), 4.35 (q, J=7.2 Hz, 2H), 3.48 (s, 4H), 3.28~3.20 (m, 4H), 1.38 (t, J=7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 165.39, 159.97 (dd, J₁=259.4 Hz, J₂=4.2 Hz), 152.27, 135.03 (t, J=11.0 Hz), 132.24, 129.44, 128.13, 126.36, 120.01, 115.13, 113.46 (dd, J₁=24.0 Hz, J₂=3.5 Hz), 61.30, 50.54, 45.89, 14.45; HRMS calcd for C₁₉H₂₀Cl- N₂SO₄F₂ [M＋H]^＋ 445.0795, found 445.0794.

3-溴-4-[6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪基]苯甲酸乙酯(7e): 黄色粉末固体, 收率为86.2%. m.p. 168~169 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.22 (d, J=1.8 Hz, 1H), 7.94 (dd, J=8.4, 1.8 Hz, 1H), 7.49 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.36~7.32 (m, 1H), 7.01 (d, J=8.4 Hz, 1H), 4.35 (q, J=7.2 Hz, 2H), 3.63~3.60 (m, 4H), 3.19~3.16 (m, 4H), 1.37 (t, J=7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 165.13, 153.72, 135.77, 135.34, 134.77, 132.64, 131.78, 129.94, 126.74, 120.35, 118.78, 61.19, 51.23, 45.88, 14.34; HRMS calcd for C₁₉H₂₀O₄BrCl₂N₂S [M＋H]^＋ 520.9699, found 520.9688.

3-溴-4-[6-二氟苯磺酰基)-1-哌嗪基]苯甲酸乙酯(7f): 黄色粉末固体, 收率为81.4%. m.p. 120~122 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.21 (d, J=1.8 Hz, 1H), 7.95 (dd, J=8.4, 1.8 Hz, 1H), 7.59~7.52 (m, 1H), 7.09~7.02 (m, 3H), 4.35 (q, J=7.2 Hz, 2H), 3.48 (s, 4H), 3.22~3.20 (m, 4H), 1.37 (t, J=7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 165.18, 159.93 (dd, J₁=259.2 Hz, J₂=4.0 Hz), 153.63, 135.42, 134.99 (t, J=10.9 Hz), 130.06, 126.91, 120.44, 118.78, 115.28 (t, J=16.7 Hz), 113.44 (dd, J₁=23.9 Hz, J₂=3.5 Hz), 61.30, 50.97, 45.88, 14.43; HRMS calcd for C₁₉H₂₀O₄BrF₂N₂S [M＋H]^＋ 489.0290, found 489.0275.

3.2.9 化合物8的合成

采用合成化合物4的方法合成了化合物8a~8e.

4-[6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪基]苯甲酸(8a): 白色粉末固体, 收率为74.6%. m.p. 269~270 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.38 (s, 1H), 7.83 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.76 (s, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.68~7.64 (m, 1H), 7.03 (t, J=6.6 Hz, 2H), 3.46 (s, 4H), 3.44 (d, J=5.4 Hz, 4H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 167.61, 153.63, 135.04, 134.65, 134.00, 132.72, 131.33, 131.15, 120.85, 114.58, 47.45, 45.39; HRMS calcd for C₁₇H₁₇O₄Cl₂N₂S [M＋H]^＋ 415.0281, found 415.0268.

3-氯-4-[6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪基]苯甲酸(8b): 白色粉末固体, 收率为88.3%. m.p. 238~240 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.91 (s, 1H), 7.82 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.77 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.69~7.65 (m, 1H), 7.10 (d, J=8.0 Hz, 1H), 3.50 (s, 4H), 3.09 (s, 4H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 168.77, 148.95, 137.34, 135.09, 134.63, 134.00, 132.73, 131.50, 129.16, 126.83, 120.17, 51.16, 46.12; HRMS calcd for C₁₇H₁₆O₄- Cl₃N₂S [M＋H]^＋ 448.9891, found 448.9878.

3-氯-4-[6-二氟苯磺酰基)-1-哌嗪基]苯甲酸(8c):白色粉末固体, 收率为78.4%. m.p. 219~220 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.84 (s, 1H), 7.81 (d, J=8.3 Hz, 2H), 7.39 (t, J=9.1 Hz, 2H), 7.17 (d, J=8.4 Hz, 1H), 3.28 (s, 4H), 3.15 (s, 4H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 166.77, 158.96 (dd, J₁=257.0 Hz, J₂=4.3 Hz), 150.68, 136.51 (t, J=11.2 Hz), 131.10, 129.89, 129.07, 126.70, 120.53, 113.90 (dd, J₁=23.8 Hz, J₂=2.8 Hz), 113.49, 49.98, 45.55; HRMS calcd for C₁₇H₁₆O₄Cl- F₂N₂S [M＋H]^＋ 417.0482, found 417.0464.

3-溴-4-[6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪基]苯甲酸(8d): 白色粉末固体, 收率为83.8%. m.p. 258~260 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.11 (d, J=1.4 Hz, 1H), 7.93 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.77 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.69~7.65 (m, 1H), 7.27 (d, J=8.4 Hz, 1H), 3.52 (s, 4H), 3.17 (s, 4H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 166.50, 153.55, 135.10, 134.88, 134.66, 133.97, 132.74, 130.34, 128.20, 121.72, 118.40, 51.19, 45.99; HRMS calcd for C₁₇H₁₆O₄BrCl₂N₂S [M＋H]^＋ 492.9386, found 492.9373.

3-溴-4-[6-二氟苯磺酰基)-1-哌嗪基]苯甲酸(8e): 白色粉末固体, 收率为87.5%. m.p. 199~200 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.10 (s, 1H), 8.10 (d, J=1.8 Hz, 1H), 7.95 (dd, J=8.0, 4.0 Hz, 1H), 7.91~7.86 (m, 1H), 7.45 (t, J=9.2 Hz, 2H), 7.30 (d, J=8.4 Hz, 1H), 3.38~3.36 (m, 4H), 3.23 (d, J=4.2 Hz, 4H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 166.31, 159.50 (dd, J₁=257.6 Hz, J₂=4.0 Hz), 153.75, 136.99 (t, J=11.0 Hz), 134.90, 130.38, 127.35, 121.80, 118.36, 114.38 (dd, J₁=24.2 Hz, J₂=3.2 Hz), 114.04, 50.75, 46.00; HRMS calcd for C₁₇H₁₄BrF₂N₂O₄S [M－H]^－ 458.0031, found 459.0021.

3.3 ABCA1上调活性筛选测试方法

取对数生长期的ABCA1-promoter-luc-HepG2细胞, 每孔用单细胞悬液100 μL在96孔培养板中处理细胞, 细胞数控制在约5×100个/mL. 细胞培养6 h, 等待细胞完全贴壁后, 将原培养基移除, 用缓冲溶液漂洗细胞一次. 每孔分别加入浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.39、0.039及0.0039 μmol/L, 共11个浓度的化合物溶液, 每个化合物设两个复孔. 18~24 h后将培养基移除, 缓冲溶液漂洗1次, 在孔板中加入25 μL细胞裂解液, 将细胞在37 ℃下裂解30 min. 细胞裂解完全后, 每孔迅速加入50 μL萤火虫荧光素酶检测试剂, 立即将分析白板放入酶标仪中检测. 按以下公式计算待测化合物对ABCA1的活性影响. 待测化合物的上调表达率≥150%结果呈阳性.

ABCA1上调表达率(%)=加入化合物后的荧光素酶活性/加入空白对照样品后的荧光素酶活性×100%.

3.4 qRT-PCR测试方法

RAW264.7培养于含质量分数10%胎牛血清的DMEM培养基中. 设立加药组4a和4b(浓度为10 μmol/ L)和阴性对照组(不加入待测样品). 利用Trizol试剂提取细胞总RNA, 利用反转试剂盒(武汉赛维尔生物)反转成cDNA. 采用逆转录聚合酶链反应方法检测化合物对ABCA1 mRNA表达的影响. 每个化合物设两个复孔, 重复三次. ABCA1引物为forward: 5'-GCTTGTTGGC- CTCAGTTAAGG-3', reverse: 5'-GTAGCTCAGGCGT- ACAGAGAT-3'; 内参GADPH引物为(forward: 5'-AA- CGACCCCTTCATTGAC-3', reverse: 5'-TCCACGACA- TACTCAGCAC-3'). PCR条件为94 ℃预变性15 min, 94 ℃变性10 s, 60 ℃退火延伸30 s, 40个循环.

3.5 激光共聚焦检测胆固醇流出实验方法

模型组和实验组ox-LDL浓度为100 μg/mL, 实验组药物浓度为10 μmol/L, 加药后培养24 h进行测定. 将在共聚焦小皿中处理好的细胞, 用无血清细胞培养液洗涤细胞一次. 用新鲜空白培养液配制终浓度为50 μg/mL的bodipy-cholesterol染色液待用. 将染色液加入细胞中, 37 ℃ 细胞培养箱内孵育30 min. 用无血清细胞培养液洗涤细胞3次, 以充分去除未进入细胞内的bodipy-cholesterol. 加入稀释好的细胞核染料Hoechst 33342(江苏凯基生物), 孵育15 min, 磷酸缓冲溶液(PBS)清洗3次. 加入1 mL培养基, 用激光共聚焦(600倍)检测细胞内cholesterol的情况.

3.6 油红O染色实验方法

将细胞计数、配制成浓度为5×10⁴个/mL的细胞悬液, 12孔细胞培养板中每孔加入1 mL细胞悬液, 待次日细胞贴壁后按组别进行加药处理24 h. 吸掉培养基, 用PBS漂洗1次, 每次5 min. 加质量分数为4% PBS稀释的甲醛固定10 min. PBS漂洗2次, 每次5 min. 孵育液孵育样本10 min. 油红染色工作液配置: 30 mL储备液和20 mL双蒸水混匀. 油红染色工作液孵育样本15 min. 用体积分数为60%的异丙醇水溶液(脱色液A)漂洗2次, 每次5 min. 用PBS(脱色液B)漂洗2次, 每次5 min. 苏木素复染20~60 s. 用脱色液B漂洗2次, 每次5 min. 用甘油/PBS按体积比1∶1制成甘油缓冲液, 封片保存. 显微镜观察(400倍).

辅助材料(Supporting Information) 化合物3, 4, 7和8的¹H NMR、¹³C NMR和HRMS的谱图. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

(Zhao, C.)

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序

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Abstract

图1 苯磺酰哌嗪类化合物的结构

1 结果与讨论

1.1 目标化合物的合成

图式1 化合物3a~3j和4a~4f的合成

图式2 化合物7a~7f, 8a~8e的合成

1.2 目标化合物的活性评价

表1 目标化合物的ABCA1上调表达活性

图2 化合物4b和4c对RAW264.7细胞中ABCA1 mRNA表达的影响

图3 化合物4b和4c对RAW264.7细胞胆固醇流出的影响

图4 化合物4b和4c的油红O染色实验

2 结论

3 实验部分

3.1 仪器与试剂

3.2 合成方法

3.2.1 化合物1的合成

3.2.2 化合物2的合成

3.2.3 化合物3a, 3b和3e~3j的合成

3.2.4 化合物3c和3d的合成

3.2.5 化合物4的合成

3.2.6 化合物5的制备

3.2.7 化合物6的制备

3.2.8 化合物7的合成

3.2.9 化合物8的合成

3.3 ABCA1上调活性筛选测试方法

3.4 qRT-PCR测试方法

3.5 激光共聚焦检测胆固醇流出实验方法

3.6 油红O染色实验方法

参考文献