白花洋紫荆(Bauhinia variegata Linn. var. candida)为豆科云实亚科羊蹄甲属植物, 该属植物主要分布在我国的南部和西南部地区[1], 多个种在云南民间可药用, 如云南羊蹄甲(B. yunnanensis Franch)根、叶可止咳、止血; 黄花羊蹄甲(B. tomentosa L.)根皮、花也用于痢疾、溃疡, 茎还用于风湿性关节炎、跌打损伤、胃痛等; 总状花羊蹄甲(B. racemosa)叶用于疟疾、发热、头疼; 羊蹄甲(B. purpurea)叶用于清热解毒; 白花洋紫荆(B. variegata Linn. var. candida)的根可止血、健胃, 树皮可健胃燥湿, 消炎解毒, 收敛, 叶可润肺止咳, 花可消炎解毒, 花也是云南人民喜爱的美食[2]. 目前不多的文献报道表明该属植物化学成分有二苯并[b,f]氧杂䓬(dibenz[b,f]oxepin)、二萜、三萜、黄酮、生物碱等类型成分, 其中天然dibenz[b,f]oxepin类成分目前在植物中发现得不多, 羊蹄甲属植物中发现了20余个, 表现出肿瘤细胞毒、抗真菌、抗疟等活性[3-5], 吸引了药学研究和有机合成人员的关注, 并对部分该类成分进行了药理机制和全合成研究[6-9]. 为发现更多该类成分, 作者对白花洋紫荆枝叶化学成分进行了研究, 从中分离并鉴定14个化合物(图1), dibenz[b,f]oxepin类成分4个: bauhinine A (1), parachrin[5] (2), bauhiniastatin 3[5] (3), bauhiniastatin 1[5] (4), 黄酮类成分10个: 异甘草素-4-甲醚[10](5), 表阿夫儿茶精[11] (6), 表儿茶素epicatechin[12] (7), 圣草酚[13](8), 7,8-(2"-甲基-2"-羟甲基吡喃)-5,3',4'-三羟基-3-甲氧基黄酮[14] (9), bauhinine B (10), 表阿夫儿茶精-(4β→8)-表阿夫儿茶精[15] (11), 原花青素B2[15] (12), 原花青素A2[16] (13), 表阿夫儿茶精-(4β→6)-表阿夫儿茶精[15] (14), 其中化合物1和10为新化合物.
1 结果与讨论
化合物1为淡黄色固体, HR-ESI-MS给出化合物的分子式为C17H16O5 (其C17H15O5 [M－H]－测量值m/z为299.0925, 计算值为299.0925), 不饱和度为10; 1H NMR谱显示两个相互偶合的芳香质子δH 6.99 (d, J=8.8 Hz, H-9)和6.67 (d, J=8.8 Hz, H-8)及一个单峰质子δH 6.35 (s, H-4), 表明分子中存在一个四取代苯环和一个五取代的苯环, 另外还有两个相互偶合的顺式烯烃质子δH 6.80 (d, J=11.5 Hz, H-5)和7.02 (d, J=11.5 Hz, H-6); 13C NMR谱显示该化合物结构中有17个碳原子, 其中有1个CH3, 2个OCH3, 5个sp2杂化的CH, 9个sp2杂化的季碳, sp2杂化的碳原子个数与由氢谱得出的两个苯环和一个双键的结论吻合. 该化合物的核磁共振图谱特征(表1)与文献报道的bauhiniastatin 3[5] (3)的核磁共振图谱特征非常相似, 区别在于四取代苯环上羟基和甲氧基取代位置不同. 化合物1的HMBC谱显示四取代苯环上的OCH3质子δH 3.95 (s, 3H)与δC 144.5 (C-10)的碳相关, OH质子δH (s, 8.52)与δC 111.5 (C-8), δC 120.4 (C-6a)和δC 149.7 (C-7)的碳相关(图2), 说明化合物1与化合物3的四取代苯环上羟基和甲氧基位置确实不同, 是互换了位置; 另外, HMBC谱中的CH3质子δH 2.06 (s, 3H)与δC 114.3 (C-2), 147.8 (C-1), 156.1 (C-3)的碳相关, 质子δH 6.36 (s, H, H-4)与δC 114.3 (C-2), 129.9 (C-5), 156.1 (C-3), 138.5 (C-11a)的碳相关, 说明化合物1与化合物3的五取代苯环相同(图2). 综上所述, 化合物1结构鉴定为二苯并[b,f]氧杂䓬类化合物, 命名为bauhinine A.
表1 化合物1和10的1H NMR和13C NMR数据Table 1 1H NMR and 13C NMR data of compounds 1 and 10 |
| 1 (in CD3COCD3) | 10 (in CD3OD) | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| No. | δH, mult, J/Hz | δC | No. | δH (Part A), mult, J/Hz | δC (Part A) | δH (Part B), mult, J/Hz | δC (Part B) | |
| 1 | 147.8 | 2 | 3.84, brs | 73.0 | 5.09, brs | 81.0 | ||
| 2 | 114.3 | 3 | 4.46, d, 5.0 | 65.2 | 4.29, brs | 66.5 | ||
| 3 | 156.1 | 4 | 2.95, brd, 17.4 | 29.6 | 2.85, brd, 17.4 | 25.1 | ||
| 4 | 6.35, s | 101.3 | 2.85, brd, 17.4 | 2.67, dd, 4.8, 17.4 | ||||
| 4a | 128.9 | 4a | 99.0 | 103.7 | ||||
| 5 | 6.80, d,11.5 | 129.9 | 5 | 157.8 | 166.9 | |||
| 6 | 7.02, d, 11.5 | 125.1 | 6 | 5.92, d,5.3 | 96.8 | 6.17, s | 91.8 | |
| 6a | 120.4 | 7 | 157.5 | 166.5 | ||||
| 7 | 149.7 | 8 | 5.95, br s | 95.5 | 104.7 | |||
| 8 | 6.67, d, 8.8 | 111.5 | 8a | 155.8 | 156.4 | |||
| 9 | 6.99, d, 8.8 | 113.8 | 1′ | 91.9 | 130.6 | |||
| 10 | 144.5 | 2′ | 164.7 | 7.39, d, 8.5 | 129.1 | |||
| 10a | 147.1 | 3′ | 6.51, s | 113.6 | 6.85, d, 8.5 | 116.1 | ||
| 11a | 138.5 | 4′ | 193.8 | 158.3 | ||||
| 1-OH | 7.66, s | 5′ | 95.6 | 6.85, d, 8.5 | 116.1 | |||
| 2-CH3 | 2.06, 3H, s | 8.8 | 6′ | 2.97, d, 11.0 | 40.9 | 7.39, d, 8.5 | 129.1 | |
| 3-OCH3 | 3.78, 3H, s | 56.1 | 2.23, d, 11.0 | |||||
| 7-OH | 8.52, s | |||||||
| 10-OCH3 | 3.95, 3H, s | 57.1 | ||||||
化合物10为淡黄色固体, HR-ESI-MS给出化合物的分子式为C30H26O11 (其C30H25O11 [M－H]－测量值m/z为561.1402, 计算值为561.1402), 不饱和度为18; 分析13C NMR谱和HSQC谱表明分子中有30个碳原子, 其中有3个苯环的碳原子(7个CH, 11个季碳), 2个三取代的双键碳(δC 113.6的CH和δC 164.7的季碳), 1个羰基碳(δC 193.8), 4个OCH碳(δC 81.0, 73.0, 66.5, 65.2), 3个CH2碳(δC 40.9, 29.6, 25.1), 2个处于低场区的季碳(δC 95.6, 91.9), 以上图谱特征与文献[17]中报道的二聚黄烷核磁数据非常接近, 该二聚黄烷是epicatechin经人工氧化聚合而成. 化合物10与该二聚黄烷的区别在于Part B单元中的B环为1,4-对称取代的苯环, 而该物质为1,3,4-三取代的苯环; 化合物10的1H NMR谱显示两对相互偶合的芳香质子δH 7.39 (d, J=8.5 Hz, 2H)和6.85 (d, J=8.5 Hz, 2H, H-8), 也表明分子中存在一个对称取代的苯环. 化合物10的HMBC谱中相应的碳氢相关印证了(图2)上述推论. 因此化合物的结构鉴定为如图1所示, 将其命名为bauhinine B.
利用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(MTS)法对二苯并[b,f]氧杂䓬类成分1~4的体外肿瘤细胞生长抑制活性进行了评价, 化合物2对肝癌HepG2细胞体现出一定抑制活性[IC50=(21.22±2.02) μmol/L], 化合物4对乳腺癌MDA-MB- 231细胞体现出一定抑制活性[IC50=(20.14±1.69) μmol/L](表2).
表2 化合物2和4的肿瘤细胞毒活性aTable 2 Cytotoxic activities of compounds 2 and 4 against tumor cell lines |
| Compd. | HepG2 | MDA-MB-231 |
|---|---|---|
| 2 | 21.22±2.02 | —b |
| 4 | —b | 20.14±1.69 |
| Doxorubicinc | 0.309±0.022 | 0.058±0.006 |
| Taxolc | <0.016 | <0.016 |
a Results were expressed as IC50±SD values in μmol/L. Cell lines: HepG2 liver cancer; MDA-MB-231 mammary cancer. b —: Unmeasured. c Positive control. |
2 结论
通过多种色谱技术和波谱技术, 对白花洋紫荆枝叶化学成分进行研究, 从其乙醇提取物中分离鉴定二苯并[b,f]氧杂䓬类成分4个, 黄酮类成分10个, 化合物10~14也属原花青素类成分, 除化合物2、6和7外, 其余化合物为首次从该植物中得到. 二苯并[b,f]氧杂䓬类化合物parachrin (2)和bauhiniastatin 1 (4)有一定肿瘤细胞生长抑制活性. 原花青素类成分具有抗氧化、防癌、心血管保护、糖尿病预防等多种活性, 已被广泛运用在保健品、食品、化妆品等领域[18]. 原花青素类成分系首次从白花洋紫荆中分离得到, 白花洋紫荆有望作为新的原花青素来源.
3 实验部分
3.1 仪器与试剂
核磁共振谱由Bruker DRX 500 MHz和Avance 600 MHz核磁共振仪测定, TMS为内标; 质谱用Waters Autospec Premier 776质谱仪测定; 柱层析用硅胶(100~200目与200~300目)和硅胶薄层板(GF254)购至青岛谱科分离材料有限公司; MCI反相材料(75~150 mm)为日本Mitsubishi Chemical corporation生产; Sephadex LH-20为瑞士GE Healthcare公司产品; 所用有机溶剂皆为工业级, 经蒸馏后使用.
3.2 植物材料
实验用植物枝叶于2023年7月采于云南保山, 由云南中医药大学李宏哲鉴定为白花洋紫荆(Bauhinia variegata var. candida), 标本藏于云南师范大学化学化工学院, 凭证标本号2023B01.
3.3 提取和分离
干燥的白花洋紫荆枝叶(15.3 kg)粉碎后, 室温下用95% (φ)乙醇提取, 共提取三次, 提取液合并浓缩得浸膏1.74 kg, 将浸膏溶于水后用乙酸乙酯进行萃取, 共萃取六次, 合并浓缩得萃取物690 g. 对该萃取物进行硅胶柱层析, 经石油醚/乙酸乙酯(V∶V=10∶1, 8∶1, 6∶1, 4∶1, 2∶1, 1∶1, 0∶1)、甲醇梯度洗脱, 薄层层析检测、合并、浓缩得到9个组分: Fr.A~Fr.I.
Fr.E (59.2 g)经硅胶柱层析[V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=4∶1~0∶1]得到3个组分(Fr.E1~Fr.E3). Fr.E2 (33.1 g)经硅胶柱[V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=4∶1~0∶1]得3个组分(Fr.E2a~Fr.E2c), Fr.E2c (10.4 g)经MCI柱层析[V(甲醇)∶V(水)=6∶4~1∶0]得到4个组分(Fr.E2c1~Fr.E2c4). Fr.E2c1 (416 mg)经硅胶柱色谱[V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=100∶1~30∶1]、ODS柱色谱和凝胶柱(甲醇)色谱得到化合物2 (15.0 mg)和4 (13.0 mg); Fr.E2c2 (310 mg)经硅胶柱层析[V(二氯甲烷)∶V(丙酮)=100∶1~20∶1; V(石油醚)∶V(丙酮)=7∶1~4∶1]、ODS柱层析得到化合物1 (8.0 mg)和3 (8.0 mg); Fr.E2c3 (1.62 g)经硅胶柱层析[V(二氯甲烷)∶V(丙酮)=100∶1~0∶1; V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=4∶1~0∶1]、ODS柱层析和凝胶柱(甲醇)层析得化合物5 (9.0 mg).
Fr.G (66.7 g)经硅胶柱层析[V(二氯甲烷)∶V(甲 醇)=20∶1~0∶1]得到17个组分(Fr.G1~Fr.G17). Fr.G1 (1.24 g)经反复硅胶柱层析[V(二氯甲烷)∶V(丙酮)=10∶1~0∶1; V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=15∶1~0∶1]得化合物6 (99 mg). Fr.G5 (2.46 g)进行MCI柱层析[V(甲醇)∶V(水)=6∶4、8∶2、9∶1、1∶0)得到6个组分(Fr.G5a~Fr.G5f), 对Fr.G5e (101.6 mg)进行硅胶柱层析[V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1]、凝胶柱层析(甲醇)得化合物9 (78.5 mg). Fr.G7 (2.48 g)经硅胶柱层析[V(氯仿)∶V(丙酮)=4∶1~1∶1]得到3个组分(Fr.G7a~Fr.G7c), Fr.G7b (460.8 mg)进行凝胶柱层析[V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶1]得到化合物8 (11.6 mg). Fr.G11 (4.34 g)进行硅胶柱层析[V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=7∶1]得到3个组分(Fr.G11a~Fr.G11c), G11b (143.6 mg)进行凝胶柱层析(甲醇)得到化合物7 (17.4 mg). Fr.G12 (1.41 g)进行硅胶柱层析[V(氯仿)∶V(甲醇)=5.2∶1], 得到3个组分(Fr.G12a~Fr.G12c), Fr.G12b (674 mg)进行凝胶柱层析(甲醇)得到化合物10 (15.6 mg). Fr.G14 (3.12 g)进行硅胶柱层析[V(氯仿)∶V(甲醇)=4∶1]得到4个组分(Fr.G14a~Fr.G14d), Fr.G14d (1.34 g)进行凝胶柱层析(甲醇)、MCI柱层析[V(甲醇)∶V(水)=3∶7]、反复硅胶柱层析[V(氯仿)∶V(甲醇)=5∶1)得化合物14 (84.3 mg)和11 (6.3 mg). Fr.G15 (9.32 g)进行硅胶柱层析[V(氯仿)∶V(甲 醇)=7∶2], 得到3个组分(Fr.G15a~Fr.G15c), Fr.G15b (4.49 g)经凝胶柱层析(甲醇)、MCI柱层析[V(甲醇)∶V(水)=1∶9~3∶7]、硅胶柱层析[V(氯仿)∶V(甲醇)=5∶1~4∶1]、凝胶柱层析(甲醇)得到化合物12 (60 mg)和13 (14.3 mg).
Bauhinine A (1): 褐色固体, m.p. 169~171 ℃; 1H NMR and 13C NMR data see Table 1; IR (KBr) νmax: 3427, 2958, 1615, 1581, 1504, 1462, 1437, 1266, 1207, 1132, 1071, 1014 cm－1; HR-ESI-MS calcd for C17H15O5 [M－ H]－ 299.0925, found 299.0925.
Bauhinine B (10): 淡黄色固体, m.p.>282 ℃; 1H NMR and 13C NMR data see Table 1; IR (KBr) νmax: 3430, 2922, 1612 (broad, strong), 1517, 1487, 1266, 1207, 1175, 1100 cm－1; HR-ESI-MS calcd for C30H25O11 [M－H]－ 561.1402, found 561.1402.
3.4 肿瘤细胞生长抑制活性筛选
对二苯并[b,f]氧杂䓬类成分1~4的体外肿瘤细胞生长抑制活性进行测试, 包括HL-60(白血病)、A549(肺癌)、HepG2(肝癌)、MDA-MB-231(乳腺癌)和SW480(结肠癌)五种肿瘤细胞株. 用体积分数为10%的胎牛血清的培养液(DMEM)配成单个细胞悬液, 以每孔5000个细胞接种到96孔板, 每孔体积100 μL, 细胞提前12~24 h接种培养; 化合物用二甲基亚砜(DMSO)溶解, 以40 μmol/L浓度初筛, 抑制率大于50%的化合物以40、8、1.6、0.32、0.064 μmol/L浓度复筛, 每孔终体积200 μL, 每种处理均设3个复孔; 37 ℃培养48 h后, 细胞弃孔内培养液, 每孔加MTS溶液20 μL和培养液100 μL; 设3个空白复孔(MTS溶液20 μL和培养液100 μL的混合液), 继续孵育2~4 h, 使反应充分进行后测定光吸收值; 选择492 nm波长, 多功能酶标仪(Multiskan FC)读取各孔光吸收值, 记录结果, 数据处理后以浓度为横坐标, 细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线, 应用两点法(Reed and Muench法)计算化合物的IC50值; 每次实验均设阿霉素(Dox)和紫杉醇(Taxol)两个阳性化合物, 以浓度为横坐标, 细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线, 应用两点法(Reed and Muench法)计算化合物的IC50值.
辅助材料(Supporting Information) 化合物1和10的1D/2D NMR、高分辨质谱等谱图. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.
(Cheng, F.)