甾体类化合物作为抗肿瘤药物的应用备受关注. 在甾体骨架的不同位置引入活性官能团, 以优化其生物活性, 已成为该领域的研究热点之一.
阿比特龙(abiraterone, 1)是一种临床上广泛使用的抗癌甾体药物, 其结构特征是在孕烯醇酮的17位引入活性官能团[1]. Capper等[2]研究表明, 除了用于前列腺癌治疗之外, 阿比特龙还能够与雌激素受体ER结合, 并在ER阳性的MCF-7(人乳腺癌细胞)和T47D(人乳腺导管癌细胞)中表现出雌激素样活性. 然而, 该药物在临床应用存在水溶性差及生物利用度低等问题, 严重限制了其疗效[3]. 因此, 开发能够克服上述缺陷的新型高效抗肿瘤药物具有重要的意义.
氨基酸是组成蛋白质的基本单位, 参与能量代谢和物质运输, 具有良好的生物相容性和亲和性[4]. 研究发现, 用氨基酸修饰可以改善母体药物溶解性差及渗透性低的缺点, 提高其生物活性, 从而被广泛用于抗肿瘤药物的设计和开发[5]. 因此, 将氨基酸引入药物分子, 以获得高效、低毒的化合物是抗肿瘤新药研发的重要途径.
近年来, 甾体骨架-氨基酸共价缀合物凭借高效低毒与靶向递送特性, 已成为抗肿瘤前药领域的研究热点之一. Zhou等[6]在雌二醇的17位引入氨基酸酯侧链, 通过调控人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)凋亡相关蛋白的表达, 进而提高甾体母核的体外抗肿瘤增殖活性, 化合物2的IC50值可达4.89 µmol/L. Yuan等[7]用非蛋白氨基酸对人参的活性成分25-甲氧基原人参二醇(25-OCH3- PPD)和25-羟基原人参二醇(25-OH-PPD)进行修饰, 合成了一系列结构新颖的人参皂苷-氨基酸酯衍生物, 其中化合物3和4对人结肠癌细胞(HCT-116)和人胃腺癌细胞(BGC-823)细胞株显示出相当的抗肿瘤活性, IC50值在4.76~9.03 µmol/L范围. Lin等[8]以人参皂苷(AD-2)为先导化合物, 设计合成了一系列结构新颖的AD-2氨基酸酯衍生物, 化合物5对人肝癌细胞(HepG2)的增殖具有良好的抑制作用, 最佳IC50值为8.25 µmol/L.
在本研究中, 以孕烯醇酮作为母核, 在其17位引入氨基酸侧链, 这一修饰位点与临床药物阿比特龙的活性位点一致, 且可以通过成熟的合成方法实现. 另外, 从疏水性、电性及氢键能力等考虑, 选择多样化的氨基酸种类, 包括甘氨酸(最小氨基酸)、丙氨酸(脂肪族)、缬氨酸和亮氨酸(分支脂肪族)、苯丙氨酸(芳香族)、酪氨酸(酚羟基)、甲硫氨酸(含硫)、丝氨酸和苏氨酸(羟基)以及脱氧蒜氨酸(含烯丙基)等, 这些氨基酸代表了不同的结构特征和物理化学性质, 可以系统地研究氨基酸侧链结构对活性的影响. 此外, 通过同时合成酯类与羧酸类两种形式的衍生物, 能够明确酯化修饰对活性的关键作用.
1 结果与讨论
1.1 目标化合物的合成
选用组成人体蛋白质的不同代表性氨基酸作为原料, 通过与乙醇脱水缩合对其羧基进行酯化保护, 得到各种氨基酸酯化合物2a~2j. 以孕烯醇酮为先导化合物, 将其3-OH进行二氢吡喃保护得到化合物4. 采用NaBrO与20-位羰基发生卤仿反应得到含17-羧基的化合物5. 进而采用氯化亚砜对化合物5结构上17-羧基进行活化, 然后分别与化合物2a~2j进行亲核取代反应得到相应的酰胺化合物6a~6j. 最后在酸性环境下对3-OH进行脱保护得到目标化合物7a~7j (Scheme 1). 此外, 选用含不同代表性基团的化合物7a~7d, 通过碱性水解对氨基酸片段的羧基进行脱保护, 得到目标化合物8a~8d (Eq. 1). 本研究采用经典的有机合成方法, 成功构建了17-位氨基酸修饰的孕甾衍生物. 合成路线设计合理, 各步反应条件温和, 产率适中. 关键步骤包括20-位羰基的卤仿反应和17-羧基的酰胺化反应, 这些反应的选择性和效率对最终产物的纯度和收率具有重要影响.
图1 目标化合物的合成路线Scheme 1 Synthetic route of target compounds Reagents and conditions: (i) EtOH (5 equiv.), SOCl₂ (1.2 equiv.), r.t., 12 h; (ii) p-TsOH (0.1 equiv.), DHP (1.5 equiv.), CH₂Cl₂, 0 °C to r.t., 6 h; (iii) NaBrO (3 equiv.), 1,4-dioxane, dilute HCl, 80 °C, 10 h; (iv) SOCl₂ (1.5 equiv.), DMF, Et₃N (3 equiv.), CH₂Cl₂, 80 °C, 6 h; (v) 10% HCl, EtOH, r.t., 12 h. |
1.2 体外抗肿瘤活性测试
采用人乳腺癌细胞(MCF-7)、人卵巢癌细胞 (SKOV-3)、人乳腺导管癌细胞(T47D)和人宫颈癌细胞 (HeLa)四种肿瘤细胞系, 并以人肾上皮细胞(293T)作为正常细胞对照, 通过MTT法评估了目标化合物的体外抗肿瘤活性, 同时以阿比特龙作为阳性对照. 各类化合物对上述五种细胞的抗增殖活性结果汇总于表1. 研究结果表明: (1)氨基酸酯形式的衍生物7a~7j对细胞增殖具有显著抑制作用, 而经酯基水解得到的羧酸类衍生物8a~8d则未表现出明显的细胞毒活性; (2)总体来看, 目标化合物7a~7j对SKOV-3和T47D细胞系的抑制效果优于其他肿瘤细胞; (3)在结构各异的氨基酸片段中, L-苯丙氨酸衍生物7h对SKOV-3细胞显示出较强的抗增殖活性(IC₅₀=15.10 µmol/L), 而L-脱氧蒜氨酸衍生物7d对T47D细胞也表现出相近的抑制能力(IC₅₀=15.46 µmol/L), 两者活性均显著优于阳性对照阿比特龙(其对两种细胞的IC₅₀值分别为59.5和34.66 µmol/L).
表1 目标化合物对5种受测细胞株的体外抗增殖活性[(mean±SD), n=6, IC50/(µmol•L－1)]Table 1 Antiproliferation activities of target compounds against five tested cell lines [(mean±SD), n=6, IC50/(µmol•L－1)] |
| Compd. | MCF-7 | SKOV-3 | T47D | HeLa | 293T | Clog P |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 8a | 52.89±1.72 | >80 | >80 | 46.74±1.67 | >80 | 2.3 |
| 8b | >80 | >80 | >80 | >80 | >80 | 3.7 |
| 8c | >80 | >80 | >80 | 47.02±1.67 | 30.29±1.48 | 4.1 |
| 8d | >80 | >80 | >80 | >80 | >80 | 3.74 |
| 7a | >80 | 39.83±10.12 | >80 | >80 | 43.28±1.64 | 2.93 |
| 7b | >80 | 50.89±8.06 | >80 | 45.04±6.66 | 34.85±4.84 | 4.31 |
| 7c | 21.41±0.53 | 20.38±0.87 | 21.83±1.34 | 42.80±1.63 | 9.46±0.35 | 4.71 |
| 7d | 59.35±9.82 | 20.46±3.15 | 15.46±1.19 | 31.57±1.50 | 12.04±2.28 | 4.34 |
| 7e | 60.97±7.61 | 77.87±0.69 | 61.99±1.79 | >80 | 24.18±1.97 | 3.42 |
| 7f | 24.63±1.39 | 25.51±4.23 | 18.80±1.27 | 71.10±1.85 | 7.43±3.51 | 4.65 |
| 7g | 39.93±4.36 | 50.55±10.69 | 35.42±1.55 | >80 | 29.08±0.78 | 3.76 |
| 7h | 40.63±5.88 | 15.10±1.24 | >80 | 25.89±1.41 | 12.76±1.79 | 5.1 |
| 7i | >80 | 49.36±3.51 | >80 | >80 | 37.84±2.25 | 2.88 |
| 7j | >80 | >80 | >80 | 41.93±1.62 | 37.18±2.54 | 2.57 |
| Abiraterone | 38.20±1.58 | 59.5±1.77 | 34.66±1.69 | 16.86±1.23 | >80 | 5.16 |
构效关系分析显示, 氨基酸侧链的结构特征对其活性影响显著. 通过ChemDraw计算理论脂水分配系数(Clog P)值发现, 活性较好的化合物7h和7d的Clog P值分别为5.2和4.3, 与对照阿比特龙(5.16)相当; 而活性较弱的羧酸类衍生物8a~8d的Clog P值与其前体7a~7d相比均明显下降. 该结果支持酯化修饰可通过提高脂溶性来增强细胞膜穿透能力, 进而提升抗肿瘤活性的假设. 具体而言, 化合物7h中的疏水苯环及7d中的烯丙基均有助于提高脂溶性和膜渗透性, 从而增强活性. 相反, 含极性侧链(如丝氨酸、苏氨酸)的衍生物7i和7j由于其较低的Clog P值(2.88, 2.57), 膜透过能力较差, 活性也相应较低.
此外, 羧酸类化合物8a~8d因带有游离羧基, 极性较大, Clog P较低, 难以跨膜进入细胞, 导致其活性丧失, 进一步证实酯化修饰在改善生物活性中的关键作用, 并为前药设计提供了理论依据.
进一步分析表明, 氨基酸侧链的疏水性、空间位阻和电子效应均对活性产生影响. 疏水侧链较强的氨基酸(如苯丙氨酸、亮氨酸)其衍生物通常具有更优的活性, 可能与更易穿透细胞膜有关; 而带极性基团(如羟基、羧基)的衍生物由于亲水性较强, 跨膜能力较差, 活性较低. 这些结果为进一步结构优化提供了重要依据.
毒性分析结果表明, 目标化合物对正常细胞(293T)的毒性普遍低于其对癌细胞的毒性. 其中, 活性最优的化合物7d和7h对293T细胞的IC50值分别为12.04和12.76 µmol/L; 而对SKOV-3癌细胞系的IC50值则分别为 20.46和15.10 µmol/L. 据此计算所得选择性指数 [SI=IC50(293T)/IC50(SKOV-3)]分别为0.59和0.84. 尽管SI值略低于1, 表明在单一细胞模型中对正常细胞的选择性尚不显著, 但值得注意的是, 这两个化合物对SKOV- 3和T47D两种癌细胞均表现出显著优于阳性对照药物阿比特龙的抑制活性(阿比特龙对上述两株细胞的IC50值分别为59.5和34.66 µmol/L). 同时, 它们对正常细胞的较低毒性进一步提示, 其具有较好的安全性特征. 综上, 尽管选择性指数有待进一步提高, 化合物7d和7h仍显示出良好的类药性和开发潜力, 值得进行后续深入研究与结构优化.
2 结论
本研究选取了组成人体蛋白质的多种代表性氨基酸为原料, 通过多步反应在孕甾骨架的17位引入带有不同氨基酸片段的酰胺含氮侧链, 成功合成了一系列17位侧链结构多样的孕甾类衍生物. 采用MTT法评价了所合成目标化合物对MCF-7、SKOV-3、T47D、HeLa细胞以及人肾上皮正常细胞293T的体外抗增殖活性, 并以阿比特龙作为阳性对照药. 实验结果表明, 当氨基酸片段以羧酸形式存在时, 化生物对癌细胞几乎无抑制活性; 而以酯基形式存在时, 则表现出显著的抗增殖效应. 其中, L-苯丙氨酸衍生物(7h)对SKOV-3细胞株显示出较强的抑制活性, IC50值为15.10 µmol/L; L-脱氧蒜氨酸衍生物(7d)对T47D细胞株也具有相近抑制效果, IC50值为15.46 µmol/L, 两者活性均显著优于阳性对照药阿比特龙(其对上述两种细胞株的IC50值分别为59.5和34.66 µmol/L).
本研究的局限性在于仅完成了体外水平的活性评价, 该类化合物虽然显示出一定的肿瘤细胞选择性, 但其选择性指数仍有待提高. 后续研究可围绕以下方面展开: 引入靶向基团以增强肿瘤选择性, 优化氨基酸侧链结构以改善理化性质, 发展前药策略以降低系统毒性, 并进一步开展体内药效学评价及作用机制研究, 从而全面评估该类化合物的成药潜力, 为开发新型抗肿瘤药物提供扎实的理论依据与实验支持.
3 实验部分
3.1 仪器与试剂
X-5型显微熔点仪(巩义市予华仪器有限责任公司); AV 400MHz核磁共振谱仪(德国Bruker公司); IKA RV10旋转蒸发仪(德国IKA公司); CKX41SF倒置显微镜(奥林巴斯株式会社); ELX800酶标仪(伯腾仪器有限公司); VOR76X-5电磁振荡器(其林贝尔仪器制造有限公司). 孕烯醇酮及其它试剂均购自上海麦克林生化科技股份有限公司; 所用试剂如无特殊说明均为分析纯, 溶剂按常规方法进行处理干燥. RPMI 1640培养基、McCoy’s 5A培养基、DMEM High Glucose培养基、胎牛血清和胰蛋白酶均购自BI公司Israel; 噻唑蓝和二甲基亚砜(DMSO)均购自Solarbio公司.
细胞株: MCF-7(人乳腺癌细胞)、SKOV-3(卵巢癌细胞)、T47D(人乳腺导管癌细胞)、HeLa(宫颈癌细胞)、293T(人肾上皮细胞)(上海盖宁生物科技有限公司)
3.2 实验方法
3.2.1 中间体2和4的合成
3.2.2 中间体化合物5的合成
在装有磁力搅拌子的圆底烧瓶中, 将化合物4 (0.54 g, 1.35 mmol)溶于1,4-二氧六环中(30 mL), 并对反应体系进行氩气置换保护. 冰浴冷却下缓慢滴加NaBrO溶液, 直至反应液变为橙黄色并保持至少30 s不褪色. 随后将反应混合物逐渐升温至80 ℃, 回流反应10 h. 反应进程通过薄层色谱(TLC)进行监测. 反应结束后, 以稀盐酸(1 mol•L－1)调节反应液pH至2~4, 过滤, 所得固体用蒸馏水充分洗涤, 干燥后即得化合物5. 化合物5未经进一步纯化即投入下一步反应.
β-(四氢-2H-吡喃-2-基)氧基孕甾-17β-甲酸(5): 白色固体0.34 g, 产率62%. m.p. 134~135 ℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 5.34 (s, 1H), 4.73 (t, J=3.6 Hz, 1H), 3.92 (s, 1H), 3.61~3.41 (m, 2H), 1.01 (s, 3H), 0.72 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 179.99, 140.99, 121.28, 96.87, 76.00, 62.83, 56.27, 55.51, 50.11, 44.04, 40.21, 38.74, 38.01, 37.49, 37.25, 36.87, 32.04, 31.88, 31.27, 29.66, 27.98, 25.50, 24.60, 23.63, 20.94, 20.02, 19.41, 13.17.
3.2.3 中间体6a~6j的合成
在配有磁力搅拌器的圆底烧瓶中, 将化合物5 (0.47 g, 1.17 mmol)溶于干燥的氯化亚砜(25 mL), 并加入无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF, 9 μL, 0.117 mmol), 于80 ℃下回流搅拌6 h. 反应结束后, 减压蒸除溶剂, 所得残余物用无水二氯甲烷溶解, 冰浴冷却下依次加入干燥的三乙胺(488 μL, 3.51 mmol)和化合物2a (0.16 g, 1.52 mmol), 移至室温反应过夜. 反应进程通过薄层色谱(TLC)监测. 反应完成后加水淬灭, 用乙酸乙酯萃取(30 mL×3), 合并有机相, 以饱和氯化钠溶液洗涤一次, 经无水硫酸钠干燥, 过滤并浓缩. 粗产物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂: 石油醚/乙酸乙酯, V∶V=30∶1)得到化合物6a. 化合物6b~6j参照上述方法, 相应替换化合物2a为2b~2j进行合成. 所得化合物6经核磁共振验证其为目标结构后投入下一步反应.
(3β-(四氢-2H-吡喃-2-基)氧基孕甾-17β-甲酰基)甘氨酸乙酯(6a): 无色油状物, 产率87%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 6.08 (d, J=3.7 Hz, 1H), 5.34 (s, 1H), 4.73 (s, 1H), 4.20 (q, J=7.0 Hz, 2H), 4.13 (d, J=5.7 Hz, 1H), 3.92 (dd, J=18.1, 4.9 Hz, 2H), 3.50 (dd, J=11.1, 6.8 Hz, 2H), 1.28 (t, J=7.1 Hz, 3H), 1.01 (s, 3H), 0.71 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 173.04, 170.24, 140.83, 121.25, 96.81, 75.81, 62.71, 61.30, 56.73, 56.39, 50.14, 43.87, 41.21, 40.18, 38.68, 38.18, 37.45, 36.80, 31.89, 31.23, 29.61, 25.47, 24.51, 23.46, 20.93, 19.94, 19.33, 14.13, 12.91.
(3β-(四氢-2H-吡喃-2-基)氧基孕甾-17β-甲酰基)-L-缬氨酸乙酯(6b): 无色油状物, 产率85%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 5.84 (d, J=8.6 Hz, 1H), 5.33 (d, J=9.2 Hz, 1H), 4.72 (dd, J=4.7, 2.8 Hz, 1H), 4.55 (dd, J=8.6, 4.8 Hz, 1H), 4.29~4.08 (m, 2H), 3.91 (dd, J=7.4, 4.1 Hz, 1H), 3.65~3.32 (m, 2H), 1.28 (t, J=7.1 Hz, 3H), 1.01 (s, 3H), 0.95 (d, J=6.8 Hz, 3H), 0.91 (d, J=6.9 Hz, 3H), 0.69 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 172.65, 172.05, 140.77, 121.17, 96.78, 75.79, 62.61, 60.98, 56.86, 56.68, 56.39, 50.11, 43.83, 40.15, 38.03, 37.39, 36.73, 31.84, 31.78, 31.18, 30.95, 29.60, 25.43, 24.44, 23.37, 20.94, 19.90, 18.94, 17.76, 14.17, 12.82.
(3β-(四氢-2H-吡喃-2-基)氧基孕甾-17β-甲酰基)-L-酪氨酸乙酯(6c): 无色油状物, 产率72%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.95 (s, 1H), 6.94 (d, J=8.2 Hz, 2H), 6.78 (d, J=8.5 Hz, 2H), 5.89 (d, J=7.8 Hz, 1H), 5.38~5.23 (m, 1H), 4.81 (dt, J=7.9, 6.0 Hz, 1H), 4.74 (t, J=3.7 Hz, 1H), 4.19~4.09 (m, 2H), 3.92 (dq, J=7.8, 3.8, 3.4 Hz, 1H), 3.65~3.36 (m, 2H), 3.03 (dd, J=5.9, 2.6 Hz, 2H), 1.23 (t, J=7.3 Hz, 3H), 0.98 (s, 3H), 0.67 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 173.11, 171.88, 155.99, 140.95, 130.16, 126.62, 121.19, 115.62, 96.83, 76.04, 62.76, 61.46, 56.73, 56.35, 53.24, 50.08, 44.02, 40.13, 38.69, 37.92, 37.03, 36.73, 31.86, 31.22, 29.60, 27.92, 25.45, 24.44, 23.37, 20.90, 19.89, 19.34, 14.13, 12.83.
(3β-(四氢-2H-吡喃-2-基)氧基孕甾-17β-甲酰基)-L-脱氧蒜氨酸乙酯(6d): 黄色油状物, 产率78%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 6.13 (d, J=7.7 Hz, 1H), 5.75 (dd, J=17.2, 9.7 Hz, 1H), 5.33 (d, J=14.3 Hz, 1H), 5.21~5.04 (m, 2H), 4.81 (d, J=7.7 Hz, 1H), 4.72 (s, 1H), 4.22 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.91 (s, 1H), 3.61~3.40 (m, 2H), 3.12 (d, J=8.4 Hz, 2H), 2.93 (dd, J=6.8, 5.2 Hz, 2H), 1.31 (d, J=7.1 Hz, 3H), 1.01 (s, 3H), 0.70 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 172.56, 171.03, 140.86, 133.60, 121.25, 117.87, 96.90, 75.87, 62.71, 61.68, 56.75, 56.45, 51.41, 50.13, 43.99, 40.18, 38.71, 38.11, 37.43, 36.77, 35.08, 32.69, 31.89, 31.24, 29.64, 25.47, 24.49, 23.30, 20.97, 20.00, 19.36, 14.14, 12.90.
(3β-(四氢-2H-吡喃-2-基)氧基孕甾-17β-甲酰基)-L-丙氨酸乙酯(6e): 无色油状物, 产率90%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 5.90 (d, J=7.5 Hz, 1H), 5.34 (t, J=5.5 Hz, 1H), 4.72 (s, 1H), 4.62 (t, J=7.3 Hz, 1H), 4.28~4.10 (m, 2H), 3.91 (td, J=7.8, 7.4, 3.4 Hz, 1H), 3.60~3.40 (m, 2H), 1.40 (d, J=7.2 Hz, 3H), 1.28 (s, 3H), 1.01 (s, 3H), 0.69 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 173.27, 172.29, 141.06, 121.25, 96.89, 75.91, 62.77, 61.32, 56.77, 56.46, 50.17, 47.85, 43.91, 38.72, 38.18, 37.45, 36.82, 31.90, 31.23, 29.64, 27.95, 25.48, 24.50, 23.34, 20.96, 19.92, 19.34, 18.52, 14.12, 12.87.
(3β-(四氢-2H-吡喃-2-基)氧基孕甾-17β-甲酰基)-L-亮氨酸乙酯(6f): 无色油状物, 产率82%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 5.74 (d, J=8.3 Hz, 1H), 5.34 (s, 1H), 4.72 (s, 1H), 4.65 (q, J=3.8 Hz, 1H), 4.26~4.08 (m, 2H), 3.91 (dd, J=7.6, 4.0 Hz, 1H), 3.50 (q, J=6.0, 5.4 Hz, 2H), 1.28 (s, 3H), 1.01 (s, 3H), 0.95 (d, J=1.4 Hz, 3H), 0.94 (d, J=1.5 Hz, 3H), 0.69 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 173.19, 172.52, 141.02, 121.21, 96.68, 75.85, 62.59, 61.09, 56.69, 56.45, 50.56, 50.16, 43.91, 41.66, 40.18, 38.14, 37.19, 36.75, 31.88, 31.20, 29.63, 25.47, 24.85, 24.48, 22.77, 21.97, 20.96, 19.87, 19.31, 14.13, 12.82.
(3β-(四氢-2H-吡喃-2-基)氧基孕甾-17β-甲酰基)-L-甲硫氨酸乙酯(6g): 黄色油状物, 产率72%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 6.14 (d, J=7.9 Hz, 1H), 5.35 (d, J=5.6 Hz, 1H), 4.72 (d, J=4.2 Hz, 2H), 4.21 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.91 (dt, J=7.3, 3.4 Hz, 1H), 3.50 (td, J=10.8, 5.1 Hz, 2H), 2.53 (t, J=7.4 Hz, 3H), 2.10 (s, 3H), 1.29 (t, J=7.1 Hz, 3H), 1.01 (s, 3H), 0.69 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 172.62, 172.07, 141.02, 121.20, 96.70, 75.86, 62.61, 61.44, 56.72, 56.42, 51.50, 50.08, 43.91, 40.17, 38.69, 38.13, 36.75, 31.88, 31.62, 31.20, 30.12, 29.62, 27.93, 25.46, 24.48, 23.37, 20.94, 19.88, 19.32, 15.44, 14.15, 12.90.
(3β-(四氢-2H-吡喃-2-基)氧基孕甾-17β-甲酰基)-L-苯丙氨酸乙酯(6h): 无色油状物, 产率77%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.27 (dd, J=8.1, 6.2 Hz, 2H), 7.25~7.19 (m, 1H), 7.14~7.08 (m, 2H), 5.75 (d, J=7.8 Hz, 1H), 5.33 (s, 1H), 4.88 (dt, J=7.9, 6.0 Hz, 1H), 4.71 (t, J=3.5 Hz, 1H), 4.16 (q, J=7.2 Hz, 2H), 3.98~3.84 (m, 1H), 3.57~3.42 (m, 2H), 3.11 (d, J=6.0 Hz, 2H), 1.23 (t, J=7.2 Hz, 3H), 0.99 (s, 3H), 0.66 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 172.38, 171.79, 141.07, 136.07, 129.23, 128.50, 127.02, 121.16, 96.75, 75.89, 62.69, 61.33, 56.74, 56.42, 52.89, 50.11, 43.84, 40.22, 38.74, 37.95, 37.21, 36.78, 31.89, 31.25, 29.66, 27.96, 25.51, 24.46, 23.35, 20.95, 19.95, 19.35, 14.12, 12.83.
(3β-(四氢-2H-吡喃-2-基)氧基孕甾-17β-甲酰基)-L-苏氨酸乙酯(6i): 无色油状物, 产率67%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 6.15 (d, J=8.8 Hz, 1H), 5.35 (t, J=5.7 Hz, 1H), 4.72 (dd, J=4.9, 2.8 Hz, 1H), 4.59 (dd, J=8.8, 2.4 Hz, 1H), 4.36 (d, J=6.8 Hz, 1H), 4.21 (q, J=7.2 Hz, 2H), 3.92 (dd, J=7.5, 3.8 Hz, 1H), 3.51 (dt, J=12.0, 3.8 Hz, 2H), 2.96 (s, 1H), 1.28 (d, J=7.2 Hz, 3H), 1.21 (d, J=6.3 Hz, 3H), 1.01 (s, 3H), 0.71 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 173.48, 171.27, 141.07, 121.27, 96.83, 75.99, 67.77, 62.76, 61.54, 57.21, 56.77, 56.49, 50.13, 44.09, 40.18, 38.71, 38.07, 36.79, 31.93, 31.24, 29.64, 27.96, 25.47, 24.54, 23.44, 20.98, 20.14, 19.94, 19.36, 14.17, 12.89.
(3β-(四氢-2H-吡喃-2-基)氧基孕甾-17β-甲酰基)-L-丝氨酸乙酯(6j): 无色油状物, 产率64%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3d) δ: 6.31 (d, J=7.5 Hz, 1H), 5.35 (t, J=5.8 Hz, 1H), 4.78~4.61 (m, 2H), 4.24 (q, J=7.1 Hz, 2H), 4.03~3.95 (m, 1H), 3.95~3.84 (m, 2H), 3.50 (q, J=5.9, 4.5 Hz, 2H), 3.03 (s, 1H), 1.30 (t, J=7.1 Hz, 3H), 1.01 (s, 3H), 0.70 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 173.36, 170.71, 141.09, 121.19, 96.85, 75.98, 63.59, 62.80, 61.84, 56.83, 56.48, 54.56, 50.12, 44.07, 40.20, 38.73, 38.16, 36.85, 31.95, 31.25, 29.66, 27.97, 25.49, 24.53, 23.39, 21.00, 19.97, 19.38, 14.16, 12.97.
3.2.4 化合物7a~7j的合成
在配有磁力搅拌器的烧瓶中, 将化合物6a (0.32 g, 0.66 mmol)溶于无水乙醇(20 mL), 缓慢加入质量分数为10%的HCl水溶液, 控制反应体系pH在2~4之间, 于室温下搅拌反应过夜. 反应进程通过薄层色谱(TLC)进行监测. 反应结束后加入适量水淬灭反应, 用乙酸乙酯萃取(20 mL×3), 合并有机相, 以饱和氯化钠溶液洗涤一次, 经无水硫酸钠干燥, 过滤并浓缩滤液. 所得粗产物通过硅胶柱层析进行纯化(洗脱剂: 二氯甲烷/甲醇, V∶V=40∶1)得到化合物7a. 化合物7b~7j可参照相同方法合成.
(3β-羟基孕甾-17β-甲酰基)甘氨酸乙酯(7a): 白色固体, 产率94%. m.p. 144~145 ℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.83 (t, J=6.0 Hz, 1H), 5.27 (d, J=5.0 Hz, 1H), 4.61 (d, J=4.6 Hz, 1H), 4.08 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.90 (dd, J=17.2, 6.2 Hz, 1H), 3.68 (dd, J=17.2, 5.6 Hz, 1H), 3.26 (dd, J=10.3, 5.5 Hz, 1H), 1.19 (t, J=7.1 Hz, 3H), 0.95 (s, 3H), 0.59 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 172.74, 170.54, 141.78, 120.77, 70.48, 60.73, 56.25, 55.75, 50.23, 43.96, 42.68, 41.24, 37.82, 37.45, 36.63, 32.02, 31.88, 24.78, 23.63, 20.89, 19.61, 14.54, 13.35; HREIMS calcd for C24H37NO4 [M＋H＋] 404.2801, found 404.2802.
(3β-羟基孕甾-17β-甲酰基)-L-缬氨酸乙酯(7b): 白色固体, 产率90%. m.p. 150~151 ℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.49 (d, J=7.6 Hz, 1H), 5.27 (d, J=4.8 Hz, 1H), 4.15~4.04 (m, 3H), 3.26 (dt, J=11.0, 5.9 Hz, 1H), 1.18 (t, J=7.0 Hz, 3H), 0.94 (s, 3H), 0.89 (t, J=7.0 Hz, 6H), 0.55 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 172.64, 172.10, 141.82, 120.75, 70.49, 60.58, 58.15, 56.42, 55.02, 50.34, 44.16, 42.71, 37.47, 36.63, 32.04, 31.90, 29.98, 24.85, 23.69, 20.89, 19.61, 19.40, 18.96, 14.59, 13.52; HREIMS calcd for C27H43NO4 [M＋H＋] 446.3270, found 446.3271.
(3β-羟基孕甾-17β-甲酰基)-L-酪氨酸乙酯(7c): 白色固体, 产率75%. m.p. 166~167 ℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.68 (d, J=7.4 Hz, 1H), 7.00 (d, J=8.0 Hz, 2H), 6.65 (d, J=8.2 Hz, 2H), 5.26 (d, J=4.8 Hz, 1H), 4.39 (q, J=7.5 Hz, 1H), 4.00 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.43 (t, J=7.0 Hz, 2H), 3.32~3.20 (m, 1H), 2.85 (t, J=7.1 Hz, 2H), 1.06 (t, J=7.0 Hz, 3H), 0.94 (s, 3H), 0.52 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 172.34, 172.28, 156.40, 141.80, 130.43, 127.86, 120.77, 115.41, 70.47, 60.71, 56.49, 56.32, 55.37, 54.33, 50.26, 44.08, 42.69, 37.68, 37.46, 36.62, 36.34, 32.01, 31.88, 24.78, 23.64, 20.85, 19.61, 19.02, 14.45, 13.43; HREIMS calcd for C31H43NO5 [M＋H＋] 510.3219, found 510.3215.
(3β-羟基孕甾-17β-甲酰基)-L-脱氧蒜氨酸乙酯(7d):黄色油状物, 产率73%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 6.15 (d, J=7.7 Hz, 1H), 5.75 (dd, J=17.3, 9.6 Hz, 1H), 5.34 (d, J=4.8 Hz, 1H), 5.26~5.02 (m, 2H), 4.81 (d, J=7.7 Hz, 1H), 4.22 (q, J=7.2 Hz, 2H), 3.51 (t, J=4.8 Hz, 1H), 3.13 (s, 2H), 2.93 (dd, J=6.9, 5.2 Hz, 2H), 1.30 (t, J=7.1 Hz, 3H), 1.01 (s, 3H), 0.70 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 172.64, 171.08, 140.93, 133.59, 121.23, 117.91, 71.51, 61.74, 56.75, 56.46, 51.44, 50.07, 44.01, 42.18, 38.12, 37.29, 36.54, 35.10, 32.71, 31.91, 31.80, 31.53, 24.50, 23.33, 21.00, 19.40, 14.15, 12.93; HREIMS calcd for C28H43NO4S [M＋H＋] 490.2991, found 490.2992.
(3β-羟基孕甾-17β-甲酰基)-L-丙氨酸乙酯(7e): 白色固体, 产率94%. m.p. 181~182 ℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (d, J=6.9 Hz, 1H), 5.34~5.18 (m, 1H), 4.59 (dd, J=4.7, 1.0 Hz, 1H), 4.29 (p, J=7.2 Hz, 1H), 4.06 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.31~3.21 (m, 1H), 1.27 (d, J=7.2 Hz, 3H), 1.17 (t, J=7.1 Hz, 3H), 0.95 (s, 3H), 0.57 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 173.28, 172.08, 141.80, 120.77, 70.48, 60.75, 56.38, 55.39, 50.29, 47.96, 44.12, 42.71, 37.70, 37.47, 36.63, 32.04, 31.90, 24.84, 23.59, 20.86, 19.61, 17.36, 14.52, 13.43; HREIMS calcd for C25H39NO4 [M＋H＋] 418.2957, found 418.2961.
(3β-羟基孕甾-17β-甲酰基)-L-亮氨酸乙酯(7f): 白色固体, 产率89%. m.p. 167~168 ℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.66 (d, J=7.6 Hz, 1H), 5.27 (d, J=4.9 Hz, 1H), 4.59 (d, J=4.6 Hz, 1H), 4.31 (ddd, J=9.6, 7.5, 5.0 Hz, 1H), 4.06 (qd, J=6.3, 5.5, 2.5 Hz, 2H), 3.26 (dq, J=10.9, 5.4 Hz, 1H), 1.17 (t, J=7.1 Hz, 3H), 0.95 (s, 3H), 0.89 (d, J=6.4 Hz, 3H), 0.84 (d, J=6.3 Hz, 3H), 0.56 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 173.20, 172.40, 141.82, 120.75, 70.49, 60.72, 56.38, 55.38, 50.70, 50.31, 44.13, 42.71, 37.73, 37.48, 36.63, 32.05, 31.90, 24.86, 24.69, 23.65, 23.22, 21.79, 20.88, 19.61, 14.53, 13.46. HREIMS calcd for C28H45NO4 [M＋H＋] 460.3427, found 460.3430.
(3β-羟基孕甾-17β-甲酰基)-L-甲硫氨酸乙酯(7g): 无色油状物, 产率76%. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.72 (d, J=7.5 Hz, 1H), 5.27 (d, J=4.8 Hz, 1H), 4.57 (d, J=4.6 Hz, 1H), 4.39 (td, J=8.1, 5.3 Hz, 1H), 4.08 (q, J=7.0 Hz, 2H), 3.26 (dt, J=11.2, 6.6 Hz, 1H), 2.04 (s, 3H), 1.18 (t, J=7.1 Hz, 3H), 0.95 (s, 3H), 0.57 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 172.53, 172.46, 141.82, 120.75, 70.49, 60.90, 56.39, 55.43, 51.53, 50.30, 44.15, 42.71, 37.75, 37.48, 36.63, 32.05, 31.90, 30.86, 30.21, 24.85, 23.65, 20.88, 19.61, 15.04, 14.53, 13.45; HREIMS calcd for C27H43NO4S [M＋H＋] 478.2991, found 478.2992.
(3β-羟基孕甾-17β-甲酰基)-L-苯丙氨酸乙酯(7h): 白色固体, 产率79%. m.p. 66~67 ℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.27 (dd, J=8.0, 6.2 Hz, 2H), 7.25~7.19 (m, 1H), 7.16~7.03 (m, 2H), 5.80 (d, J=7.8 Hz, 1H), 5.32 (d, J=5.4 Hz, 1H), 4.87 (dt, J=7.8, 6.0 Hz, 1H), 4.15 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.48 (td, J=6.5, 3.3 Hz, 1H), 3.11 (d, J=6.1 Hz, 2H), 1.23 (t, J=7.1 Hz, 3H), 0.99 (s, 3H), 0.66 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 172.50, 171.85, 141.00, 136.04, 129.24, 128.50, 127.03, 121.15, 71.45, 61.39, 56.72, 56.41, 52.92, 50.08, 43.87, 42.19, 38.01, 37.92, 37.30, 36.54, 31.89, 31.80, 31.51, 24.45, 23.37, 20.95, 19.38, 14.10, 12.85; HREIMS calcd. for C31H43NO4 [M＋H＋] 494.3270, found 494.3272.
(3β-羟基孕甾-17β-甲酰基)-L-苏氨酸乙酯(7i): 白色固体, 产率72%. m.p. 116~117 ℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 6.19 (d, J=8.9 Hz, 1H), 5.34 (d, J=4.9 Hz, 1H), 4.58 (dd, J=8.8, 2.5 Hz, 1H), 4.35 (dd, J=6.6, 2.4 Hz, 1H), 4.21 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.50 (dt, J=11.1, 5.9 Hz, 1H), 3.30 (s, 1H), 1.29 (t, J=7.1 Hz, 3H), 1.21 (d, J=6.3 Hz, 3H), 1.01 (s, 3H), 0.71 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 173.49, 171.34, 140.86, 121.31, 71.57, 67.70, 61.57, 57.27, 56.76, 56.51, 50.13, 44.09, 42.12, 38.07, 37.32, 36.55, 31.94, 31.93, 31.82, 31.49, 24.54, 23.45, 21.03, 20.13, 19.39, 14.17, 12.91; HREIMS calcd. for C26H41NO5 [M＋H＋] 448.3063, found 448.3066.
(3β-羟基孕甾-17β-甲酰基)-L-丝氨酸乙酯(7j): 白色固体, 产率74%. m.p. 206~207 ℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.46 (d, J=5.1 Hz, 1H), 5.27 (s, 1H), 4.96 (s, 1H), 4.59 (t, J=3.9 Hz, 1H), 4.36 (dq, J=8.4, 4.3 Hz, 1H), 4.08 (dd, J=7.0, 3.0 Hz, 2H), 3.74~3.64 (m, 2H), 3.30~3.19 (m, 1H), 1.18 (td, J=7.0, 3.0 Hz, 3H), 0.95 (d, J=3.1 Hz, 3H), 0.58 (d, J=3.2 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 172.34, 171.22, 141.81, 120.78, 70.48, 61.76, 60.86, 56.31, 55.49, 55.14, 50.25, 44.10, 42.69, 37.60, 37.45, 36.63, 32.04, 31.88, 24.82, 23.55, 20.88, 19.61, 14.54, 13.40; HREIMS calcd for C25H39NO5 [M＋ H＋] 434.2906, found 434.2909.
3.2.5 化合物8a~8d的合成
在装有磁力搅拌子的圆底烧瓶中, 将化合物7a (0.27 g, 0.67 mmol)溶于无水乙醇(20 mL), 缓慢滴加质量分数为10%的NaOH水溶液, 将反应体系pH调节至10~12, 于室温下搅拌反应过夜. 反应进程通过薄层色谱(TLC)进行监测. 反应结束后, 用稀盐酸(1.0 mol/L)将混合物pH调至2~4, 减压浓缩除去大部分溶剂, 所得残余物用乙酸乙酯萃取三次. 合并有机相, 用饱和氯化钠溶液洗涤一次, 经无水硫酸钠干燥, 过滤后减压蒸去溶剂. 粗产物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂: 二氯甲烷/甲醇, V∶V=30∶1), 得到化合物8a. 化合物8b~8d参照相同方法合成.
(3β-羟基孕甾-17β-甲酰基)甘氨酸(8a): 白色固体, 产率67%. m.p. 206~207 ℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.70 (s, 1H), 5.26 (d, J=4.9 Hz, 1H), 3.80 (dd, J=17.3, 6.0 Hz, 1H), 3.63 (dd, J=17.3, 5.6 Hz, 1H), 3.31~3.20 (m, 1H), 0.94 (s, 3H), 0.58 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 172.59, 171.98, 141.77, 120.79, 70.48, 56.25, 55.78, 50.23, 43.91, 42.69, 41.19, 37.85, 37.45, 36.63, 32.01, 31.88, 24.79, 23.66, 20.94, 19.62, 13.38; HREIMS calcd for C22H33NO4 [M＋H＋] 376.2488, found 376.2487.
(3β-羟基孕甾-17β-甲酰基)-L-缬氨酸(8b): 白色固体, 产率63%. m.p. 247~248 ℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.40 (s, 1H), 7.30 (d, J=8.0 Hz, 1H), 5.27 (d, J=4.9 Hz, 1H), 4.61 (s, 1H), 4.12 (dd, J=7.9, 6.0 Hz, 1H), 3.26 (p, J=5.9 Hz, 1H), 0.94 (s, 3H), 0.90 (s, 3H), 0.88 (s, 3H), 0.56 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 173.63, 172.52, 141.78, 120.78, 70.49, 57.87, 56.39, 55.12, 50.32, 44.13, 42.70, 37.50, 37.45, 36.62, 32.01, 31.90, 30.04, 24.85, 23.74, 20.95, 19.61, 19.57, 18.80, 13.53; HREIMS calcd for C25H39NO4 [M＋H＋] 418.2957, found 418.2960.
(3β-羟基孕甾-17β-甲酰基)-L-酪氨酸(8c): 白色固体, 产率59%. m.p. 214~215 ℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.22 (s, 1H), 7.48 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.01 (d, J=8.2 Hz, 2H), 6.65 (d, J=8.1 Hz, 2H), 5.30~5.21 (m, 1H), 4.38 (td, J=8.3, 5.4 Hz, 1H), 3.26 (t, J=5.1 Hz, 1H), 3.17 (s, 1H), 2.91 (dd, J=13.9, 5.4 Hz, 1H), 2.80 (dd, J=13.9, 8.9 Hz, 1H), 2.51 (s, 1H), 0.93 (s, 3H), 0.52 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 173.79, 172.24, 156.28, 141.76, 130.43, 128.27, 120.79, 115.38, 70.49, 56.27, 55.49, 54.13, 50.25, 49.06, 44.02, 42.67, 37.68, 37.45, 36.61, 36.35, 31.99, 31.87, 24.76, 23.70, 20.92, 19.60, 13.39; HREIMS calcd for C29H39NO5 [M＋H＋] 482.2906, found 482.2904.
(3β-羟基孕甾-17β-甲酰基)-L-脱氧蒜氨酸(8d): 白色固体, 产率63%. m.p. 167~168 ℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 6.34 (dd, J=19.3, 7.5 Hz, 1H), 5.74 (dd, J=17.0, 9.9 Hz, 1H), 5.35 (s, 1H), 5.30 (s, 1H), 5.21~5.06 (m, 2H), 4.81 (dd, J=7.4, 5.1 Hz, 1H), 3.62~3.52 (m, 1H), 3.14 (d, J=6.9 Hz, 2H), 2.97 (d, J=4.2 Hz, 2H), 1.00 (s, 3H), 0.69 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 173.34, 173.31, 140.57, 133.61, 121.51, 118.01, 71.80, 56.78, 53.48, 51.52, 50.01, 44.23, 41.63, 38.07, 37.28, 36.54, 35.17, 34.96, 32.54, 31.92, 31.07, 24.53, 23.37, 21.09, 19.42, 12.97; HREIMS calcd for C26H39NO4S [M＋H＋] 462.2678, found 462.2682.
3.2.6 MTT实验
将生长良好的细胞(4×104个/mL)在96孔板中孵育, 并在培养箱中培养24 h. 分别以不同浓度的化合物作用于肿瘤细胞. 对照孔为不含化合物的细胞. 培养一段时间后, 向每个孔中加入20 μL MTT (5 mg/mL), 再培养4 h. 弃去上清液, 每孔加入200 μL DMSO, 振摇10 min, 用Bio-Tek ELX 800分析仪, 490 nm下测定OD值.
细胞抑制率(%)=[(OD阳性－OD阴性)－(OD实验－OD阳性)]/(OD阳性－OD阴性)×100%
采用GraphPad Prism 8软件计算化合物的IC50值, 并进行统计学差异分析.
辅助材料(Supporting Information) 化合物的1H NMR、13C NMR和HRMS谱图. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.
(Zhao, C.)