G-四链体(G-quadruplex, G4)作为一类富鸟嘌呤的特殊核酸结构, 广泛且大量地存在于人类端粒末端, 在特定的生理条件下, 这些富鸟嘌呤序列能够折叠形成非经典的G4结构. 同时, 它们还可与其他核酸结构, 如常见的双链结构, 在不同的环境因素影响下相互转换与共存[1]. 据统计, 人类基因中大概有37.6万个富鸟嘌呤的脱氧核糖核酸(DNA)序列, 这些序列多以一种高度保守的“5'-GxLyGxLyGxLyGx-3'”形式存在. 在该序列模式里, “Gx”表示连续鸟嘌呤单元, “x”表示所含鸟嘌呤的个数, 其值介于2到4之间; 而“Ly”则代表着连接各个Gx区域的loop环序列, L表示除鸟嘌呤外的其他种类碱基, “y”则表示碱基的个数[2].
在生命体复杂而精密的运作体系中, G4发挥着极为关键的调控作用. 通过自身结构有条不紊地组装与解组装过程, G4深度参与到基因翻译、转录等一系列核心生理过程的干预和调控机制中[3-4]. 近年来, 随着科研探索的不断深入, 越来越多的研究证据表明, G4具有作为一些重大疾病生物标志物的潜力, 尤其是在癌症以及神经退行性疾病等领域[5-7]. 在癌症研究中, G4结构的异常变化可能与癌细胞的增殖、转移以及耐药性的产生密切相关; 而在神经退行性疾病方面, 特定G4结构的形成或解聚过程, 或许与神经元的损伤和病变存在着内在联系. 基于此, G4能够为疾病的早期诊断、病情监测以及治疗方案的制定提供全新的视角与靶点, 这也进一步彰显了G4相关研究在基础科学和临床应用领域所蕴含的广阔前景与巨大潜力.
1 G4结构
早在1910年, Bang等[8]便率先观察到, 当鸟苷酸处于高浓度条件时, 会展现出独特的凝胶化现象, 这一发现首次确凿地证明了富鸟嘌呤序列拥有形成高阶结构的潜在可能性. 之后, Gellert和Davies等[9]的研究发现, 鸟苷酸溶液无论初始浓度如何, 随着时间的推移, 溶液最终均会演变成凝胶状态. 为了深入解析这种凝胶背后的微观结构奥秘, Davies等借助光学和X射线衍射技术对凝胶展开表征工作. 在对实验数据进行深度剖析与阐释后, 他们大胆推断鸟苷酸形成了一种全新的螺旋结构. 在此结构里, 四个鸟嘌呤分子借助胡斯坦氢键与相邻鸟嘌呤构建出一个正方形平面(图1). 他们[10]进而猜测, 这些平面结构彼此间存在强大作用力, 促使平面层层堆叠, 从而构建出复杂且有序的三维结构. 1988年, Sen等[11]证实富鸟嘌呤序列能够自发组装, 形成四链结构. 在此结构中, 由四个鸟嘌呤构成的平面相互堆叠, 形成三维形态, 这与Davies等先前的推测相吻合. 后来, 人们把这种由两个或更多G-四平面, 通过π-π堆叠而产生的四链结构命名为G-四链体(G4)[12]. 值得深入探究的是, G4结构的形成并非由单一因素决定, 而是受到多种复杂因素的综合调控. 如连续鸟嘌呤个数、连接连续鸟嘌呤的linker长度、G-四平面个数和极性以及G4组装条件(如离子、pH、温度和粘度等)等, 因此其结构具有多样性. 如图1所示, 根据其鸟嘌呤的折叠方向, 可分为平行、反平行及混合构型等多种构型.
2 G4与配体的相互作用
G4具有特殊的空间结构, 它能够与多种配体发生特异性结合. 配体的结合不仅可以稳定G4结构, 结合过程还会产生荧光信号[13], 或是形成具有类辣根过氧化物酶活性的DNAzyme[14]. 已报道的配体分子如卟啉类分子(如原卟啉(PPIX))、噻唑橙(TO)及其衍生物、香豆素类化合物(如BnBtC)、硫磺素T (ThT)及其衍生物、咔唑类衍生物(如BMVC)和天然产物(如金丝桃素(Hyp)、小檗碱(Berberine)等)(图2)[15-16]. 这类配体通常具有如下特点: (1)具有一个大的共轭结构, 能与G4发生π-π堆叠; (2)芳香环上有一个或多个灵活的侧链, 允许引入特定的官能团, 有利于与G4的凹槽、环或者单个碱基相互作用[17-19]. 配体与G4主要通过以下三种模式结合(图3)[20-21]: (1)配体通过π-π堆叠在G4末端外部; (2)配体的柔性链嵌插在G4结构的腔体内; (3)配体通过静电作用结合在G4的凹槽或loop环上. 随着技术手段的不断进步, 配体与G4特异性结合的方式已经越来越清晰. 但是, 实际的结合方式要比预测的更为复杂. 大量实验数据表明, 配体更倾向以低能量的方式与G4结合, 如在G4外平面上或者末端堆叠[20-23]. 根据G4结合配体产生的信号常将配体分为发光配体[16]和能够形成具有类过氧化物酶性质的DNAzyme配体[24-25](如血红素和铜离子)两大类, 基于以上特性进行DNA分子探针开发.
迄今为止, 基于荧光强度、波长或寿命的变化, 已经开发了各种G4激活的生物传感平台, 这些配体特别是荧光配体, 由于其非侵入性、优异的时空分辨率、高灵敏度和低成本, 已成为探索G4及其在生命体系中生理作用的强大而重要的工具[26]. 本文对近年来G4荧光探针在生物传感(检测目标物包括金属离子、蛋白、核酸)、细胞成像以及癌症治疗等关键领域所取得的最新突破性研究进展进行全面且系统的梳理与总结, 并基于当前的研究现状和未来的发展趋势, 对G4荧光探针的未来研究方向提出前瞻性的展望与思考.
3 G4生物传感应用
3.1 金属离子检测
当G4结构形成后, 其中心部位会出现一个中心腔体. 由于中心腔体的尺寸与部分金属离子或小分子的半径大小相仿, 因此G4结构具备对单价或二价金属离子一定的选择性识别能力[26]. 诸如K＋、Na＋以及Pb2＋等阳离子, 能够凭借静电作用与鸟嘌呤的O6位点结合. 这种结合作用发生在G4的中心腔体处或者表面, 使G4结构得到进一步的稳固. 钾离子是生理过程不可或缺的金属离子, 生命体内的钾离子水平在一定程度上也反映着一些疾病的发生和变化, G4因其结构腔体尺寸与钾离子相近, 成为检测钾离子的利器. 自2009年Kong团队[27]报道了基于G4特异性荧光探针结晶紫(CV, 一种三苯基甲烷染料)来监测K＋诱导的G4构象变化, 人们开发了大量针对不同金属离子的分析传感平台. Wang等[28-31]较早地开展了相关金属离子分析研究, 如利用分子间切和分子内切分策略, 通过G4结构形成后与配体结合所产生的特异性荧光增强效应, 实现对钾离子的灵敏检测(图4A); 钠离子同样也是一种不可忽视的金属离子, 相较于钾离子, 钠离子存在时G4更倾向于形成反平行构型, 这也为钠离子的检测提供了良好契机, 人们巧妙地利用花菁类化合物MTC对不同构型G4的特异性识别, 搭建了钠离子和钾离子比率型分析检测平台[32]; 铅离子作为常见的环境污染物, 在环境中极难降解, 能够长期留存, 并借由土壤、水体等介质侵入生态系统. 经食物链的富集作用, 铅离子在生物体内不断累积, 对生物体的神经系统、血液系统、免疫系统等造成严重损害. 因此, 实现对铅离子的灵敏检测至关重要. 研究人员基于铅离子可诱导单链富鸟嘌呤序列(T30695)折叠形成G4, 该G4与锌卟啉(ZnPPIX)特异性结合并产生强烈荧光, 开发出一种便捷且免标记的铅离子检测平台(图4B). 将其应用于环境样品中, 对自来水和肥料样品里的铅离子水平进行分析, 获得了准确可靠的结果. 不仅如此, 该检测体系还能结合电化学手段, 在单链的两端修饰巯基和二茂铁基团. 当有铅离子存在时, 富鸟嘌呤序列结构会发生变化, 进而引起金电极表面的电位差改变, 以此实现铅离子的灵敏、快速检测[33-34]; 锰离子的存在会诱发神经退行性疾病, 人体内锰离子含量的灵敏监测能为疾病病程的判断提供依据. Mizunuma 等[35]基于G4与ThT的特异性结合进行圆二色和荧光光谱分析, 筛选出在锰离子存在时能够折叠成G4结构富鸟嘌呤序列(称为MnG4C1). 经血清抗性和热稳定性分析表明, MnG4C1依赖Mn2＋获得稳定结构. 对MnG4C1末端进行荧光基团修饰, 发现其能够通过锰离子依赖的构象变化产生荧光变化, 从而实现锰离子的有效监测;汞是一种对环境和生命安全有极大危害的重金属元素. Bai等[36]巧妙地利用T-Hg-T结构与G4稳定性差异进行一种灵敏的汞离子传感器的开发, 成功地实现自然水体环境中汞离子的检测(图4C); 基于铜离子催化的炔-叠氮化物环加成反应, 利用形成的分子内G4结合结晶紫作为信号输出元件, 实现铜离子的灵敏分析[37].
图4 基于G4进行金属离子检测应用实例: (A)基于G4与Zn-DIGP的特异性结合进行钾离子(K＋)的检测[31]; (B)基于T30695和ZnPPIX的特异性结合和铅离子(Pb2＋)诱导的G4组装完成铅离子(Pb2＋)的检测[34]; (C)利用T-Hg-T与G4结构稳定性差异实现汞离子(Hg2＋)的灵敏分析[36]Figure 4 Examples of metal ion detection applications based on G4: (A) Detection of potassium ions (K＋) based on the specific binding of G4 to Zn-DIGP;[31] (B) Detection of lead ions (Pb2＋) based on the specific binding of T30695 and ZnPPIX and lead ion-induced G4 assembly;[34] (C) Sensitive analysis of mercury ions (Hg2＋) by using the difference in structural stability between T-Hg-T and G4[36] (A) Copyright (2010) American Chemical Society; (B) Copyright (2010) American Chemical Society; (C) Copyright (2014) The Royal Society of Chemistry |
3.2 蛋白检测
蛋白作为生命体不可或缺的组分, 在生理过程中发挥着不可替代的作用, 蛋白的异常表达通常被认为机体发生了某些或好或坏的变化, 也预示着重大疾病发生的可能[38-39]. 高糖基化跨膜糖蛋白粘蛋白1 (MUC1)[40]、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-5 (Siglec-5)[41]、前梯度同源蛋白2 (AGR2)[42]、蛋白酪氨酸激酶-7 (PTK7)[43]、甲胎蛋白(AFP)[44]、癌胚抗原(CEA)[45-46]和前列腺特异性抗原(PSA)[47]等蛋白分子, 因其在癌症病发过程中发挥重要调节作用, 或者在肿瘤组织中大量表达, 被认为是相关肿瘤生物标志物, 可通过这些蛋白的定量监测对病程进行判断. 重大疾病相关标志蛋白的精准分析是一种简单便捷的诊疗及预后的判断方法, 同时能够帮助我们了解其在生理过程中发挥的作用. 传统常用的测定方法包括酶联免疫法[48]、电化学方法[49]以及核酸扩增方法, 例如聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、杂交链反应(HCR)和催化发夹自组装(CHA)等[50], 这些方法不可避免地存在一些局限性, 如环境耐受性差、成本高、耗时长、抗体不稳定和不便于进行实时监测等. 大量实验数据表明, 在基因组的调控区域, 包括端粒、启动子和50个非编码区, 存在大量可能形成G4的序列, G4通过与相关蛋白结合, 从而发挥多种生物学功能. 这些能够与G4结合的蛋白往往与一些疾病的发生相关, 可作为疾病治疗的药物靶点及疾病标志物对病程进行监测和判断[51]. 除此之外, G4与其配体结合形成的特异性荧光探针, 因其具有非侵入性、生物相容性高、成本低和易合成等特点被广泛应用于疾病相关蛋白的分析检测. 如凝血酶是一种重要的凝血因子, 在止血、血液疾病和癌症等方面发挥重要功能[52]. 凝血酶适体(Thrombin aptamer, TBA)是最早被研究的G4适配体之一, 其优点是在凝血酶存在下可形成反平行G4结构, 基于这一特点人们构建了大量针对TBA的传感策略[53]. 除了可以利用G4适配体实现一些蛋白分子的检测, 还可以通过将G4与其他材料及方法进行结合, 实现更多蛋白的分析. 如将G4与核酸外切酶结合, 利用链霉亲和素与生物素的紧密结合, 从而阻止核酸外切酶I对单链序列的降解作用, 进而序列可以组装成G4, 与ThT紧密结合产生荧光信号, 完成链霉亲和素的定量检测(图5)[54]; 血管紧张素原(AGT)是一种存在于血清中的糖基化球蛋白, 可调节血压和体液平衡. 通过G4与磁珠的偶联进行AGT蛋白的捕获, 并通过荧光标记的二抗实现信号输出, 从而完成AGT灵敏检测平台的构建[55]; PSA被认为是一种早期诊断前列腺癌的重要生物标志物. Zhao等[56]开发了一种基于杂交链反应(HCR)和G4DNA酶的免标记荧光策略进行PSA检测. PSA存在时引发HCR反应, 产生大量富鸟嘌呤序列, 这些序列可形成具有类辣根过氧化物酶性质的DNAzyme, 通过催化氧化硫胺素产生荧光信号实现PSA蛋白在血清样品中的精准灵敏检测.
3.3 核酸分析
核酸在生命过程中扮演着重要角色, 在基因的翻译、转录及调节过程中发挥重大作用. 同时核酸[包括DNA和核糖核酸(RNA)]也是重要的生物标志物, 在一些关键生理过程中发挥重要作用, 其异常表达多与疾病的发生、发展及预后密切相关, 因此对于核酸生物标志物的灵敏、特异性检测在疾病的早期诊断、病程检测和预后评估以及传染病防控中具有重要意义[61]. 目前已被报道的核酸生物标志物包括单链DNA (ssDNA)、双链DNA (dsDNA)、microRNA (miRNA)和非编码RNA 等[61-62]. 检测手段主要有各种核酸扩增线路(如PCR、LAMP、RCA和CHA等)、高效液相色谱及其他方法[63-65]. 然而这些方法存在设计复杂、流程繁琐、耗时长、成本高、需昂贵设备、样本处理困难、重复性差且准确度低等缺点[66]. 因此, 开发新型高效检测方法以克服上述局限性, 对生物标志物的研究与临床诊断具有重要意义. G4的结构多样性, 使其在核酸分析检测领域备受关注, 尤其是核酸生物标志物如疾病(特别是癌症)相关基因和miRNA[67-68]的检测. Li等[57]将基因编辑技术(CRISPER/Cas12a)与G4@PPIX荧光探针结合, 实现了模型目标物ssDNA、dsDNA和RNA皮摩尔级别以下的直接检测, 同时对甲流临床样本检测结果与PCR结果对比, 证明该方法在实际应用中切实可行(图6A). Zhao等[69]联合CRISPR/Cas12a和G4开发了一种兼具荧光和比色信号的双信号传感器, 实现了循环肿瘤DNA (ctDNA)在血清中的灵敏检测, 该方法展现出优异的抗干扰能力和单碱基突变识别能力. 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)曾一度肆虐全球, 对人类的生命健康造成巨大威胁[70]. G4生物传感体系在SARS-CoV-2的检测方面表现优异[71], 已有研究证实, SARS-CoV-2基因组中存在高度保守且可形成G4(cDNA)的序列. 利用SARS-CoV-2致病基因组序列中含有的cDNA作为潜在的诊断目标, 通过TPAMB小分子与cDNA的特异性结合产生的荧光增强, 实现对SARS-CoV-2的高灵敏荧光检测[72]. 通过改变体系的pH值可以调控cDNA的构型, 从而特异性地与BTMA分子结合, 产生荧光变化, 完成SARS- CoV-2的定量分析(图6B)[58]. 超长病毒基因片段是常见的核酸生物标志物, 在乙型肝炎病毒(HBV)、诺如病毒(Nova)、布病等致病基因的分析检测中占有重要地位, Wang等[59]利用级联扩增线路偶联G4与ThT结合产生的荧光信号, 实现了HBV超长病毒基因片段的超灵敏分析检测. 大量的研究表明, miRNA的异常表达是肿瘤发生的前兆, 并且与细胞的无限增殖和侵袭密切相关[73-75]. 鉴于miRNA在体液及细胞中含量极低, 在检测过程中往往需要联合不同的核酸扩增线路完成, 如基于G4和外切核酸酶III(ExoIII)双信号放大策略, 结合G4与NMM结合产生的荧光信号, 实现miRNA-122的快速灵敏检测[76]. 基于2-氨基嘌呤(2-AP)与G4特异性结合产生的荧光增强信号与CHA扩增技术结合, 开发了一种用于检测miRNA (miRNA-21)的简单且高灵敏度的荧光传感器, 可实现高信噪比和宽线性范围检测[60].
图6 基于G4进行核酸分析检测平台构建实例: (A) CRISPER/Cas12a与G4结合进行多种核酸目标链检测[57]; (B)基于pH调控cDNA的构型特异性地与BTMA结合进行SARS-CoV-2的定量分析[58]Figure 6 Examples of nucleic acid analysis and detection platform construction based on G4: (A) CRISPER/Cas12a combined with G4 for multiple nucleic acid target strand detection;[57] (B) Quantitative analysis of SARS-CoV-2 based on the configuration of pH-regulated cDNA that binds specifically to BTMA[58] (A) Copyright (2024) American Chemical Society; (B) Copyright (2022) American Chemical Society |
4 成像及治疗
4.1 生物成像
G4结构已被证实参与多种细胞事件, 在包括DNA复制、转录、RNA翻译、基因组稳定性等关键生物过程中发挥重要的调控作用. 因此, 开发用于可视化G4结构的光学工具已成为研究热点[16]. 表1中我们对相关的G4序列及其相关荧光配体的光物理性质进行了总结. 例如, Liao等[77]通过将小檗碱分子与已报道的G4特异性结合的双喹啉鎓分子支架连接, 设计合成了两种智能小檗碱-双喹啉鎓缀合物(Ber-360A和Ber-PDS), 基于此开发了高灵敏度和选择性的生物传感平台, 可有效区分mtG4s与其他类型的G4和双链DNA, 同时Ber-PDS可以进入核仁靶向G4 DNA, 并且还表现出强大的端粒酶抑制和抗肿瘤活性; 大量的实验数据表明RNA G4s也具有成为癌症标志物的巨大潜力. SCY-5是一种超分子聚合物, 由于其负电荷数、分子骨架大小和亚甲基桥长度的最佳组合, 使其能高度特异性识别平行G4拓扑结构. 基于SCY-5在细胞环境中对平行G4s的特异性识别, 成功实现了细胞中RNA G4s的原位识别, 定量检测了从胰腺癌、乳腺癌和肝癌患者的静脉血中提取的RNA G4s, 首次发现这些癌症患者的RNA G4s形成增加(图7A)[78]. 同样不可忽视的是, G4 DNA和RNA都可以成为细胞成像和细胞周期监测等工作的得力助手. Nie 等[79]创新性地将绿色荧光蛋白(GFP)发色团构建模块与香豆素6H进行结合, 成功开发了首款具有校准功能的比率型G4探针NHCouI. 研究发现, NHCouI未与G4结合时, 只有香豆素6H部分能够产生明亮的绿色荧光(发射波长为490 nm), 而咪唑啉酮部分仅产生微弱的红色荧光(发射波长为613 nm); NHCouI与G4结合后, 香豆素6H结构产生的绿色荧光强度不变, 而咪唑啉酮产生的红色荧光强度则显著增强. NHCouI凭借独特的荧光响应特性成为细胞内G4检测与成像的高灵敏探针. 基于该探针, 该研究团队首次实现了细胞凋亡过程的成像分析, 为探究细胞死亡进程中细胞核的动态变化机制提供了全新的可视化策略(图7B), 极大地推动了细胞死亡领域的研究进展. 在G4探针应用中, 化合物荧光发射波长影响重大. 短的荧光发射波长的探针在进行体内成像和细胞行为活动时, 其灵敏度受背景荧光干扰大、光稳定性差、易光漂白等因素的限制. 而具有长荧光发射波长(如近红外区)的探针能减少干扰, 提升检测灵敏度与准确性. 因此, 开发具有长荧光发射波长G4响应探针的意义重大, 可有效拓展更多应用场景[80]. Shangguan等[81]通过在TO的喹啉环邻位上连接不同的苯乙烯基团, 成功地设计并合成了4个TO衍生物(5a~5d), 与G4s结合后, 5a和5b具有明显的吸收红移和显著的荧光增强, 表明它们可以作为G4s的良好荧光探针. 荧光滴定实验进一步证明5a和5b与G4s能够稳定地结合. 此外, 细胞染色和成像实验表明, 5b能进入活细胞的细胞核和核仁, 具有识别DNA和RNA G4的巨大潜力. Li等[82]开发的新型萘酰胺探针AI7, 通过将四芳基咪唑荧光团单元与具有抗肿瘤作用的萘酰亚胺官能团偶联, 实现了对混合构型G4的特异性结合. 在AI7结构中引入苯基, 进一步增强了分子的电子离域效应. AI7与G4相互作用限制了荧光分子的非辐射跃迁, 从而启动了聚集诱导发光(AIE)特性, 尤其与混合型G4结合时, 荧光强度得到3~10倍提升, 显著优于平行和反平行G4. 光谱实验和分子对接结果证实, AI7以大沟结合方式与混合型G4特异性结合且不影响其构象. 细胞实验表明, AI7能有效靶向细胞核DNA, 可有效区分正常细胞和处于S期的肿瘤细胞, 为DNA鉴定和癌细胞识别提供了一种新方法. 此外, AI7还显示出潜在的抗肿瘤活性和良好的生物相容性. Shen等[83]通过凝胶核细胞染色实验证明了四苯乙烯衍生物TPE-B对平行G4的优异选择性. Wei等[84]基于苯并噻唑合成了三种荧光探针2a~2c, 用于检测G4 DNA, 实验结果表明这些化合物能够稳定G4结构, 同时具有较低的细胞毒性和细胞核成像能力.
表1 部分G4探针的光物理性质Table 1 Photophysical properties of some G4 probes |
| Fluorescent ligand | G4 name | G4 topology | Ex/Em/nm | Kd/(µmol•L－1) | References |
|---|---|---|---|---|---|
| NIRG-2 | Pu22 | Parallel | 850/940 | 1.71±1.13 | [19] |
| 5a | Pu22 | Parallel | 575/650 | 1.549±0.080 | [81] |
| 5b | Pu22 | Parallel | 550/630 | 1.783±0.210 | [81] |
| AI7 | 21CTA | Hybrid | 389/500 | 1.3 | [82] |
| IZIN-1 | mt6363 | Parallel | 538/660 | — | [89] |
| ISAP | c-Myc | Parallel | 640/702 | 1.09 | [92] |
| SF3 | mt6363 | Parallel | 550/650 | 3.5 | [93] |
图7 基于G4进行细胞成像平台构建的实例: (A) SCY-5与不同G4和核酸链结合后荧光响应效果[78]; (B) NHCouI的合成路线及其与G4结合机制[79]; (C) IZIN-1分子结构及不同G4和核酸链结合后的荧光响应效果[89]Figure 7 Examples of cell imaging platform construction based on G4: (A) Fluorescence response effect of SCY-5 after binding to different G4 and nucleic acid chains;[78] (B) Synthesis route of NHCouI and its binding mechanism with G4;[79] (C) IZIN-1 molecular structure and fluorescence response effects of different G4 and nucleic acid chains binding[89] (A) Copyright (2024) American Chemical Society; (B) Copyright (2023) The Royal Society of Chemistry; (C) Copyright (2021) Elsevier B.V. |
线粒体通过氧化磷酸化在细胞能量生成中发挥重要作用, 是癌症治疗的一个很有前途的治疗靶点. 最近研究表明, G4 DNA存在于线粒体基因组中. 生物信息学分析已经确定了大约200个潜在的线粒体G4 DNA (mtG4s), 它们被认为在线粒体代谢中发挥了关键作用, 并且更频繁地在癌细胞中形成, 已报道的相关G4序列如表2所示[20,85-86]. 此外, 与正常细胞相比, 癌细胞线粒体的膜电位更负, 能被带有正电荷的化合物优先靶向. 在这种背景下, 与人类基因组其他区域的G4相比, mtG4s可能是作为一种新抗癌药物靶点更好选择[87-88]. 因此, G4成为癌症、神经系统疾病和病毒感染诊疗的潜在研究对象, 大量与G4相关的治疗及成像工作被报道. 如Hu等[89]通过偶联典型的G4配体分子和线粒体靶向AIE发光分子, 设计了一种具有AIE活性的近红外荧光探针IZIN-1. 在水溶液中IZIN-1的分子内自由旋转导致荧光猝灭; 与mtG4s(mt6363)结合后, 分子内自由旋转受限, 在660 nm处产生明亮荧光. IZIN-1能够特异性响应细胞中的mtG4s结构, 并产生强烈的荧光, 可用于追踪活细胞中mtG4s的形成, 这项工作为研究活细胞中的mtG4s提供了一种可行的化学工具(图7C); Wang等[90]开发了一种聚甲炔链修饰三甲川菁的荧光探针α-HBCy3.5, 实现了对mtG4s的特异性标记. 通过巧妙地延长聚甲炔链长度, 引入了对mtG4s具有亲和性的功能取代基, 该探针不仅实现了发射波长的红移, 更显著地提升了与mtG4s的结合亲和力. α-HBCy3.5能够精准区分mtG4s与ssDNA、dsDNA, 且不影响mtG4s拓扑结构稳定性. 细胞水平研究显示, 该探针可迅速穿透细胞膜, 特异性定位于线粒体靶向mtG4s, 同时具备优异的光稳定性. α-HBCy3.5的成功开发, 不仅为解析内源性mtG4s在线粒体中的生物学功能提供了强有力的工具, 也为靶向G4结构的小分子药物研发提供了重要的设计思路与理论依据.
表2 已报道的G4序列信息Table 2 Reported G4 sequence information |
| Name | Sequence (5'-3') |
|---|---|
| Pu27 | TTATGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGG |
| Myc-2345 | TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA |
| Myc-1245 | TGGGGAGGGTTTTTAGGGTGGGGA |
| Myc-22 | TGAGGGTGGGTAGGGTGGGTAA |
| Pu241 | TGAGGGTGGIGAGGGTGGGGAA GG |
| ckit1 | CAGAGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGGGCTG |
| ckit2 | CCCCGGGCGGGCGCGAGGGGAGGGGAGGC |
| bcl-2 | GTCGGGGCGAGGGCGGGGGAAGGAGGGCGCGGGCGGGGA |
| K-ras | GGGAGGGAGGGAAGGAGGGAGGGAGGGA |
| VEGF | CCCGGGGCGGGCCGGGGGCGGGGTCCCGGCGGGGCGGAG |
| HIF-1α | GCGAGGGCGGGGGAGAGGGGAGGGGCGCG |
4.2 疾病诊疗方法的开发
人类端粒DNA由富含TTAGGG重复序列的双链组成, 其末端有一个100至200个核苷酸(nt)长的富含G的单链突出部分, 尽管端粒对许多细胞功能至关重要, 但在每次DNA复制过程中长度都会逐渐缩短, 而G4对于端粒维持至关重要, 同时与癌症和衰老直接相关, 使得G4成为癌症诊断及治疗的重要靶点, 为疾病诊断、治疗及药物转载策略的开发提供了新的思路. 如Chen等[91]报道了一种新型G4 DNA响应荧光探针TOH, 对体内G4 DNA进行响应型的传感和成像. TOH对DNA G4s的选择性优于其他核酸和生物分子, 可对G4 DNA动态变化进行监测, 且TOH可能具有肿瘤诊断能力(图8A). Tang等[92]设计合成了一种与G4相互作用的近红外荧光探针ISAP, 用于mtG4s结构成像. 分子对接(MD)实验表明, ISAP通过多个π-π堆积和氢键相互作用与G4 DNA相互作用, 通过荷瘤小鼠模型也证明了ISAP能在体内对mtG4s结构进行成像. Zhang等[19]成功开发了近红外二区(NIR-II)荧光探针NIRG-2, 分子对接计算表明, NIRG-2与G4结构形成稳定的氢键和强π-π相互作用, 有效抑制了扭曲的分子内电荷转移(TICT), 从而特异性地靶向G4结构并产生荧光增强. 与报道的G4探针相比, 该荧光探针不仅具有较大Stokes位移, 适用于平行G4结构的高分辨率和高对比度的NIR-II荧光成像, 而且在活的小鼠中显示出良好的生物相容性和光稳定性, 利用癌症相关的G4作为靶点, 用NIRG-2荧光探针实现了肿瘤淋巴转移可视化及肿瘤的精确切除, NIRG-2也成功用于评估癌症淋巴转移模型手术治疗和药物治疗的有效性(图8B). Hu等[93]成功地开发了一种新型近红外荧光配体SF3, 与肿瘤细胞中的mtG4s结合. mtG4s通过解聚和结合诱导发射(DBIE)机制, 诱导SF3由H-聚集体转变为单体而产生荧光. 此外, SF3对mtDNA的转录和复制有显著影响, 导致线粒体代谢中断, 细胞周期阻滞, 并诱导细胞凋亡, SF3在体内和体外对三阴性乳腺癌细胞都表现出强大的抑制作用. Wang团队[94]以四面体框架核酸(tFNA)作为载体, 自组装成一个包含G4和血红素的复合物(G4/Hemin), 开发了一种安全有效的急性肾损伤(AKI)治疗剂. 通过激活血红素加氧酶(HO-1)和清除活性氧(ROS), G4/Hemin-tFNA能够有效地抑制病变, 为未来AKI治疗方法的开发提供了一种有前途的方法.
图8 基于G4进行癌症治疗方法实例. (A) TOH与G4结合进行的体内成像原理及成像图[91]. (B) NIRG-II荧光探针分子设计及用于肿瘤淋巴转移可视化监测[19]Figure 8 Example cancer treatment methods based on G4. (A) (A) In vivo imaging principle and imaging diagram of TOH combined with G4.[91] Copyright (2024) Elsevier B.V. (B) Molecular design of NIRG-II fluorescent probe and its application in visualization of tumor lymphatic metastasis.[19] Copyright (2024) American Chemical Society |
5 总结与展望
G4与众多生命过程紧密相连, 在DNA复制调控、基因表达与稳定性等诸多关键生命过程中, 发挥着举足轻重的作用, 使其在疾病的诊断和治疗领域具有重大意义. G4独特的结构和特殊的生理功能, 也让其成为开发生物传感和荧光成像技术开发的理想平台. 近年来, 尽管涌现出众多新型G4荧光探针, 这些探针在靶标检测及细胞荧光成像方面发挥了一定作用, 但仍存在显著缺陷. 现有探针难以精确鉴定生物体内的G4结构, 也无法实时监测其组装或解组装过程. 对于疾病诊断而言, 实现G4的准确体内成像至关重要, 然而目前大多数探针在近红外区域工作, 发射波长短, 面临荧光背景高、易光漂白以及聚集诱导荧光猝灭等问题, 极大地限制了其应用. 虽然近红外二区荧光探针的开发取得了一些进展, 但由于缺乏有效的设计策略, 发展受到严重阻碍, 并且多数此类探针自身荧光背景高、组织穿透性低, 难以实现G4的体内成像. 基于配体与G4的结合构建比率型荧光探针, 或者研发不依赖荧光强度的寿命型荧光探针来监测G4在体内的折叠状态和形态动力学, 为设计新型、高灵敏和低背景的G4荧光探针提供了全新的思路. 在未来一段时间内, 从分子设计层面出发, 合理开发具备稳定光物理性能的新型G4响应型荧光配体分子, 仍将是科研领域的热点与难点. 将G4与荧光配体结合形成的荧光探针应用于高质量的分子生物学体内检测, 以及相关疾病的诊疗, 有助于深入探究各类G4结构与疾病之间的内在联系, 进而推动相关疾病诊疗药物的研发进程.
(Cheng, F.)