2001年, 唐本忠课题组[1]首次报道了聚集诱导发光效应(AIE). 与聚集诱导淬灭效应(ACQ)相比较, AIE特性分子在聚集态和固态时产生荧光发射, 而在溶液中分散状态时观察不到荧光发射现象, 其原因为聚集态时限制了分子振动和转动. 因分子在聚集态时荧光显著增强, 从而在许多领域表现出潜在的应用价值, 特别是作为机械响应材料, 在光电、生物成像和传感领域应用广 泛[2-4]. 有机晶体的荧光性能通常情况下由化学结构决定, 其分子构象和堆积方式说明, 有机化合物在固体状态下可以产生不同的荧光性能[5-7]. 因此, 对分子构象与性能之间关系的研究是比较热门的课题[8-9].
多晶态是固体材料由非晶态向晶态转变时形成的一种结晶状态[10-12], 不同多晶型物通常表现出迥异的热力学、结构及物理性能. 因为分子的固体状态能够产生不同的发光性能, 所以科研工作者对有机材料多晶体的研究产生了极大兴趣[13]. 多晶态物质常表现出不同形态、颜色、稳定性、分子构象或堆积模式. 研究多晶体对理解同一分子的结构关系对分子发光性能的影响的调节具有极大帮助[14-16]. 多晶态现象在分子晶体中较为常见. 在改变温度、压力或溶剂条件时, 体系中可出现两种或多种晶型共存的情况, 但其出现仍具有一定偶然性, 规律性不强. 在聚集状态下, 分子内的旋转受限和分子内的π-π堆积作用抑制了构象扭曲, 从而产生荧光发射. 尽管有机分子堆积对荧光性能的影响已得到广泛认可[17], 但其内在机制仍有待深入阐明. 因此, 对于有机多晶体的研究仍然十分必要[181920-21].
目前, 基于AIE分子已成为非常热门的研究领域, 设计和构建具有高灵敏度和高选择性AIE荧光探针成为一项非常有意义的研究工作[22-23]. 四苯乙烯(TPE)及其衍生物是一类具有显著AIE效应的荧光分子. 四苯乙烯螺旋桨形状会产生扭曲构象和分子内旋转振动, 使得四苯乙烯衍生物对外界的刺激响应非常灵敏. 其在聚集状态下具有强荧光发射, 该结构得到科研工作者广泛关注[24-26]. 此外, 立体化学会影响分子间相互作用和堆积模式, 因为立体化学对它们的光学性质有很大影响, 尤其是对于AIE分子[27-28]. 然而, 目前针对含TPE结构的多晶态分子结构扭转的相关研究仍较为匮乏. 生物硫醇[如半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)]在生物体内多种生理转化过程中发挥着至关重要的作用. 作为人体中最基本的硫醇之一, Cys是由蛋氨酸去甲基化得到的一种小分子生物硫醇, 有助于人体自由基清除, 减少氧化损伤对细胞和组织的损害, 保护氧化还原平衡和参与蛋白质合成[29-30]. 众所周知, 肿瘤中Cys的浓度是超标准量的, Cys可以作为肿瘤的标志物[31]. 目前, 有几种检测Cys的方法, 包括电化学分析、离子色谱法和高效液相色谱分析法. 然而, 上述各类检测方法均存在一些不足, 如样品预处理复杂、灵敏度低或检测耗时长等. 近年来, 荧光光谱法因反应速度快、成本低、操作简单及选择性和灵敏度高等优点, 在各种金属离子、阴离子和生物相关小分子检测中扮演着重要角色[32-33].
本工作设计合成了一种基于四苯乙烯的新型荧光探针TPE-1, 通过在不同溶剂中结晶分离得到两种多晶体TPE-1s和TPE-1t, 其中TPE-1s对Cys表现出高灵敏度和高选择性, 可以实现可视化荧光检测Cys, 其结构通过质谱、核磁共振谱、红外光谱和X射线单晶衍射进行表征. 该化合物以四苯乙烯为发光基团, 2,4-二硝基苯磺酰基作为识别基团, 其两种晶型表现出不同的分子排布. 该探针在水溶液中表现出弱荧光, 当向体系中加入Cys, 通过反应释放出AIE荧光分子TPE-NH2, 表现出荧光信号增强. 此外, 该探针对Cys具有高灵敏度和高选择性, 检测限为26.7 nmol•L－1.
1 结果与讨论
1.1 探针TPE-1的合成与聚集诱导发光(AIE)性能
在四氢呋喃(THF)/H2O的混合溶液中测定了TPE-1的荧光性能(水体积分数从0%到99%). 如图1所示, TPE-1在四氢呋喃中表现出弱荧光, 其归因于在溶液中空间结构的扭转作用. 水的体积比达到70%时, 荧光发射逐渐增强, 当水的体积分数达到80%时, 最大发射波长分别为557和548 nm, 该现象说明TPE-1具有经典的聚集诱导发射性能. 这些分子在溶液中表现出较弱的荧光发射, 在聚集状态下由于分子内的旋转受限(RIM), 导致荧光发射增强, 主要是邻近分子的空间约束导致.
图1 (a) TPE-1在不同水体积分数的THF/H2O (10 µmol•L－1)中的荧光发射光谱(激发波发射光谱长为395 nm)和(b) TPE-1随着水体积分数变化在556 nm处的荧光发射强度Figure 1 (a) Fluorescence emission spectra of TPE-1 in THF/H2O with different water fractions (10 µmol•L－1) (excitation wavelength is 395 nm) and (b) fluorescence emission intensity at 556 nm of TPE-1 as a function of water fraction |
1.2 探针TPE-1s和TPE-1t的晶体结构研究
TPE-1s和TPE-1t的单晶结构通过X射线单晶衍射得到(图2和图3), 其中, TPE-1s晶体属于单斜晶系(Monoclinic), 空间群为P21/n, 晶体外形为黄色块状. TPE-1s结构中, 荧光基团TPE与识别基团2,4-二硝基苯磺酰基结构夹角为80.399°, 呈半弯曲状, 相邻两个TPE分子的苯环之间存在π-π堆积作用. TPE-1t属于三斜晶系(Triclinic), 空间群为P-1, 晶体外形为黄色棒状. TPE-1t结构中, 荧光基团TPE与识别基团2,4-二硝基苯磺酰基结构夹角为48.956°, 呈严重扭曲状, 存在C—H…π相互作用. 从晶体结构得出, 多晶体TPE-1s比TPE-1t更加平展, 具有更强的荧光发射, 而TPE-1t更加扭曲, 具有弱的荧光发射.
1.3 探针TPE-1s和TPE-1t对Cys的荧光选择性研究与干扰实验
采用荧光竞争实验研究探针TPE‑1s和TPE‑1t对Cys的荧光选择性, 选取多种代表性离子与硫醇类小分子进行对比，包括$\mathrm{K}^{+}, \mathrm{Mg}^{2+}, \mathrm{F}^{-}, \mathrm{Cl}^{-}, \mathrm{Br}^{-}, \mathrm{I}^{-}, \mathrm{ClO}_{4}^{-}, \mathrm{ClO}^{-}, \mathrm{HSO}_{3}^{-}, \mathrm{SO}_{3}^{2-}, \mathrm{SO}_{4}^{2-}, \mathrm{CO}_{3}^{2-}, \mathrm{SeO}_{3}^{2-}$, 以及脂肪族硫醇(Hcy, Cys, GSH, HS－, S2－). 分别向10 µmol/L探针TPE-1s和TPE-1t的EtOH/PBS (V∶V=7∶3, pH=7.4)溶液中加入上述不同离子或硫醇小分子. TPE-1s和TPE-1t本身在450 nm处有微弱的荧光信号, 加入Cys后激发波长为395 nm, 探针TPE-1s在553 nm处出现一个强的荧光发射峰, 荧光强度高于其他任何一种离子或硫醇小分子, 在紫外灯下溶液颜色由无色变为亮蓝色. 该研究结果说明探针结构异构体TPE-1s对Cys具有高选择性. 为了研究其他离子或硫醇小分子对Cys检测的干扰, 向浓度为10 µmol•L－1 TPE-1s的EtOH/PBS (V∶V=7∶3, pH=7.4)溶液中加入1 equiv.的Cys, 再分别加入1 equiv.的其他离子或小分子, 测定其荧光发射光谱. 结果表明, 其他离子或小分子的存在对TPE-1s检测Cys没有明显影响.
1.4 荧光滴定实验
在浓度为10 µmol•L－1 TPE-1s的EtOH/PBS (V∶ V=7∶3, pH=7.4)溶液中, 随着Cys浓度的增加, 体系荧光强度逐渐增强(图4a). 根据荧光滴定数据, 得到553 nm处Cys浓度与探针Cys荧光强度的线性关系, 其斜率k为11.995 L•μmol－1. 通过检测限的公式: DL=3δ/k, 计算得出探针TPE-1s对Cys的检出限为26.7 nmol•L－1.
图4 (a)探针TPE-1s (10 μmol•L－1)在乙醇/PBS溶液中(V∶V=7∶3, pH=7.4)对不同浓度的Cys (0~5.0 equiv.)的荧光光谱图及(b)探针TPE-1s (10 μmol•L－1)在553 nm处荧光强度对不同Cys浓度的线性图(0~5 equiv.)Figure 4 (a) Fluorescence emission spectra of 10 µmol•L－1 TPE-1s in C2H5OH/PBS (V∶V=7∶3, pH=7.4) solution upon addition of different concentrations of Cys (0~5.0 equiv.), and (b) the fluorescence intensity at 583 nm of probe TPE-1s (10 μmol•L－1) upon addition of different concentrations of Cys (0~5.0 equiv.) |
1.5 探针TPE-1s识别Cys的形貌研究
2 结论
合成了一种四苯乙烯-2,4-二硝基苯磺酰基衍生物TPE-1, 其具有经典的AIE性能, 通过NMR、HR-MS对其结构进行了表征. 通过重结晶分离得到了两种异构体晶体TPE-1s和TPE-1t, 其具有不同的形状颜色和荧光发射. TPE-1s和TPE-1t由于不同的分子构象而导致单晶衍射数据的不同. TPE-1s的TPE单元和2,4-二硝基苯磺酰基单元之间的扭转角为80.399°, 而TPE-1t的扭转角为48.956°.
两种晶体的呈头对头的排列模式, 其相邻TPE单元产生氢键的距离有较大差别. 通过光谱实验研究发现, 在相同条件下多晶体TPE-1s比TPE-1t对Cys更具有荧光选择性, TPE-1s在乙醇/磷酸盐(PBS) (V∶V=7∶3, pH=7.4)溶液中对Cys表现出高的选择性和灵敏性, 检出限为26.7 nmol•L－1.
3 实验部分
3.1 仪器与试剂
核磁共振仪(Bruker AVANCE III-400, 德国Bruker公司), 单晶衍射仪(Bruker-AXS SMART APEX II X, 德国Bruker公司), 高分辨质谱仪(Agilent Q-TOF 6530, 英国Agilent公司), 荧光光谱仪(Hitachi F-4500, 日本Hitachi公司). 所有试剂来自于商业分析纯或化学纯, 没有进一步纯化. 在分析实验的过程中, 采用二次蒸馏水.
3.2 探针TPE-1的合成
在50 mL圆底烧瓶中加入1-(4-氨基苯)-1,2,2-三苯乙烯(65.96 mg, 0.1 mmol)和2,4-二硝基苯磺酰氯(203.4 mg, 0.76 mmol), 将其溶解于10 mL干燥的二氯甲烷, 再加入碳酸铯(30.1 mg, 0.091 mmol), 在室温下搅拌1 h. 在减压条件下除去溶剂得到粗产品, 经碱性氧化铝柱纯化(洗脱液: 二氯甲烷/石油醚, 体积比100∶1)得到黄色粉末固体TPE-1, 产率60%. m.p. 113~115 ℃; 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 10.92 (s, 1H), 8.92 (s, 1H), 8.40~8.43 (m,7H), 8.40 (d, J=10.1 Hz, 6H), 8.07~8.10 (m, 6H), 6.90 (d, J=5.2 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 141.78, 139.78, 132.39, 136.65, 130.99, 128.46, 127.84, 128.41, 127.20, 123.06, 109.41; HR-ESI- MS calcd for C32H23N3O6SNa [M＋Na]＋ 600.1205, found 600.1199.
3.3 单晶生长和单晶衍射数据的测定
将通过碱性氧化铝柱纯化得到的TPE-1 (10 mg)分别溶解于甲醇或二氯甲烷/石油醚(体积比1∶1, 2.0 mL)混合溶剂, 然后过滤, 将清液转移到干净试管缓慢静置挥发, 一周后得到相应两种异构体晶体: TPE-1s黄色块状晶体和TPE-1t橙色针状晶体. TPE-1s和TPE-1t是多晶体, 其颜色和形状具有明显的差异. 晶体结构数据用Bruker-AXS SMART APEX II仪器收集, Mo Kα衍射 (λ=0.154184 nm)在298 K下收集数据, 用SHELX- 2014/7程序对结构进行精修. TPE-1s和TPE-1t晶体数据收集于英国剑桥晶体数据库(CCDC 2390324和CCDC 2390326).
3.4 溶液配制和光谱测试方法
用无水乙醇溶解探针TPE-1s和TPE-1t, 并在100 mL容量瓶中配置成浓度为1.0×10－3 mol•L－1的储备溶液. 选择Hcy, Cys, GSH, (CH3)SH配成对应浓度溶液, $\mathrm{F}^{-}, \mathrm{Cl}^{-}, \mathrm{Br}^{-}, \mathrm{I}^{-}, \mathrm{ClO}_{4}^{-}, \mathrm{ClO}^{-}, \mathrm{HSO}_{3}^{-}, \mathrm{SO}_{3}^{2-}, \mathrm{SO}_{4}^{2-} \ \mathrm{SH}^{-}, \mathrm{S}^{2-}$的Na盐或K盐作为离子来源, 采用二次蒸馏水溶解, 配置成浓度为1.0×10－2 mol•L－1的水溶液作为储备溶液. 分别取不同体积的探针TPE-1s和TPE-1t储备溶液配成水的体积分数为0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%的乙醇/水混合溶液(在5 mL离心管中定容, 其浓度保持为10 µmol•L－1不变), 激发波长(Ex)为395 nm, 狭缝宽度为5 nm, 发射波长(Em)为400~700 nm, 并测定其荧光强度验证AIE性能. 在UV-vis实验、荧光选择性实验和荧光滴定实验中, 探针TPE-1s储备溶液用乙醇/磷酸盐缓冲溶液(PBS, V∶ V=7∶3)稀释至10 µmol•L－1, pH调节为7.4, 取3 mL该样品溶液置于1 cm比色皿中进行测定. 上述所有光谱试验均在常温常压下进行.
辅助材料(Supporting Information) 化合物TPE-1的1H NMR, HR-ESI-MS等谱图. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.
(Zhao, C.)