新型N-2,3-二氟苯基环丁胺类M4 AChR正向变构调节剂的设计、合成与活性

刘敏; 陈毅昆; 田峦鸢; 周海峰; 周皓; 刘祈星

doi:10.6023/cjoc202510015

有机化学 >

2026 , Vol. 46 >Issue 5: 2138 - 2148

DOI: https://doi.org/10.6023/cjoc202510015

研究论文

新型N-2,3-二氟苯基环丁胺类M4 AChR正向变构调节剂的设计、合成与活性

刘敏 ^a ,
陈毅昆 ^b ,
田峦鸢 ^b ,
周海峰 ^a ,
周皓 ^,^b^,^* ,
刘祈星 ^,^a^,^*

展开

^a 三峡大学生物与制药学院天然产物研究与利用湖北省重点实验室湖北宜昌 443002
^b 宜昌人福药业有限责任公司湖北宜昌 443005

收稿日期: 2025-10-22

修回日期: 2025-12-24

网络出版日期: 2026-02-02

基金资助

国家自然科学基金(22278244)

宜昌人福药业有限责任公司研发(SDHZ2023029)

收起

Design, Synthesis, and Activity of Novel N-2,3-Difluorophenyl Cyclobutylamine M4 AChR Positive Allosteric Modulators

Min Liu ^a ,
Yikun Chen ^b ,
Luanyuan Tian ^b ,
Haifeng Zhou ^a ,
Hao Zhou ^,^b^,^* ,
Qixing Liu ^,^a^,^*

Expand

^a Hubei Key Laboratory of Natural Products Research and Development, College of Biological and Pharmaceutical Sciences, China Three Gorges University, Yichang, Hubei 443002
^b Yichang Humanwell Pharmaceutical Co., Ltd., Yichang, Hubei 443005

^* E-mail: zhouhao@renfu.com.cn;

qixingliu86@163.com

Received date: 2025-10-22

Revised date: 2025-12-24

Online published: 2026-02-02

Supported by

National Natural Science Foundation of China(22278244)

Research Fund from Yichang Humanwell Pharmaceutical Co., Ltd.(SDHZ2023029)

Fold

摘要

以VU6000918为先导化合物, 采用Schrödinger平台的Glide对接模块对所设计的目标化合物与M4受体蛋白的变构位点均进行了分子对接和打分评估, 设计并合成了27个N-2,3-二氟苯基环丁胺类化合物V1~V27. 采用FLIPR (Fluorescence imaging plate reader)荧光检测技术研究化合物对M4细胞的活性, 研究结果显示, 部分化合物具有显著的M4受体细胞活性, 其中化合物V1 (EC₅₀=0.636 μmol/L)、V8 (EC₅₀=0.482 μmol/L)、V10 (EC₅₀=0.508 μmol/L)和V13 (EC₅₀=0.621 μmol/L)对M4受体细胞的活性高于阳性对照或与之相当. 构效关系研究发现, 化合物中含喹啉环时表现出较高的细胞活性, 尤其是在喹啉环的4位引入甲基时, 化合物较其它取代基化合物活性更高, 表明甲基的引入可以显著提高化合物的活性, 值得进一步研究. 分子对接结果表明, 该类化合物能够有效地与M4受体的变构位点发生结合, 从而发挥其潜在的药理作用. 本研究结果对M4 AChR正向变构调节剂的新药分子设计具有一定的借鉴意义.

关键词： 分子对接; M4正向变构调节剂; N-2,3-二氟苯基环丁胺; 合成; 活性

本文引用格式

刘敏 , 陈毅昆 , 田峦鸢 , 周海峰 , 周皓 , 刘祈星 . 新型N-2,3-二氟苯基环丁胺类M4 AChR正向变构调节剂的设计、合成与活性[J]. 有机化学, 2026 , 46(5) : 2138 -2148 . DOI: 10.6023/cjoc202510015

Abstract

Using VU6000918 as the lead compound, employing the Glide docking module of the Schrödinger platform to perform molecular docking and scoring evaluations of the designed target compounds with the allosteric binding sites of the M4 receptor protein, 27 N-2,3-difluorophenyl cyclobutylamine derivatives (V1~V27) were designed and synthesized. The activities of these compounds on M4 receptor cells were evaluated using FLIPR (Fluorescence imaging plate reader) fluorescence detection technology. The results showed that some target compounds exhibited significant activities on M4 receptor cells. Among them, compounds V1 (EC₅₀=0.636 μmol/L), V8 (EC₅₀=0.482 μmol/L), V10 (EC₅₀=0.508 μmol/L), and V13 (EC₅₀=0.621 μmol/L) had higher or comparable activities on M4 receptor cells than the lead compound. Structure-activity relationship (SAR) studies revealed that compounds containing a quinoline ring exhibited higher activity. In particular, compounds with a methyl group at the position 4 of the quinolone showed higher activities than those with other substituents, demonstrating that the introduction of the methyl group can significantly enhance the activity and is worthy of further investigation. Molecular-docking results indicate that these compounds can bind effectively to the allosteric site of the M4 receptor, thereby exerting their potential pharmacological effects. This work provides a guidance for the design of M4 AChR positive allosteric modulators.

Key words： molecular docking; M4 positive allosteric modulator; N-2,3-difluorophenyl cyclobutylamine; synthesis; activity

毒蕈碱乙酰胆碱受体(mAChRs)属于A类G蛋白偶联受体(GPCRs)家族, 由五个亚型(M1~M5)组成, 由于其在中枢和外周神经系统中的重要性, 长期以来一直被作为靶标用于药物开发^[1]. M1和M4受体被认为是许多中枢神经系统疾病(如精神分裂症)的潜在治疗靶点, 但由于五个亚型正构结合位点高度同源, 药物的脱靶效应和胆碱能系统的过度激活, 导致胃肠道和心血管等胆碱能副作用^[2-5]. 自20世纪50年代发现氯丙嗪以来, 几乎所有抗精神分裂症药物都通过阻断大脑中的多巴胺受体来达到治疗效果, 但只能治疗部分症状, 且对近30%的患者无效. 最近美国食品和药物管理局批准了KarXT, 这是一种占诺美林与曲司氯铵的联合制剂, 是一种M1/M4毒蕈碱乙酰胆碱受体(mAChR)激动剂和一种外周受限的泛mAChR阻滞剂, 推动了M4 AChR成为一个经过验证的新型抗精神病药物靶点^[6-8].

近年来, 研究人员发现了一种M4受体选择性新策略——正向变构调节剂(PAMs), PAMs不直接激活受体, 而是通过与M4受体的变构位点结合, 增强内源性乙酰胆碱(ACh)的信号传导, 精确调节多巴胺能神经传递, 与M4激动剂相比, PAMs对M4 AChR功能的调节更为精确, 脱靶效应更少, 亚型选择性高, 副作用小^[9-12]. 氮杂环丁烷是药物化学中一种特殊的结构, 近年来, 越来越多的研究尝试将其引入药物设计与合成中^[13-15]. 2014年, Jones课题组^[16]开发了一种噻吩并哒嗪类M4受体正向变构调节剂VU0467154(图1). 该化合物展现出良好的细胞活性, 并且在亚型选择性实验中, 对M4选择性较高, 对M受体其他亚型均无明显作用, 未引发外周毒蕈碱受体激活所引起的主要副作用, 目前已完成了系统的临床前研究, 并显示出良好的潜力与安全性^[17]. 2017年, Lindsley团队^[18]在稠环和芳基片段之间引入氮杂环丁烷, 以替换传统PAMs中存在的亚甲基连接键, 同时引入2,3-二氟苯基团合成了化合物VU6000918(图1). 该化合物具有良好的活性, 改善了药物代谢动力学属性, 在大鼠苯丙胺诱导的运动逆转模型中证明, 其在0.3 mg/kg剂量下仍然具有明显的效果. 但分子结构中的β-氨基羧酰胺会导致一定程度的P-糖蛋白外排等.

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图1 目标化合物V1~V27的设计

Figure 1 Design of the title compounds V1~V27

为了深入挖掘该类化合物的潜力, 本研究以VU6000918作为先导化合物, 保留N-2,3-二氟苯基环丁胺主体结构, 通过分子对接打分评估活性选择了27个杂环片段, 通过酰胺键将环丁胺与杂环片段连接, 设计并合成了系列N-2,3-二氟苯基环丁胺类化合物(图1), 并进行M4细胞活性和构效关系研究.

1 结果与讨论

1.1 目标化合物分子对接与合成

利用Schrödinger软件平台^[19]的Glide对接模块对所设计的目标化合物与M4受体蛋白的变构位点(PDB ID: 8FX5)^[20]进行打分评估. Glide打分为经验性结合亲和力评价指标, 可在一定范围内用于候选化合物间的相对排序与对比, 通常, 得分越负, 表示配体与受体结合腔体的几何与能量匹配越佳, 潜在结合倾向越强^[21]. 以先导化合物VU0467154与VU6000918为基准, 其Glide得分分别为－25.6与－22.7 kJ/mol. 与之相比, 本研究设计的多数化合物获得了更负的对接得分, 表明所设计的大部分化合物与M4蛋白的结合作用更强, 提示其在正构位点上可能具备更优的理论结合能力(表1), 这一结果充分验证了本文设计化合物的科学性与合理性.

表1 所设计化合物与M4受体蛋白变构位点结合亲和力评价

Table 1 Evaluation of the binding affinity of the designed compounds to the M4 receptor protein orthosteric site

Compd.	Docking score/(kJ∙mol^－1)	Compd.	Docking score/(kJ∙mol^－1)	Compd.	Docking score/(kJ∙mol^－1)
V1	－31.9	V11	－29.0	V21	－27.4
V2	－32.0	V12	－24.6	V22	－27.9
V3	－32.0	V13	－33.4	V23	－33.0
V4	－31.9	V14	－30.9	V24	－35.2
V5	－29.9	V15	－37.0	V25	－34.5
V6	－31.4	V16	－34.5	V26	－26.4
V7	－29.7	V17	－28.3	V27	－30.0
V8	－31.7	V18	－34.7	VU6000918	－22.7
V9	－24.3	V19	－28.5	VU0467154	－25.6
V10	－29.8	V20	－32.1

基于所设计的一系列分子的对接预测结果, 我们对化合物的合成路线进行了详细的设计(图2). 首先通过Buchwald-Hartwig偶联反应^[22-25], 在氮气保护下, 以3-N-叔丁氧羰基胺基环丁胺(I)和2,3-二氟溴苯(II)为底物, 在Pd₂(dba)₃、BINAP和Cs₂CO₃的催化作用下, 以甲苯为溶剂进行Buchwald-Hartwing偶联反应, 通过柱层析分离得到白色固体化合物III, 收率高达96%. 该反应条件温和、操作简便, 为后续合成奠定了良好的基础. 然后化合物III在三氟乙酸的作用下, 高效脱去氨基保护基, 经柱层析分离后得到化合物IV, 收率高达98%. 此步骤反应条件简单, 收率高, 为后续的酰胺键构建提供了充足的中间体^[26]. 最后化合物IV通过两种不同的方法构建酰胺键. 方案一为缩合法: 采用文献[27]中报道的缩合方法, 使用2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)作为综合剂, 反应条件温和, 操作简便, 适用于多种底物. 方案二为酰氯法: 依据文献[28]中的酰氯化方法, 该方法反应迅速, 产率较高, 适用于大规模合成. 最终得到目标化合物V1~V27, 收率在32%至66%之间.

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图2 目标化合物V1~V27的合成路线

Figure 2 Synthetic route of the title compounds V1~V27

1.2 M4受体的正向变构调节活性测试

对目标化合物对M4受体的正向调节细胞活性EC₅₀值进行测定, 通过FLIPR系统检测CHO-hM4细胞内钙流响应, 通过GraphPad Prism 5.0拟合获得其对M4受体半最大有效浓度(EC₅₀)(表2). 结果显示, 化合物V8和V10的活性显著优于阳性对照VU0467154, EC₅₀分别低至0.482和0.508 μmol/L, 但与阳性对照VU6000918仍有一定的差距; 化合物V1和V13的EC₅₀值与阳性对照VU0467154相当, EC₅₀分别为0.636和0.621 μmol/L; 化合物V6、V7和V12的活性低于阳性对照化合物; 化合物V2、V3、V5、V9、V11、V14和V15的具有一定的活性, 但活性水平远低于阳性对照; 其余化合物的活性较差或无活性.

表2 目标化合物V1~V27的EC₅₀

Table 2 EC₅₀ of the title compounds V1~V27

Compd.	EC₅₀/(μmol∙L^－1)	Compd.	EC₅₀/(μmol∙L^－1)	Compd.	EC₅₀/(μmol∙L^－1)
V1	0.636±0.02	V11	2.840±0.02	V21	>30
V2	2.652±0.02	V12	1.450±0.02	V22	>30
V3	3.033±0.02	V13	0.621±0.02	V23	>30
V4	>30	V14	2.376±0.02	V24	>30
V5	1.888±0.02	V15	1.999±0.02	V25	>30
V6	1.094±0.02	V16	>30	V26	>30
V7	0.979±0.02	V17	>30	V27	13.930±0.02
V8	0.482±0.02	V18	>30	VU0467154	0.636±0.02
V9	4.000±0.02	V19	>30	VU6000918	0.120±0.02
V10	0.508±0.02	V20	>30

1.3 构效关系分析

通过对目标化合物的结构与活性关系分析, 可知该类化合物具有较好的细胞活性, 尤其是当Het为喹啉环时, 表现出较高的细胞活性, 表明喹啉类化合物是具有开发潜力的结构, 而其它杂环活性较低或无活性(如化合物V3、V14~V27的EC₅₀值均高于1.999 μmol/L), 无进一步研究价值. 喹啉环是一个平面结构, 易与受体形成π-π堆积作用, 且含有1个N原子, 可与受体蛋白形成氢键, 通过这种双重作用增强了结合的稳定性, 而当喹啉环替换为其它杂环时(如V16~V27), 化合物可能因立体位阻或极性不适等原因, 降低了与受体的结合稳定性, 从而使活性大大降低; 当喹啉环为6位取代时活性最佳, 大部分化合物EC₅₀值小于2.000 μmol/L, 而喹啉环为7号和8号时活性较低或几乎不产生活性(EC₅₀值大于2.600 μmol/L), 说明6位取代时, 化合物的构象可以很好地嵌入受体空腔, 而7号和8号取代时, 化合物因构象约束无法嵌入受体空腔, 影响活性; 对喹啉环不同取代基进行分析, 发现喹啉环4位含有甲基的化合物较其它取代基化合物活性更高(如V8、V10和V13), 表明甲基的引入可以显著提高化合物的活性, 甲基对化合物的疏水性和构象均有一定的影响, 更有利于与受体蛋白结合, 增强其活性. 分析对照目标化合物与M4受体蛋白变构位点的对接评分结果, 发现大部分高活性化合物的分子对接打分介于－29~－34 kJ/mol之间, 结合亲和力评价指标再降低反而不利于活性的提高, 说明分子结合力太强对细胞活性不利.

1.4 分子对接

利用Schrödinger平台^[19]的Glide对接模块, 对M4受体的变构位点(PDB ID: 8FX5)^[20]进行了结合模式的预测, 并以VU6000918和V8为对照进行了深入分析. 从构建的模型来看, 这两个化合物与受体之间存在若干关键的相互作用(图3): 化合物中的酰胺羰基与受体中的酪氨酸(Tyr89)形成了较强的氢键作用, 这种氢键的形成对于化合物与受体的紧密结合至关重要. 此外, VU6000918的噻吩并哒嗪环和V8的喹啉环分别与变构口袋内的色氨酸(Trp435)和苯丙氨酸(Phe186)之间均存在显著的π-π堆积作用, 这种堆积作用进一步增强了化合物与受体之间的结合稳定性. 这些相互作用的发现表明, 该类化合物能够有效地与M4受体的变构位点发生结合, 从而发挥其潜在的药理作用.

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图3 化合物与M4变构位点的结合模式

Figure 3 Binding mode of the compound to the M4 allosteric site

2 结论

本研究以VU6000918为先导化合物, 保留N-2,3-二氟苯基环丁胺主体结构, 通过对M4变构位点结合亲和力打分评估选择了27个杂环片段, 设计并合成了系列N-2,3-二氟苯基环丁胺类化合物, 目标化合物的结构经¹H NMR、¹³C NMR和高分辨率质谱(HRMS)表征确认. 采用FLIPR荧光检测技术研究化合物对M4受体细胞的活性, 并计算其EC₅₀值. 活性结果显示, 部分目标化合物具有显著的M4正向变构调节作用, 其中化合物V1、V8、V10和V13对M4受体细胞的EC₅₀值低于阳性对照或与之相当. 构效关系分析表明, Het为喹啉环时表现出较高的细胞活性, 且喹啉环为6位取代时活性最佳, 尤其是6位取代喹啉环的4位引入甲基时, 化合物较其它取代基化合物活性更高, 表明甲基的引入可以显著提高化合物的活性. 综上所述, 本研究为开发新型高活性M4正向变构调节剂提供了重要的理论依据和参考.

3 实验部分

3.1 仪器与试剂

Bruker AV 400 MHz型核磁共振波谱仪, 瑞士Bruker公司; SHB-ⅢA型循环水式多用真空泵, 上海豫康科教仪器设备有限公司; EYELASB-1100型旋转蒸发仪, 上海爱朗仪器有限公司; 低温冷却液体循环泵, 巩义市英峪予华仪器厂; ZF-6型三用紫外分析仪, 上海嘉鹏科技有限公司; FA2104B分析天平, 上海越平科技仪器有限公司; X-4数字显示显微熔点测定仪, 北京泰克仪器有限公司; 6210ESI/TOF质谱仪, 安捷伦科技公司; 384孔板, Greiner, 格瑞纳生物科技有限公司; Vi-cell XR细胞存活分析仪, 贝克曼库尔特; 培养箱, 赛默飞世尔科技公司.

氮杂环丁烷-3-氨基甲酸叔丁酯和HATU, 化学纯, 上海皓鸿生物医药科技有限公司; 三(二亚苄基丙酮)二钯[Pd₂(dba)₃]、1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(BINAP)、三乙胺(TEA)、氯化亚砜、三氟乙酸(TFA)、不同取代的2-三氟甲基吡啶类化合物、杂环羧酸类化合物, 化学纯, 上海麦克林生化科技股份有限公司; 盐酸、甲苯, 分析纯, 成都市科隆化学品有限公司; 氢氧化钠, 分析纯, 天津市天力化学试剂有限公司; 二氯甲烷(DCM), 分析纯, 成都金山化学试剂有限公司; 稳定表达M4的CHO细胞, 上海药明康德新药开发有限公司; F12 gibco FBS培养基, 依科赛生物科技有限公司; Geneticin培养基, 赛默飞世尔科技公司; Penicillin/Streptomycin培养基, 赛默飞世尔科技公司; Fluo-4 Direct试剂, 赛默飞世尔科技公司.

3.2 分子对接及亲和力预测

从蛋白质数据库(PDB, 网址: www.pdb.org)中下载M4受体的蛋白结构(8FX5), 研究过程中以活性化合物VU6000918为阳性对照. 利用Schrödinger-Kirchhoff软件包中的Protein Preparation Wizard模块进行蛋白的准备. 从蛋白质数据库下载或者直接在软件包中“Get PDB File”模块进行下载; 去除蛋白分子中的溶剂; 修正蛋白值中的化学键; 优化氢键; 对蛋白分子进行能量最小化操作. 使用ChemDraw Professional 16.0软件画出所有设计后化合物的平面结构, 并依次导入到Chem3D 16.0软件中转换为立体结构, 并进行能量最小化操作, 另存为*.sdf格式. 将以上所有的*.sdf文件导入到Schrodinger Suite 中的LigPrep模块中进行配体小分子的准备. 以蛋白质自带的原始配体为中心, 生成受体活性区域的盒子文件. 采用Schrodinger Suite中的Ligand Docking模块进行分子对接.

3.3 化合物的合成

3.3.1 中间体N-(2,3-二氟苯基)氮杂环丁-3-基氨基甲酸叔丁酯(III)的合成

将3-N-叔丁氧羰基胺基环丁胺(I) (10.32 g, 60 mmol)加入到500 mL反应瓶中, 加入150 mL甲苯搅拌溶解, 随后依次加入2,3-二氟溴苯(II) (9.55 g, 50 mmol), Pd₂(dba)₃ (1.83 g, 2 mmol)、1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(BINAP, 3.12 g, 5 mmol)和Cs₂CO₃ (65.20 g, 200 mmol), 加入完毕, 反应液在90 ℃下反应14 h. 薄层色谱(TLC)监测反应完成后, 加水淬灭反应, 乙酸乙酯(50 mL×3)萃取, 合并有机相, 减压浓缩得到粗品, 柱层析[淋洗剂: 乙酸乙酯(EA)/石油醚(PE), V∶V=1∶10]分离得中间体III 13.70 g, 产率96%. 白色固体, m.p. 138~140 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 8.54 (s, 1H), 8.04 (s, 2H), 7.60 (d, J=7.5 Hz, 1H), 4.47 (q, J=6.8 Hz, 1H), 4.19 (t, J=7.6 Hz, 2H), 3.72 (dd, J=7.8, 6.0 Hz, 2H), 1.39 (s, 9H).

3.3.2 中间体N-(2,3-二氟苯基)氮杂环丁-3-胺(IV)的合成

室温下, 将化合物III (284 mg, 1.0 mmol, 1.0 equiv.)加入反应瓶中, 加入DCM (5 mL)搅拌溶解, 冰浴, 随后加入三氟乙酸(TFA, 2 mL), 室温搅拌2 h. TLC监测反应完成后, 碳酸氢钠水溶液调节pH=8左右, 二氯甲烷(10 mL×3)萃取, 合并有机相, 减压浓缩, 残留物经柱层析分离, 得到化合物IV 181 mg, 产率98%, 直接用于下一步反应.

3.3.3 目标化合物V1~V27的合成

方案一: 在室温下, 将化合物IV (1.0 mmol, 184 mg)加入50 mL圆底烧瓶中, DCM (5 mL)溶解, 随后加入杂环羧酸(1.2 mmol)、三乙胺(3.0 mmol, 303 mg)和HATU (1.5 mmol, 570 mg), 室温反应2 h, TLC监测反应完全后, 加水(10 mL)淬灭反应, 二氯甲烷(10 mL×3)萃取, 合并有机相, 经减压浓缩, 柱层析分离得到目标化合物.

方案二: 将羧酸(1.2 mmol, 1.2 equiv.)加入250 mL圆底烧瓶, 加入氯化亚砜(2 mL)、甲苯(3 mL), 反应在110 ℃下加热回流5 h, 反应完毕, 减压浓缩, 除去溶剂. 其次往其加入二氯甲烷(5 mL)、三乙胺(2.5 mmol, 253 mg), 再将化合物IV (1.0 mmol, 184 mg)加入其中. 室温下搅拌2 h, TLC监测反应完全后, 加水淬灭反应, 二氯甲烷(10 mL×3)萃取, 合并有机相, 减压浓缩, 柱层析分离得到目标化合物.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]喹啉-6-甲酰胺(V1): 方案二, 柱层析(EA/PE, V∶V=1∶1)分离得207 mg白色固体, 产率61%, m.p. 178~180 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.30 (d, J=6.9 Hz, 1H), 8.99 (dd, J=4.2, 1.8 Hz, 1H), 8.57 (d, J=2.0 Hz, 1H), 8.47 (dd, J=8.4, 1.8 Hz, 1H), 8.23 (dd, J=8.8, 2.1 Hz, 1H), 8.10 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.62~7.58 (m, 1H), 7.13~6.85 (m, 1H), 6.84~6.60 (m, 1H), 6.42 (t, J=8.0 Hz, 1H), 4.97~4.89 (m, 1H), 4.37~4.34 (m, 2H), 4.03~4.00 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 166.0, 152.6, 151.0 (dd, J=242.5, 10.3 Hz), 149.2, 141.5 (dd, J=7.2, 2.3 Hz), 140.1 (dd, J=240.7, 14.9 Hz), 137.5, 132.2, 129.5, 128.6, 128.2, 127.5, 124.7 (dd, J=8.9, 4.2 Hz), 122.6, 110.6, 106.3 (d, J=17.7 Hz), 60.6, 41.7. HRMS (ESI) calcd for C₁₉H₁₆F₂N₃O [M＋H]^＋ 340.1256, found 340.1251.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]喹啉-7-甲酰胺(V2): 方案二, 柱层析(EA/PE, V∶V=3∶1)得187 mg白色固体, 产率55%, m.p. 177~182 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.36 (d, J=6.9 Hz, 1H), 9.00 (dd, J=4.2, 1.7 Hz, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.42 (dd, J=8.4, 1.7 Hz, 1H), 8.07 (d, J=1.2 Hz, 2H), 7.63~7.60 (m, 1H), 7.09~6.91 (m, 1H), 6.78~6.60 (m, 1H), 6.42 (t, J=8.4 Hz, 1H), 4.97~4.89 (m, 1H), 4.37~4.32 (m, 2H), 4.05~4.01 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 166.1, 152.0, 151.0 (dd, J=242.4, 10.5 Hz), 147.5, 141.6 (dd, J=7.3, 2.2 Hz), 140.0 (dd, J=239.3, 14.6 Hz), 136.3, 135.0, 129.9, 128.8, 128.6, 125.3, 124.7 (dd, J=8.9, 4.3 Hz), 123.2, 110.6, 106.2 (d, J=17.5 Hz), 60.5, 41.7. HRMS (ESI) calcd for C₁₉H₁₆F₂N₃O [M＋H]^＋340.1256, found 340.1257.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]喹喔啉-6-甲酰胺(V3): 方案二, 柱层析(EA/PE, V∶V=2∶1)得224 mg白色固体, 产率66%, m.p. 190~192 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.43 (d, J=6.8 Hz, 1H), 9.02 (d, J=5.2 Hz, 2H), 8.67 (s, 1H), 8.29 (d, J=8.8 Hz, 1H), 8.16 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.02~6.97 (m, 1H), 6.72~6.66 (m, 1H), 6.41 (t, J=8.2 Hz, 1H), 4.95~4.90 (m, 1H), 4.36~4.32 (m, 2H), 4.04~4.01 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 165.4, 151.0 (dd, J=242.5, 10.6 Hz), 147.4, 147.1, 143.9, 142.0, 141.5 (dd, J=7.2, 2.1 Hz), 140.1 (dd, J=240.7, 14.7 Hz), 135.3, 129.8, 128.9, 128.9, 124.7 (dd, J=8.9, 4.1 Hz), 110.6, 106.3 (d, J=17.8 Hz), 60.5, 41.7. HRMS (ESI) calcd for C₁₈H₁₅F₂N₄O [M＋H]^＋341.1208, found 341.1209.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]喹啉-8-甲酰胺(V4): 方案二, 柱层析(EA/PE, V∶V=1∶1)得193 mg白色固体, 产率57%, m.p. 179~181 ℃; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 11.91 (d, J=5.9 Hz, 1H), 8.95 (d, J=3.8 Hz, 1H), 8.86 (d, J=7.3 Hz, 1H), 8.29 (dd, J=8.2, 1.8 Hz, 1H), 7.98 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.67 (t, J=7.7 Hz, 1H), 7.52~7.49 (m, 1H), 6.95~6.84 (m, 1H), 6.59~6.54 (m, 1H), 6.27 (t, J=8.0 Hz, 1H), 5.18~5.10 (m, 1H), 4.54~4.49 (m, 2H), 4.07~4.04 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 165.7, 151.4 (dd, J=245.0, 10.5 Hz), 149.5, 145.5, 141.0 (dd, J=7.8, 2.5 Hz), 140.7 (dd, J=242.4, 15.3 Hz), 137.9, 133.9, 132.4, 128.5, 127.9, 126.5, 123.7 (dd, J=8.8, 4.5 Hz), 121.1, 109.4, 106.41 (d, J=17.9 Hz), 61.1, 41.6. HRMS (ESI) calcd for C₁₉H₁₆F₂N₃O [M＋H]^＋ 340.1256, found 340.1256.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-3-溴喹啉-6-甲酰胺(V5): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=2∶1)得200 mg白色固体, 产率48%, m.p. 228~230 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.32 (d, J=6.9 Hz, 1H), 9.01 (d, J=2.4 Hz, 1H), 8.79 (d, J=2.3 Hz, 1H), 8.50 (d, J=2.0 Hz, 1H), 8.23 (dd, J=8.8, 2.0 Hz, 1H), 8.09 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.11~6.91 (m, 1H), 6.82~6.61 (m, 1H), 6.42 (t, J=8.4 Hz, 1H), 4.95~4.86 (m, 1H), 4.37~4.32 (m, 2H), 4.04~4.01 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 165.8, 153.0, 150.6 (dd, J=241.1, 10.4 Hz), 147.2, 141.5 (dd, J=7.5, 2.2 Hz), 140.1 (dd, J=239.4, 15.1 Hz), 138.8, 133.3, 129.4, 128.6, 128.6, 128.1, 124.7 (dd, J=8.9, 4.2 Hz), 117.9, 110.6, 106.3 (d, J=17.3 Hz), 60.5, 41.7. HRMS (ESI) calcd for C₁₉H₁₅BrF₂N₃O [M＋H]^＋ 418.0361, found 418.0363.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-2-甲基喹啉-6-甲酰胺(V6): 方案二, 柱层析(EA/PE, V∶V=1∶1)得222 mg白色固体, 产率63%, m.p. 239~240 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.24 (d, J=6.9 Hz, 1H), 8.50 (d, J=1.7 Hz, 1H), 8.34 (d, J=8.5 Hz, 1H), 8.16 (dd, J=8.8, 1.9 Hz, 1H), 7.98 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.49 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.11~6.90 (m, 1H), 6.79~6.66 (m, 1H), 6.43 (t, J=8.2 Hz, 1H), 4.95~4.87 (m, 1H), 4.37~4.33 (m, 2H), 4.02~3.99 (m, 2H), 2.68 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 166.1, 161.1, 151.0 (dd, J=242.5, 10.6 Hz), 148.9, 141.6 (dd, J=7.5, 2.2 Hz), 140.1 (dd, J=240.8, 14.9 Hz), 137.5, 131.3, 128.7, 128.3, 128.1, 125.8, 124.8 (dd, J=8.9, 4.3 Hz), 123.4, 110.6, 106.3 (d, J=17.4 Hz), 60.6, 41.6, 25.5. HRMS (ESI) calcd for C₂₀H₁₈F₂N₃O [M＋H]^＋ 354.1412, found 354.1411.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-4-甲基喹啉-6-甲酰胺(V7): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=3∶1)得152 mg白色固体, 产率43%, m.p. 239~240 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.31 (d, J=6.9 Hz, 1H), 8.82 (d, J=4.3 Hz, 1H), 8.65 (d, J=1.7 Hz, 1H), 8.21 (dd, J=8.8, 1.9 Hz, 1H), 8.07 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.44 (dd, J=4.4, 1.1 Hz, 1H), 7.06~6.97 (m, 1H), 6.76~6.66 (m, 1H), 6.43 (t, J=8.2 Hz, 1H), 4.98~4.89 (m, 1H), 4.38~4.34 (m, 2H), 4.04~4.01 (m, 2H), 2.76 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 166.1, 152.2, 151.0 (dd, J=241.1, 10.3 Hz), 149.1, 146.0, 141.5 (dd, J=7.5, 2.3 Hz), 140.0 (dd, J=224.5, 14.7 Hz), 131.7, 130.0, 128.0, 127.5, 124.8 (dd, J=8.9, 4.2 Hz), 124.6, 123.1, 110.6, 106.3 (d, J=17.6 Hz), 60.6, 41.7, 18.7. HRMS (ESI) calcd for C₂₀H₁₈F₂N₃O [M＋H]^＋354.1412, found 354.1414.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-2,4-二甲基喹啉-6-甲酰胺(V8): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=2∶1)得162 mg白色固体, 产率44%, m.p. 240~241 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.25 (d, J=6.9 Hz, 1H), 8.58 (d, J=2.0 Hz, 1H), 8.15 (dd, J=8.8, 2.0 Hz, 1H), 7.96 (d, J=8.7 Hz, 1H), 7.32 (s, 1H), 7.11~6.92 (m, 1H), 6.81~6.61 (m, 1H), 6.43 (t, J=8.2 Hz, 1H), 4.96~4.88 (m, 1H), 4.37~4.33 (m, 2H), 4.03~3.99 (m, 2H), 2.70 (s, 3H), 2.61 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 166.2, 160.7, 151.0 (dd, J=241.2, 10.3 Hz), 148.9, 145.7, 141.5 (dd, J=7.2, 2.1 Hz), 140.1 (dd, J=240.7, 14.9 Hz), 130.8, 129.2, 128.0, 125.8, 124.8 (dd, J=8.9, 4.3 Hz), 124.3, 123.7, 110.6, 106.3 (d, J=17.0 Hz), 60.6, 41.7, 25.3, 18.6. HRMS (ESI) calcd for C₂₁H₂₀F₂N₃O [M＋H]^＋368.1569, found 368.1572.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-2,4,8-三甲基喹啉-6-甲酰胺(V9): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=1∶1)得240 mg白色固体, 产率63%, m.p. 250~252 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.33 (d, J=6.9 Hz, 1H), 8.47 (d, J=2.1 Hz, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.05~6.99 (m, 1H), 6.75~6.69 (m, 1H), 6.44 (t, J=8.2 Hz, 1H), 4.95~4.87 (m, 1H), 4.36~4.32 (m, 2H), 4.05~4.02 (m, 2H), 2.71 (s, 3H), 2.70 (s, 3H), 2.64 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 166.4, 159.4, 151.0 (dd, J=241.0, 11.0 Hz), 147.8, 146.0, 141.6 (dd, J=6.0, 4.0 Hz), 140.1 (dd, J=239.0, 14.0 Hz) 136.7, 130.2, 128.0, 124.8 (dd, J=9.0, 4.0 Hz), 125.7, 123.5, 122.4, 110.7, 106.3 (d, J=17.3 Hz), 60.6, 41.7, 25.7, 19.0, 18.6. HRMS (ESI) calcd for C₂₂H₂₂F₂N₃O [M＋H]^＋382.1725, found 382.1725.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-(2,4-二甲基-8-氯喹啉)-6-甲酰胺(V10): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=2∶1)得269 mg白色固体, 产率67%, m.p. 239~240 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.35 (d, J=6.9 Hz, 1H), 8.57 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.05~7.00 (m, 1H), 6.77~6.70 (m, 1H), 6.45 (t, J=8.1 Hz, 1H), 4.93~4.88 (m, 1H), 4.38~4.34 (m, 2H), 4.03~3.99 (m, 2H), 2.74 (s, 3H), 2.68 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 164.9, 161.7, 151.1 (dd, J=240.6, 10.1 Hz), 146.7, 144.7, 141.5 (dd, J=7.4, 2.2 Hz), 140.1 (dd, J=239.0, 14.0 Hz), 132.9, 130.7, 127.8, 127.2, 124.8 (dd, J=9.4, 4.3 Hz), 124.7, 123.7, 110.7, 106.4 (d, J=17.8 Hz), 60.5, 41.7, 25.6, 18.9. HRMS (ESI) calcd for C₂₁H₁₉Cl- F₂N₃O [M＋H]^＋402.1179, found 402.1181.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-(7-甲氧基-4-氯喹啉)-6-甲酰胺(V11): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶ V=1∶1)得246 mg白色固体, 产率61%, m.p. 198~200 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.02 (d, J=7.2 Hz, 1H), 8.81 (d, J=4.8 Hz, 1H), 8.36 (s, 1H), 7.64 (d, J=4.8 Hz, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.03~6.97 (m, 1H), 6.74~6.67 (m, 1H), 6.41 (t, J=8.4 Hz, 1H), 4.91~4.83 (m, 1H), 4.35~4.31 (m, 2H), 4.02 (s, 3H), 4.00~3.95 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 164.9, 158.4, 152.5, 151.1, 151.0 (dd, J=241.0, 10.4 Hz), 142.0, 141.4 (dd, J=7.3, 2.2 Hz), 140.1 (dd, J=239.2, 14.8 Hz), 128.2, 125.9, 124.8 (dd, J=8.9, 4.3 Hz), 120.6, 120.2, 110.7, 108.9, 106.3 (d, J=17.4 Hz), 60.5, 56.9, 41.5. HRMS (ESI) calcd for C₂₀H₁₇ClF₂N₃O₂ [M＋H]^＋404.0972, found 404.0969.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-(4-甲基-8-氯喹啉)-6-甲酰胺(V12): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=3∶1)得248 mg白色固体, 产率64%, m.p. 244~246 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.38 (d, J=7.2 Hz, 1H), 8.94 (d, J=4.4 Hz, 1H), 8.62 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 7.57 (d, J=4.4 Hz, 1H), 7.05~7.00 (m, 1H), 6.76~6.70 (m, 1H), 6.45 (t, J=8.0 Hz, 1H), 4.96~4.88 (m, 1H), 4.39~4.34 (m, 2H), 4.04~4.00 (m, 2H), 2.79 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 164.8, 152.8, 151.0 (dd, J=241.2, 10.1 Hz), 147.0, 145.0, 141.5 (dd, J=7.6, 2.1 Hz), 130.7 (dd J=245.8, 15 Hz), 133.8, 131.6, 128.9, 127.9, 124.8 (dd, J=9.1, 4.4 Hz), 124.1, 124.0, 110.7, 106.6 (d, J=17.5 Hz), 60.5, 41.8 (d, J=2.2 Hz), 19.0. HRMS (ESI) calcd for C₂₀H₁₇ClF₂N₃O [M＋H]^＋388.1023, found 388.1024.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-(8-氟-4-甲基喹啉)-6-甲酰胺(V13): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=1∶1)得245 mg白色固体, 产率66%, m.p. 225~226 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.35 (d, J=6.8 Hz, 1H), 8.88 (d, J=4.4 Hz, 1H), 8.49 (d, J=1.2 Hz, 1H), 7.99 (dd, J=11.2, 1.6 Hz, 1H), 7.56 (dd, J=4.4, 1.2 Hz, 1H), 7.06~7.00 (m, 1H), 6.76~6.70 (m. 1H), 6.47~6.42 (m, 1H), 4.95~4.87 (m, 1H), 4.39~4.34 (m, 2H), 4.04~4.00 (m, 2H), 2.78 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 165.0 (d, J=2.2 Hz), 157.9 (d, J=254.9 Hz), 152.4, 151.0 (dd, J=241.1, 10.4 Hz), 146.4 (d, J=2.6 Hz), 141.5 (dd, J=7.4, 2.3 Hz), 140.1 (dd, J=239.2, 14.9 Hz), 139.2 (d, J=11.6 Hz), 131.7 (d, J=7.0 Hz), 129.3 (d, J=2.2 Hz), 124.8 (dd, J=9.0, 4.3 Hz), 124.2, 120.5 (d, J=4.2 Hz), 112.1 (d, J=20.8 Hz), 110.7 (dd, J=5.4, 2.9 Hz), 106.4 (d, J=17.5 Hz), 60.5 (d, J=1.9 Hz), 41.8, 19.0. HRMS (ESI) calcd for C₂₀H₁₇F₃N₃O [M＋H]^＋372.1318, found 372.1320.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-(1H-吡咯并[3,2-b]吡啶)-2-甲酰胺(V14): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=2∶1)得128 mg浅黄色固体, 产率39%, m.p. 178~179 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 11.88 (s, 1H), 9.21 (d, J=7.3 Hz, 1H), 8.40 (dd, J=4.5, 1.4 Hz, 1H), 7.81~7.78 (m, 1H), 7.38 (d, J=1.9 Hz, 1H), 7.21~7.18 (m, 1H), 7.07~6.94 (m, 1H), 6.78~6.64 (m, 1H), 6.41 (t, J=8.0 Hz, 1H), 4.97~4.89 (m, 1H), 4.37~4.33 (m, 2H), 4.02~3.98 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 160.9, 151.0 (dd, J=242.4, 10.5 Hz), 145.4, 144.4, 141.5 (dd, J=4.0, 2.0 Hz), 140.2 (dd, J=238.0, 14.0 Hz), 134.1, 130.0, 124.8 (dd, J=9.1, 4.2 Hz), 120.2, 119.0, 110.6, 106.4 (d, J=17.7 Hz), 103.4, 60.6, 41.2; HRMS (ESI) Calcd for C₁₇H₁₅F₂N₄O [M＋H]^＋329.1208, found 329.1206.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶)-5-甲酰胺(V15): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=1∶1)得112 mg浅黄色固体, 产率34%, m.p. 180~181 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 11.94 (s, 1H), 9.25 (d, J=7.3 Hz, 1H), 8.41 (dd, J=4.4, 1.5 Hz, 1H), 7.85~7.75 (m, 1H), 7.38 (d, J=1.9 Hz, 1H), 7.21~7.18 (m, 1H), 7.07~6.94 (m, 1H), 6.78~6.64 (m, 1H), 6.41 (t, J=8.0 Hz, 1H), 4.97~4.89 (m, 1H), 4.37~4.33 (m, 2H), 4.02~3.98 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 160.9, 151.1 (dd, J=242.4, 10.5 Hz), 145.4, 144.4, 141.5 (dd, J=7.6, 2.5 Hz), 139.7 (dd, J=239.3, 14.0 Hz), 134.1, 129.9, 124.7 (dd, J=9.1, 4.2 Hz), 120.1, 118.9, 110.6, 106.3 (d, J=17.7 Hz), 103.4, 60.6, 41.2. HRMS (ESI) calcd for C₁₇H₁₅F₂N₄O [M＋H]^＋329.1208, found 329.1208.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-(1H吲哚)-7-甲酰胺(V16): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=3∶1)得115 mg浅黄色固体, 产率35%, m.p. 176~178 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 11.22 (s, 1H), 9.09 (d, J=6.9 Hz, 1H), 7.76 (dd, J=7.7, 5.2 Hz, 2H), 7.38 (t, J=2.8 Hz, 1H), 7.09 (t, J=7.7 Hz, 1H), 7.06~6.93 (m, 1H), 6.83~6.67 (m, 1H), 6.55~6.49 (m, 1H), 6.42 (t, J=8.4 Hz, 1H), 5.00~4.92 (m, 1H), 4.38~4.33 (m, 2H), 4.06~4.03 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 167.4, 151.0 (dd, J=242.5, 10.4 Hz), 141.6 (dd, J=7.3, 2.3 Hz), 140.1 (dd, J=240.5, 14.8 Hz), 134.7, 129.7, 127.2, 124.7 (dd, J=8.9, 4.3 Hz), 124.5, 120.6, 118.5, 116.9, 110.6, 106.2(d, J=17.4 Hz), 101.5, 60.6, 41.3. HRMS (ESI) calcd for C₁₈H₁₆F₂N₃O [M＋H]^＋328.1256, found 328.1255.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-(1H-吲哚)-5-甲酰胺(V17): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=1∶1)得114 mg浅黄色固体, 产率35%, m.p. 178~179 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 11.36 (s, 1H), 8.88 (d, J=7.0 Hz, 1H), 8.20 (d, J=1.6 Hz, 1H), 7.68 (dd, J=8.6, 1.8 Hz, 1H), 7.50~7.39 (m, 2H), 7.13~6.95 (m, 1H), 6.83~6.67 (m, 1H), 6.55~6.54 (m, 1H), 6.41 (t, J=8.2 Hz, 1H), 4.93~4.85 (m, 1H), 4.38~4.30 (m, 2H), 4.04~3.96 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 167.6, 151.02 (dd, J=240.5, 9.6 Hz), 141.7 (dd, J=7.5, 1.6 Hz), 140.1 (dd, J=239.6, 15.0 Hz), 137.9, 127.5, 127.2, 125.3, 124.7 (dd, J=8.8, 4.5 Hz), 121.1, 120.6, 111.4, 110.6, 106.2 (d, J=17.7 Hz), 102.6, 60.8, 41.5. HRMS (ESI) calcd for C₁₈H₁₆F₂N₃O [M＋H]^＋328.1256, found 328.1255.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-(2H-苯并[d][1,2,3]三唑)-4-甲酰胺(V18): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=2∶1)得105 mg深黄色固体, 产率32%, m.p. 180~181 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.22 (d, J=6.9 Hz, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.01~7.94 (m, 2H), 7.01~6.95 (m, 1H), 6.71~6.45 (m, 1H), 6.39 (t, J=8.4 Hz, 1H), 4.92~4.87 (m, 1H), 4.34~4.31 (m, 2H), 4.02~3.98 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 166.2, 151.0 (dd, J=242.6, 10.4 Hz), 141.5 (dd, J=7.1, 1.9 Hz), 140.1 (dd, J=240.8, 14.9 Hz), 131.2, 128.8, 128.1, 125.7, 124.7 (dd, J=8.9, 4.2 Hz), 116.2, 116.0, 114.3, 110.6, 106.3, 106.1, 60.5, 41.7. HRMS (ESI) calcd for C₁₆H₁₄F₂N₅O [M＋H]^＋330.1161, found 330.1160.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-(苯并[c][1,2,5]噁二唑)-5-甲酰胺(V19): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=1∶1)得119 mg白色固体, 产率36%, m.p. 200~201 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.44 (d, J=6.8 Hz, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.15 (d, J=8.5 Hz, 1H), 7.96 (d, J=9.4 Hz, 1H), 7.14~6.92 (m, 1H), 6.81~6.64 (m, 1H), 6.43 (t, J=8.2 Hz, 1H), 4.90~4.82 (m, 1H), 4.37~4.32 (m, 2H), 4.00~3.97 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 164.7, 151.0 (dd, J=242.5, 10.2 Hz), 149.6, 149.3, 141.4 (dd, J=7.4, 2.2 Hz), 140.1 (dd, J=240.7, 14.9 Hz), 137.9, 131.8, 124.8 (dd, J=8.9, 4.3 Hz), 116.9, 116.4, 110.6, 106.4 (d, J=17.2 Hz), 60.4, 41.8. HRMS (ESI) calcd for C₁₆H₁₃F₂N₄O₂ [M＋H]^＋331.1001, found 331.1002.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-(2-氯-苯并噻唑)-6-甲酰胺(V20): 方案二, 柱层析(EA/PE, V∶V=2∶1)得205 mg白色固体, 产率54%, m.p. 198~200 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.20 (d, J=6.9 Hz, 1H), 8.61 (s, 1H), 8.21~7.90 (m, 2H), 7.02~6.97 (m, 1H), 6.73~6.66 (m, 1H), 6.40 (t, J=8.1 Hz, 1H), 4.90~4.85 (m, 1H), 4.34~4.31 (m, 2H), 3.99~3.96 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 165.7, 155.8, 152.7, 151.0 (dd, J=242.7, 10.4 Hz), 141.5 (dd, J=7.4, 2.0 Hz), 140.1 (dd, J=247.4, 13.7 Hz), 136.2, 132.0, 126.4, 124.7 (dd, J=8.6, 3.8 Hz), 122.6, 122.5, 110.6, 106.2 (d, J=17.4 Hz), 60.5, 41.7. HRMS (ESI) calcd for C₁₇H₁₃ClF₂N₃OS [M＋H]^＋380.0430, found 380.0433.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-(2-溴-苯并噻唑)-6-甲酰胺(V21): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=1∶1)得233 mg白色固体, 产率55%, m.p. 200~202 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.20 (d, J=6.9 Hz, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.17~7.94 (m, 2H), 7.13~6.88 (m, 1H), 6.82~6.62 (m, 1H), 6.42 (t, J=8.0 Hz, 1H), 4.91~4.83 (m, 1H), 4.35~4.31 (m, 2H), 3.99~3.96 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 165.7, 154.0, 151.0 (dd, J=242.7, 10.4 Hz), 142.9, 141.5 (dd, J=7.2, 2.3 Hz), 140.5 (dd, J=240.8, 9.2 Hz), 137.4, 131.9, 126.4, 124.9 (dd, J=8.6, 4.2 Hz), 122.4, 122.3, 110.6, 106.3 (d, J=17.2 Hz), 60.5, 41.7. HRMS (ESI) calcd for C₁₇H₁₃BrF₂N₃OS [M＋H]^＋423.9925, found 423.9927.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-(1-甲基苯并咪唑)-5-甲酰胺(V22): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=2∶1)得168 mg白色固体, 产率49%, m.p. 220~221 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.04 (d, J=6.9 Hz, 1H), 8.30 (s, 2H), 7.88 (dd, J=8.5, 1.6 Hz, 1H), 7.64 (d, J=8.5 Hz, 1H), 7.14~6.92 (m, 1H), 6.78~6.63 (m, 1H), 6.41 (t, J=8.2 Hz, 1H), 4.94~4.86 (m, 1H), 4.34~4.31 (m, 2H), 4.02~3.98 (m, 2H), 3.87 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 166.9, 151.0 (dd, J=242.6, 10.3 Hz), 146.7, 143.3, 141.7 (dd, J=7.3, 1.9 Hz), 140.1 (dd, J=240.6, 14.9 Hz), 137.2, 127.9, 124.7 (dd, J=9.0, 4.2 Hz), 122.5, 119.3, 110.6, 110.4, 106.2 (d, J=17.4 Hz), 60.7, 41.5, 31.3. HRMS (ESI) calcd for C₁₈H₁₇F₂N₄O [M＋H]^＋343.1365, found 343.1364.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环基)-6-甲酰胺(V23): 方案二, 柱层析(EA/PE, V∶V=2∶1)得204 mg白色固体, 产率59%, m.p. 170~172 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 8.84 (d, J=6.9 Hz, 1H), 7.49~7.38 (m, 2H), 7.10~6.97 (m, 1H), 6.93 (d, J=8.4 Hz, 1H), 6.80~6.59 (m, 1H), 6.40 (t, J=8.0 Hz, 1H), 4.86~4.78 (m, 1H), 4.30~4.28 (m, 6H), 3.95~3.92 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 165.6, 151.0 (dd, J=242.6, 10.3 Hz), 146.6, 143.4, 141.6 (dd, J=7.3, 2.2 Hz), 140.1 (dd, J=240.6, 14.8 Hz), 127.3, 124.7 (dd, J=9.0, 4.2 Hz), 121.3, 117.2, 116.8, 110.6, 106.2 (d, J=17.5 Hz), 64.8, 64.5, 60.6, 41.4. HRMS (ESI) calcd for C₁₈H₁₇F₂N₂O₃ [M＋H]^＋347.1202, found 347.1202.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-(1-甲基-3-二氟甲基-1H-吡唑)-4-甲酰胺(V24): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=1∶1)得137 mg浅黄色色固体, 产率40%, m.p. 202~203 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 8.83 (d, J=7.3 Hz, 1H), 8.31 (s, 1H), 7.50~7.15 (m, 1H), 7.06~6.95 (m, 1H), 6.79~6.64 (m, 1H), 6.41 (t, J=8.4 Hz, 1H), 4.81~4.75 (m, 1H), 4.31~4.27 (m, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.93~3.86 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 161.3, 151.0 (dd, J=242.5, 9.8 Hz), 145.3 (t, J=24.7 Hz), 141.5 (dd, J=7.5, 2.5 Hz), 140.0 (dd, J=225.0, 15.0 Hz), 132.9, 124.9 (dd, J=7.9, 4.3 Hz), 116.1, 110.7 (t, J=232.0 Hz), 107.6, 106.4 (dd, J=17.4, 1.0 Hz), 67.8, 60.7, 40.9. HRMS (ESI) calcd for C₁₅H₁₅F₄N₄O [M＋H]^＋343.1177, found 343.1175.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-吡啶-2-甲酰胺(V25): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=1∶1)得171 mg白色固体, 产率59%, m.p. 180~181 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.41 (d, J=7.6 Hz, 1H), 8.70~8.60 (m, 1H), 8.07~8.03 (m, 1H), 8.02~7.97 (m, 1H), 7.64~7.56 (m, 1H), 7.10~6.88 (m, 1H), 6.78~6.59 (m, 1H), 6.48~6.31 (m, 1H), 4.94~4.85 (m, 1H), 4.30~4.26 (m, 2H), 4.08~4.04 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 164.3, 151.0 (dd, J=242.3, 10.5 Hz), 150.1, 148.9, 141.7 (dd, J=7.3, 2.3 Hz), 140.1 (dd, J=239.0, 15.0 Hz),138.2, 127.1, 124.7 (dd, J=9.0, 4.3 Hz), 122.5, 110.7, 106.1 (d, J=17.0 Hz), 60.4, 41.1. HRMS (ESI) calcd for C₁₅H₁₄F₂N₃O [M＋H]^＋ 290.1099, found 290.1100.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-(噻吩并[3,2-b]噻吩)-2-甲酰胺(V26): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=2∶1)得165 mg白色固体, 产率47%, m.p. 188~189 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.25 (d, J=7.1 Hz, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.93 (d, J=5.3 Hz, 1H), 7.57 (d, J=5.4 Hz, 1H), 7.13~7.04 (m, 1H), 6.85~6.74 (m, 1H), 6.54~6.46 (m, 1H), 4.97~4.83 (m, 1H), 4.44~4.34 (m, 2H), 4.08~3.99 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 161.8, 150.9 (dd, J=241.0, 17.0 Hz), 142.2, 141.5 (dd, J=8.0, 3.0 Hz), 141.2, 140.2 (dd, J=235.0, 6.0 Hz), 138.9, 132.1, 124.8 (dd, J=9.1, 4.4 Hz), 121.7, 120.8, 110.7, 106.4 (d, J=17.3 Hz), 60.6, 41.6. HRMS (ESI) calcd for C₁₆H₁₃F₂N₂OS₂ [M＋H]^＋351.0432, found 351.0431.

N-[3-二氟苯基)氮杂环丁烷-3-基]-(咪唑并[1,2-a]吡啶)-6-甲酰胺(V27): 方案一, 柱层析(EA/PE, V∶V=1∶1)得154 mg浅黄色固体, 产率47%, m.p. 198~199 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ: 9.34~9.01 (m, 2H), 8.09 (s, 1H), 7.79~7.54 (m, 3H), 7.12~6.91 (m, 1H), 6.84~6.61 (m, 1H), 6.42 (t, J=8.1 Hz, 1H), 4.93~4.85 (m, 1H), 4.36~4.32 (m, 2H), 4.00~3.97 (m, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 164.5, 151.0 (dd, J=242.2, 10.5 Hz), 145.1, 141.5 (dd, J=7.4, 1.9 Hz), 140.1 (dd, J=240.7, 14.8 Hz), 134.9, 129.2, 124.8 (dd, J=9.0, 4.3 Hz), 123.3, 119.7, 116.5, 114.8, 110.6, 106.3 (d, J=17.4 Hz), 60.6, 41.6. HRMS (ESI) calcd for C₁₇H₁₅F₂N₄O [M＋H]^＋329.1208, found 329.1208.

3.4 M4受体的正向变构调节细胞活性测试

3.4.1 实验准备

细胞准备: 移除384孔板中的培养基, 用3 mL D-PBS(杜氏磷酸缓冲盐)洗涤细胞一次. 洗涤后, 吸弃D-PBS, 加入3 mL胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸), 在37 ℃孵育1~2 min, 通过倒置显微镜观察酶处理的进展情况; 轻拍培养瓶壁使细胞脱落; 加入3 mL生长培养基, 用移液管充分悬浮细胞, 将底部剩余的细胞洗涤, 以1000 r/min离心5 min; 小心弃去上清液, 避免触及细胞沉淀. 用5~10 mL的培养基重新悬浮细胞, 取出1 mL进行细胞计数; 用Vi-Cell计数细胞浓度. 将细胞以105个/毫升×10的浓度悬浮于生长培养基中; 在384孔板的每个孔中加入20 µL细胞悬液(20 K/well); 将细胞放入37 ℃、5% CO₂的培养箱中过夜.

FLIPR实验准备: 准备FLIPR实验缓冲液中的Probenecid; 准备2倍(8 µmol/L)的Fluo 4 Direct TM免洗上样缓冲液(每10 mL).

3.1.2 实验流程

化合物制备: 将待测化合物以二甲基亚砜(DMSO)配制成10 mmol/L化合物储液, 将每个化合物进行3倍梯度稀释, 10个浓度梯度, 设置3个平行, 然后使用ECHO移液系统将250 nL化合物转移到384孔化合物板中. 加入50 μL实验缓冲液, 震荡15 min.

加入Fluo 4: 从培养箱取出细胞板, 轻轻去除培养基, 用移液器向384孔细胞培养板中加入20 μL实验缓冲液和20 µL 2倍Fluo 4 Direct TM无需洗涤加载缓冲液. 细胞培养板中最终体积为40 µL.

孵育: 在37 ℃、5% CO₂下孵育2 h.

准备FLIPR: 从培养箱取出细胞板, 放入FLIPR中. 将化合物板和吸头盒放入FLIPR中.

对于化合物板(激动剂测试): 在FLIPRTETRA上运行协议, 从化合物板向细胞板转移10 µL参考物质和化合物; 读取荧光信号; 计算从第一次读数到最大允许值的“Max Min”. 使用FLIPR计算每个细胞系的EC₂₀值; 准备6×EC₂₀浓度的激动剂参考化合物.

对于化合物板(PAM测试): 在FLIPRTETRA上运行协议; 将化合物板中的10 µL参考物质和化合物转移到细胞板; 读取荧光信号; 从化合物板中转移6×EC₂₀的激动剂参考物质到细胞板上; 读取荧光信号; 计算从第一次读数到最大允许值的“Max Min”.

数据处理分析: 通过信号值与化合物浓度作图, 用如下GraphPad非线性拟合公式计算化合物EC₅₀:

$ Activity (\%)=( Signalcmpd —SignalAve_VC ) / (SignalAve_PC-SignalAve_VC) \times 100 \% $

Signalcmpd: 目标化合物的荧光信号, SignalAve_VC: 空白对照组荧光信号, SignalAve_PC: 对照化合物VU0467154的荧光信号.

$ Y= Bottom +( Top - Bottom ) /\left\{1+10^{\wedge}\left[\left(\log \mathrm{EC}_{50} X\right) \times\right.\right. HillSlope]\} $

X: 化合物浓度log值; Y: Activation (%); Top、Bottom、EC₅₀由GraphPad自动拟合生成; HillSlope: 希尔斜率.

辅助材料(Supporting Information) 目标化合物V1~V27的¹H NMR, ¹³C NMR和HRMS谱图. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

(Cheng, F.)

参考文献

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Abstract

图1 目标化合物V1~V27的设计

1 结果与讨论

1.1 目标化合物分子对接与合成

表1 所设计化合物与M4受体蛋白变构位点结合亲和力评价

图2 目标化合物V1~V27的合成路线

1.2 M4受体的正向变构调节活性测试

表2 目标化合物V1~V27的EC50

1.3 构效关系分析

1.4 分子对接

图3 化合物与M4变构位点的结合模式

2 结论

3 实验部分

3.1 仪器与试剂

3.2 分子对接及亲和力预测

3.3 化合物的合成

3.3.1 中间体N-(2,3-二氟苯基)氮杂环丁-3-基氨基甲酸叔丁酯(III)的合成

3.3.2 中间体N-(2,3-二氟苯基)氮杂环丁-3-胺(IV)的合成

3.3.3 目标化合物V1~V27的合成

3.4 M4受体的正向变构调节细胞活性测试

3.4.1 实验准备

3.1.2 实验流程

参考文献

表2 目标化合物V1~V27的EC₅₀