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2026 , Vol. 46 >Issue 5: 2067 - 2071

DOI: https://doi.org/10.6023/cjoc202511016

研究论文

Streptomyces sp. N12W1565中抑菌溴代naphthacemycin的表征

  • 彭淑娅 a, b ,
  • 路新华 c ,
  • 花强 , a, * ,
  • 唐功利 , b, *
展开
  • a 华东理工大学生物工程学院 上海 200030
  • b 中国科学院上海有机化学研究所 上海 200032
  • c 微生物药物国家工程研究中心 石家庄 050015

收稿日期: 2025-12-25

  修回日期: 2026-01-13

  网络出版日期: 2026-02-12

基金资助

国家自然科学基金(22137009)

收起

Characterization of Antibacterial Bromo-naphthacemycin from Streptomyces sp. N12W1565

  • Shuya Peng a, b ,
  • Xinhua Lu c ,
  • Qiang Hua , a, * ,
  • Gongli Tang , b, *
Expand
  • a School of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai 200030
  • b Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032
  • c National Microbial Medicine Engineering and Research Center, Shijiazhuang 050015
* E-mail: ;

Received date: 2025-12-25

  Revised date: 2026-01-13

  Online published: 2026-02-12

Supported by

National Natural Science Foundation of China(22137009)

Fold

摘要

卤化天然产物naphthacemycin分离于中草药千里光茎上的一株链霉菌Streptomyces sp. N12W1565, 前期已确定该天然产物的多氯取代反应由naphthacemycin生物合成基因簇中的多位点氯化酶NatC催化, 通过调控该链霉菌生长环境中的卤素原子种类, 有望实现不同卤化天然产物的生成. 本研究通过优化该链霉菌的发酵培养条件实现溴代naphthacemycin的产生, 并利用高分辨电喷雾电离质谱和核磁共振成功表征三个新的一溴取代naphthacemycin, 其中化合物naphthacemycin BB1 (5)和naphthacemycin BB3 (7)表现出显著优于未发生溴化的naphthacemycin B2 (1)的抑菌活性.

关键词： II型聚酮类天然产物; naphthacemycin; 卤化; 抑菌

本文引用格式

彭淑娅 , 路新华 , 花强 , 唐功利 . Streptomyces sp. N12W1565中抑菌溴代naphthacemycin的表征[J]. 有机化学, 2026 , 46(5) : 2067 -2071 . DOI: 10.6023/cjoc202511016

Abstract

The halogenated natural product naphthacemycin was isolated from Streptomyces sp. N12W1565 strain associated with the stems of the traditional Chinese medicinal herb Senecio scandens Buch.-Ham. Ex D. Don. Previous studies have established that polychlorination of this metabolite was catalyzed by the multi-site halogenase NatC encoded within the naphthacemycin biosynthetic gene cluster, suggesting that modulation of halide species in the culture medium can enable the generation of diverse halogenated analogues. In this study, brominated naphthacemycins were produced by optimizing the fermentation conditions of this strain. Three novel monobrominated naphthacemycins were successfully characterized by high-resolution electrospray ionization mass spectrometry (HR-ESI-MS) and nuclear magnetic resonance (NMR) spectro- scopy, among which naphthacemycin BB1 (5) and naphthacemycin BB3 (7) exhibited significantly enhanced antibacterial activity compared to the non-brominated naphthacemycin B2 (1).

Key words： type II polyketides natural product; naphthacemycin; halogenation; antibacterial

千里光(Senecio scandens Buch.-Ham. Ex D. Don)是菊科千里光属的一种多年生草质藤本植物, 广泛分布于中国南方及东南亚国家, 全草可入药, 传统用于抗菌、消炎和抗病毒等[1]. 研究表明该植物茎上分离得到的Streptomyces sp. N12W1565可以产生一系列多氯取代的II型聚酮类化合物naphthacemycins(图1A), 其最高可上载五个氯原子, 且该化合物具有高度共轭的并四苯结构和多个羟基取代[2]. Naphthacemycins的生物活性测定显示其五氯取代化合物对蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatase 1B, PTP1B)具有显著的抑制活性. 此外, 氯原子的引入增强了naphthacemycin的抗肿瘤活性, 例如人乳腺癌细胞系(MDA-MB-436, MDA-MB-231和MCF-7)[3]. 卤素原子因其独特的理化性质, 通常会对分子的生物活性和药理参数具有显著影响, 但是截至目前, 尚未报道naphthacemycin溴化物的相关研究. 本课题组[4]前期鉴定了naphthacemycin的生物合成基因簇nat, 且已确定其中的黄素依赖多位点卤化酶NatC负责该天然产物的多卤化反应[5], 提示该微生物在合适的生长条件下有可能产生仅上载溴原子的天然产物. 基于以上工作, 本研究通过优化Streptomyces sp. N12W1565的发酵培养条件, 调控微生物生长环境中的卤素原子种类及浓度, 实现naphthacemycin溴化物的产生, 最终获得三种一溴取代naphthacemycin, 其结构新颖且均具备抑制革兰氏阳性菌生长的活性.
图1 (A)推测的naphthacemycin生物合成途径; (B) Streptomyces sp. N12W1565在Bn-2固体培养基上的生长状态; (C) LC-MS检测Streptomyces sp. N12W1565在不同培养基中的发酵产物

Figure 1 (A) Proposed biosynthetic pathway of naphthacemycin; (B) Growth state of Streptomyces sp. N12W1565 on Bn-2 solid medium; (C) Fermentation products of Streptomyces sp. N12W1565 in different media were detected by LC-MS

1 结果与讨论

1.1 Streptomyces sp. N12W1565发酵条件的优化

Naphthacemycin B2 (1)和其卤化产物naphthace- mycins B5~B13分离于Streptomyces sp. N12W1565, 其中naphthacemycin B6 (2)和naphthacemycin B5 (3)是化合物1发生一氯取代的产物(图1A), naphthacemycin B4 (4)是本课题组前期基于该链霉菌的原始发酵条件获得并鉴定其结构的一氯化物. 本研究基于该链霉菌的原始发酵条件进行重复发现, 该培养基含有营养成分丰富的大豆饼粉, 难以完全规避氯原子的存在, 故本研究尝试用其他成分相对较为简单的培养基进行该链霉菌的发酵.
首先选取IWL-4, ISP-2和Bn-2三种固体培养基对Streptomyces sp. N12W1565进行复苏培养, 于30 ℃培养箱倒置培养3 d后发现, 接种该链霉菌的Bn-2平板整体呈现亮黄色(图1B), 这与化合物naphthacemycins的颜色一致. 对Bn-2培养物进行丙酮浸泡和真空干燥后进行LC-MS分析显示, 不仅已经产生化合物1及其一氯化物2~4, 且已经开始积累化合物1的五氯化物(图1C). Bn-2培养基中含有营养成分复杂的酵母提取物、麦芽提取物以及NZ-case, 此外还额外添加2 g/L的NaCl, 从而促使naphthacemycin及其氯化物的快速产生. 本研究基于Bn-2培养基, 除了将NaCl替换为NaBr以外, 还尝试改变NaBr的添加量(2, 4以及10 g/L). LC-MS分析显示, NaBr添加量为4 g/L时, 该链霉菌成功积累大量化合物1的溴化产物, 其中就包括化合物1的三种一溴化物(图1C), 且其发酵物积累明显与添加氯原子的发酵情况不同.

1.2 Naphthacemycin溴化物的分离及鉴定

基于以上优化的Bn-2培养基对Streptomyces sp. N12W1565进行大量固体发酵, 用丙酮对发酵培养基进行反复浸泡萃取得到发酵粗提物, 最终通过硅胶柱层析和半制备分离成功纯化, 得到三种一溴化物5, 6和7, 均为黄色无定形粉末. 单溴取代化合物具有同比例的同位素分子离子峰, 高分辨质谱(HR-ESI-MS)给出化合物5的准分子离子峰m/z 551.0700 [M＋H]＋和553.0688 [M＋H]＋, 化合物6的准分子离子峰m/z 551.0699 [M＋H]＋和553.0688 [M＋H]＋, 化合物7的准分子离子峰m/z 551.0700 [M＋H]＋和553.0686 [M＋H]＋. 这三个化合物的分子式均为C28H24BrO7(计算值551.0700 [M＋H]＋和553.0680 [M＋H]＋).
通过核磁共振波谱(1H NMR, 13C NMR和2D NMR)解析了化合物5, 6和7的化学结构(表1). 化合物5的1H NMR 存在两个甲基信号(δH 1.72, 1.89), 一个甲氧基信号(δH3.60, 16-OMe)和五个芳基氢信号(δH 6.34, 6.66, 6.79, 7.04, 7.37). 芳基氢的重叠信号(δH 6.34)为H-17和H-19的特征吸收, 化合物5的NOESY谱中显示H-17和H-19分别与16-OMe和δH 1.89存在相关, 故可确定δH 1.89为21-Me信号. 化合物5的1H-1H COSY谱中显示δH 6.66和7.04存在相关, 且偶合常数为2.5 Hz, 所以δH 6.66为H-8信号, δH 7.04为H-10信号. 重叠的甲基信号(δH 1.72)为13-Me和14-Me的特征吸收, 化合物5的NOESY谱中显示13-Me与δH 6.79存在相关信号, 14-Me与δH 7.37存在相关信号(图2), 所以δH 6.66和7.37分别为H-1和H-11信号. 化合物5的HMBC谱图显示H-1与C-2、C-3、C-5和C-12相关, 至此证明化合物5的溴取代发生在C-3.
表1 化合物5 (Methanol-d4), 6 (Acetone-d6)和7 (Methanol-d4)的核磁共振图谱数据(500/125 MHz)

Table 1 NMR spectroscopic data (500/125 MHz) of compounds 5 (Methanol-d4), 6 (Acetone-d6) and 7 (Methanol-d4)

No. 5 6 7
δC δH, mult. (J in Hz) δC δH, mult. (J in Hz) δC δH, mult. (J in Hz)
1 107.0 6.79, s 107.0 6.77, t (2.7) 107.3 6.69, d (2.2)
2 163.8 166.1 166.9
3 108.8 102.0 6.29, d (2.3) 102.2 6.22, d (2.2)
4 162.8 166.5 169.4
4a 108.8 108.2 108.6
5 191.0 191.1 191.6
5a 107.4 107.3 107.9
6 167.1 166.5 166.5
6a 118.0 117.5 119.0
7 141.2 142.4 140.2
8 122.4 6.66, d (2.5) 122.0 6.77, t (2.7) 121.5 6.77, s
9 160.3 159.7 158.1
10 110.0 7.04, d (2.5) 110.2 7.20, d (2.5) 105.6
10a 143.0 140.2 139.8
11 116.3 7.37, s 116.0 7.50, s 115.2 7.92, s
11a 146.1 146.2 148.1
12 39.6 39.4 40.2
12a 153.9 155.5 155.8
13 34.6 1.72a, s 34.7 1.73, s 35.0 1.76a, s
14 34.5 1.72a, s 34.2 1.74, s 34.9 1.76a, s
15 125.8 126.6 125.3
16 158.8 157.4 158.7
17 97.3 6.34a, s 98.1 6.63, s 97.3 6.34a, s
18 157.4 154.2 157.0
19 109.2 6.34a, s 104.1 109.2 6.34a, s
20 137.9 136.6 137.7
21 20.6 1.89, s 21.3 1.97, s 20.3 1.90, s
16-OMe 56.0 3.60, s 55.9 3.58, s 56.0 3.59, s

a Overlapped.

图2 化合物5~7的主要HMBC和NOESY相关

Figure 2 Selective key HMBC and NOESY correlations of compounds 5~7

化合物6的1H NMR谱中存在三个甲基信号(δH 1.73, 1.74, 1.97)、一个甲氧基信号(δH 3.58)和五个芳基氢信号(δH 6.29, 6.63, 6.77, 7.20, 7.50). 化合物6的1H NMR谱中并未出现芳基氢的重叠信号, 这提示溴取代可能发生在E环. 化合物6的HSQC谱中显示C-17与δH 6.63存在相关, 所以δH 6.63为H-17信号, 且没有与C-19相关的氢信号. 化合物6的HMBC谱图显示E环中仅存在H-17与C-15、C-16、C-18和C-19的相关以及16-OMe和C-16的相关(图2), 所以化合物6的溴取代发生在E环的C-19.
化合物7的1H NMR谱中存在两个甲基信号(δH 1.76a, 1.90), 一个甲氧基信号(δH 3.59)和五个芳基氢信号(δH 6.22, 6.34, 6.69, 6.77, 7.92). 芳基氢的重叠信号(δH 6.34)为H-17和H-19的特征吸收, 且化合物7的NOESY谱图显示该重叠信号与16-OMe和21-Me存在相关, 故可确定化合物7的E环没有发生取代. 此外化合物7的1H-1H COSY谱中显示δH 6.69和6.22存在相关, 且偶合常数为2.2 Hz, 所以δH 6.69为H-1信号, δH 6.22为H-3信号, 即化合物7的溴取代发生在D环. 化合物7的NOESY谱图显示14-Me与δH 7.92存在相关, 21-Me与δH 6.77存在相关, 所以δH 7.92为H-11信号, δH 6.77为H-8信号, 并且化合物7的HMBC谱图显示, 该化合物的D环上仅存在H-8与C-6a、C-10和C-15的相关, 说明H-10消失, 即化合物7的溴取代发生在C-10.
至此化合物5, 6和7的结构得以解析, 发生溴代的位点分别为C-3, C-19和C-10.

1.3 Naphthacemycin溴化物抑菌活性的测定

研究表明卤素的引入可以增强化合物的生物活 性[6], 例如万古霉素与肽聚糖靶标的结合能力显著高于去氯万古霉素. 据报道, naphthacemycin B2 (1)具有激酶抑制剂活性以及抗肿瘤活性, 但是其抑菌活性的相关研究较少. 为了拓展naphthacemycin的抑菌生物活性, 本研究选取金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 25923)为测试对象, 结果显示, 化合物5和7对金黄色葡萄球菌的生长抑制显著高于未发生溴化的化合物1, 其IC50值分别为4.94和3.25 μmol/L (图3). 但同样发生一溴取代的化合物6, 其抑菌活性反而弱于化合物1, 从结构上看, 化合物6的溴取代发生在E环, 而化合物5和7的溴取代分别发生在A环和D环, 提示naphthacemycin的A环和D环可能影响底物与耐药菌的结合, 从而体现出不同强度的抑菌效果, 但是具体机制还仍需更多的生化实验来证明, 这也代表选择性溴化对于改变底物的生物活性来讲至关重要.
图3 化合物1及其溴化物的金黄色葡萄球菌抑制活性

Figure 3 Staphylococcus aureus inhibitory activity of compound 1 and its bromides

2 结论

本研究完成了Streptomyces sp. N12W1565发酵条件的优化, 成功分离并鉴定了三个新颖的naphthacem- ycin溴化物5, 6和7, 分别命名为naphthacemycin BB1, naphthacemycin BB2和naphthacemycin BB3. 抑菌结果证实naphthacemycin具有抑制革兰氏阳性菌生长的活性, 且其溴化物显著增强抑菌活性, 并证实选择性溴化对化合物生物活性的重要影响.

3 实验部分

3.1 仪器与试剂

台式离心机Centrifuge 5810R/5415D和Heraeus Pico 17 Centrifuge, 旋转蒸发仪BUCHI Rotavator R-200, 摇床HZQ-R振荡器, 培养箱GHP-9080隔水式恒温培养箱, 质谱仪Thermo Scientific LCQ Fleet Ion Trap, 高效液相色谱仪Dionex Ultimate 3000, 高分辨质谱仪Agilent Technologies 6230 TOF LC/MS, 核磁共振仪Bruker AVANCE DRX-500, 分析色谱柱Grace Alltima TM, 5 μmol∙L－1, C18柱, 4.6 mm×250 mm, 半制备色谱柱YMC-Pack ODS-AQ, 5 μm, C18柱, 10 mm×250 mm. 国产化学试剂购自上海国药集团有限公司, 进口化学试剂购自Sigma-Aldrich公司. 链霉菌Streptomyces sp. N12W1565由华北制药集团新药研发开发有限责任公司路新华老师提供.

3.2 Streptomyces sp. N12W1565的发酵

首先将该菌的甘油菌涂布至Bn-2(每100 mL中加入0.5 g葡萄糖, 0.5 g可溶性淀粉, 0.1 g酵母提取物, 0.1 g麦芽提取物, 0.2 g NZ-case, 0.2 g NaCl, 0.1 g CaCO3)固体培养基进行复苏, 随后接种至50 mL的TSBY(每100 mL中加入3 g TSB, 0.6 g酵母提取物, 0.6 g葡萄糖)培养基进行种子液的培养, 将其放置于30 ℃, 220 r/min的摇床中培养2.5 d后接种至固体发酵培养基中对其进行发酵. 固体发酵培养基为Bn-2, 每个平板倒入100 mL培养基后室温平放至冷却凝固, 随后开盖在风速开到最大的超净台进行干燥0.5 h. 每100 mL固体培养基接种5 mL种子液, 涂布均匀至表面液体不再流动, 放置在超净台中进行干燥, 直至表面不再有液体存在, 放置于30 ℃培养箱中培养一周.

3.3 化合物的检测、分离以及鉴定

发酵结束收集含有Streptomyces sp. N12W1565的固体培养基, 用丙酮进行反复浸泡萃取, 随后合并浸泡液, 真空蒸发去除有机试剂. 残留的水溶液用乙酸乙酯反复萃取, 合并有机相并旋干, 即可得到发酵粗提物. 用甲醇溶解发酵粗提物进行LC-MS分析, 程序为: T=0 min, 50% A, 50% B; T=24 min, 5% A, 95% B; T=26 min, 5% A, 95% B; T=27 min, 50% A, 50% B; T=28 min, 50% A, 50% B; 负离子模式, 流速为1 mL/min, A相为含体积分数为0.1% HCOOH的H2O, B相为含体积分数为0.1% HCOOH的CH3CN, 使用254和432 nm波长检测. 发酵粗提物用C18反向柱层析进行初步的纯化, 再用半制备进行二次纯化. 半制备分离程序: T=0 min, 35% A, 65% B; T=25 min, 5% A, 95% B; T=28 min, 5% A, 95% B; T=29 min, 35% A, 65% B; T=30 min, 35% A, 65% B; 流速为2 mL/min, A相为含体积分数为0.1% HCOOH的H2O, B相为含体积分数为0.1% HCOOH的CH3CN, 使用432 nm波长检测. 对于纯化得到的目标化合物经高分辨质谱和核磁共振分析确定结构.

3.4 抑菌活性测定

首先利用LB培养基对金黄色葡萄球菌进行过夜复苏培养, 随后接种至纯净LB培养基, 37 ℃, 220 r/min振荡培养至OD600值约0.6后, 再次用纯净LB培养基稀释10000倍接种至96孔板中, 将待测小分子按肉汤稀释法配置成不同浓度后加入相应的孔中, 其中设置药物对照孔为加入等体积的DMSO, 空白孔为纯净LB培养基不加入其他物质. 作用10 h后用酶标仪测定OD值, 检测波长为550 nm, 参考波长为650 nm. 空白孔作为背景值, 在计算前需对实验所测数据进行背景值的扣除, 计算细胞抑制率: 抑制率(%)=(1－药物实验组OD值/药物对照孔OD值)×%.
辅助材料(Supporting Information) 化合物5, 6和7的LC-MS分析, HR-ESI-MS和NMR图谱. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.
(Cheng, F.)

参考文献

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