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2026 , Vol. 46 >Issue 8: 3104 - 3113

DOI: https://doi.org/10.6023/cjoc202601032

研究论文

2,4-二酮内酰胺衍生物的设计、合成及其抑制Mpro活性筛选

  • 敖选丽 ,
  • 马超洁 ,
  • 王淑冰 ,
  • 何蕾 ,
  • 赏宇 ,
  • 朱锦阳 ,
  • 李建秀 ,
  • 张琴 ,
  • 张荣平 , * ,
  • 侯博 , *
展开
  • 云南中医药大学中药学院暨云南省南药可持续利用研究重点实验室 昆明 650500

收稿日期: 2026-03-15

  修回日期: 2026-04-09

  网络出版日期: 2026-05-27

基金资助

国家自然科学基金(82360690)

云南省基础研究计划(202401AT070183)

中医药联合专项−面上项目(202301AZ070001-044)

中医药联合专项−面上项目(202401-AZ070001-024)

兴颠英才支持计划

云南省重点领域科技计划(202303AC100025)

云南省科技厅重大科技专项计划(202402AA310027)

云南省教育厅科学研究基金(2025Y0598)

收起

Design, Synthesis and Mpro Inhibitory Activity Screening of 2,4-Diketolactam Derivatives

  • Xuanli Ao ,
  • Chaojie Ma ,
  • Shubing Wang ,
  • Lei He ,
  • Yu Shang ,
  • Jinyang Zhu ,
  • Jianxiu Li ,
  • Qin Zhang ,
  • Rongping Zhang , * ,
  • Bo Hou , *
Expand
  • School of Chinese Materia Medica & Yunnan Key Laboratory of Southern Medicine Utilization, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500
*E-mail: ;

Received date: 2026-03-15

  Revised date: 2026-04-09

  Online published: 2026-05-27

Supported by

National Natural Science Foundation of China(82360690)

Yunnan Fundamental Research Projects(202401AT070183)

Traditional Chinese Medicine (TCM) Joint Special Project-General Project(202301AZ070001-044)

Traditional Chinese Medicine (TCM) Joint Special Project-General Project(202401-AZ070001-024)

Yunnan Xingdian Talent Support Program

Yunnan Provincial Key Fields Science and Technology Program(202303AC100025)

Major Science and Technology Special Project of Yunnan Provincial Department of Science and Technology(202402AA310027)

Scientific Research Fund Project of the Department of Education of Yunnan Province(2025Y0598)

Copyright

© 2026 Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences
Fold

摘要

以β-丙氨酸乙酯盐酸盐和丙二酸单乙酯酰氯为原料合成2,4-二酮内酰胺衍生物, 获得25个2,4-二酮内酰胺衍生物t1~t25, 并评估其对主要蛋白酶(Mpro)的抑制活性. 化合物t5, t9和t18有较高的抑制率, 进一步对上述3个化合物梯度浓度抑制Mpro活性测试, 得到IC50分别为0.445, 0.425, 0.088 μmol/L, 阳性对照奈玛特韦为0.426 μmol/L, 抑制活性显示t5, t9的IC50与奈玛特韦相当, t18的IC50更低, 分子对接揭示t5作用于His41关键氨基酸, t9, t18与Mpro靶蛋白活性位点的关键氨基酸Cys145/His41共同作用. 此研究表明2,4-二酮内酰胺片段可成为抑制Mpro靶点的分子砌块, 上述3个化合物对冠状病毒Mpro具有较强抑制作用，可作为开发抗冠状病毒药物潜力化合物, 并为进一步药效学评价提供物质基础.

关键词： 冠状病毒; 2,4-二酮内酰胺衍生物; 主要蛋白酶(Mpro); 抑制剂

本文引用格式

敖选丽 , 马超洁 , 王淑冰 , 何蕾 , 赏宇 , 朱锦阳 , 李建秀 , 张琴 , 张荣平 , 侯博 . 2,4-二酮内酰胺衍生物的设计、合成及其抑制Mpro活性筛选[J]. 有机化学, 2026 , 46(8) : 3104 -3113 . DOI: 10.6023/cjoc202601032

Abstract

Twenty-five 2,4-diketolactam derivatives t1~t25 were synthesized using β-alanine ethyl ester hydrochloride and monoethyl malonyl chloride as initial materials. The inhibitory activities of these compounds against the main protease (Mpro) were tested. The experimental results showed that t5, t9, and t18 exhibited relatively high Mpro inhibitory rates. Further gradient concentration assays of three compounds were conducted to evaluate the Mpro inhibitory activities. Their half-maximal inhibitory concentrations (IC50) against Mpro were 0.445, 0.425, and 0.088 μmol/L, respectively, whereas the IC50 value of nirmatrelvir was 0.426 μmol/L. The inhibitory activity showed that the IC50 values of t5 and t9 were comparable to those of nirmatrelvir, while the IC50 value of t18 was lower. Molecular docking revealed that t5 interacted with the key residue His41, while t9 and t18 interacted with both Cys145 and His41 in the active site of Mpro. This study demonstrates that the 2,4-diketolactam moiety can serve as a privileged building block for targeting the Mpro. The above three compounds exhibit potent inhibitory activity against coronavirus Mpro and represent promising candidates for the development of anti-coro- navirus agents, providing a material basis for further pharmacodynamic evaluations.

Key words： coronavirus; 2,4-diketolactam derivatives; main protease (Mpro); enzyme inhibitors

冠状病毒(CoV)侵袭一直是困扰公共健康的一大难题, 其主要以呼吸综合征为主, 严重的情况下会导致死亡, 对社会经济造成负担[1]. 距1960年冠状病毒被发 现[2]后, 2003年爆发的严重急性呼吸综合征(SARS)[3], 2012年在沙特阿拉伯爆发的中东呼吸综合征[4]以及2019年爆发的严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2 (SARS-CoV-2)[5]均是属于冠状病毒, 其中SARS-CoV-2有着发病快、死亡率高和经济损失大等特点[6-7]. 近年来, 冠状病毒周期性传播对其进行新型靶点抑制剂研究开发势在必行.
冠状病毒是一种有包膜的单股正链核糖核酸(RNA)病毒, 分为α、β、γ、δ四个属[8]. 其膜上主要存在核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, N)、刺突蛋白(spike protein, S)、包膜蛋白(envelope protein, E)和膜蛋白(membrane protein, M)等[9]. 这四种结构蛋白是SARS-CoV-2入侵宿主细胞的关键. 2020年对SARS-CoV-2的序列分析表明, 该病毒属于β-CoVs类别[10,11]. SARS-CoV-2病毒复制周期包括侵入、转录、复制、组装和分泌五个过程[12]. S蛋白主要负责附着在宿主细胞上, M蛋白负责塑造病毒粒子, 促进膜曲率, 并与核衣壳蛋白结合. E蛋白负责组装和释放病毒, N蛋白通过不同的机制结合病毒RNA基因组, 形成核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)复合物, 将封装的基因组组装成病毒粒子[13-17]. 抑制上述四种结构蛋白或对其介导的病毒入侵过程进行阻断都能达到抗冠状病毒的效果. 其中, 木瓜样蛋白酶(PLpro)和冠状病毒主要蛋白酶(Mpro)是病毒复制过程中肽链加工必不可少的两种酶[18]. 与PLpro相比, Mpro有更多的切割位点, 可以裂解病毒多蛋白, 对病毒的复制至关重 要[19]. 因此, Mpro一直是近几年开发新型抗冠状病毒药物的热门靶点.
主要蛋白酶是寻找抗SARS-CoV-2病毒的良好靶点之一. Mpro是一个二聚体, 由3个结构域组成[20-22]. 其活性口袋位于I和II结构域间隙, 活性口袋包含催化二联体(Cys145-His41)和4个亚口袋(S1~S4), 其中的Cys145和His41催化二联体能特异性识别和切割非结构蛋白nsp4~nsp16的11个位点, 并且裂解多蛋白, 在SARS-CoV-2基因复制和蛋白合成中起关键作用[23]. 虽然冠状病毒家族变异性强[24], 但Mpro在不同毒株中表现出高度的序列和结构同源性. 因此, 针对Mpro开发冠状病毒抑制剂新颖且可行. 国内现已获批8款新型冠状病毒感染口服抗病毒药物, 分别为Paxlovid(奈玛特 韦/利托那韦复方)、阿兹夫定(Azvudine)、莫诺拉韦(Molnupiravir)、先诺欣(先诺特韦/利托那韦复方)、来瑞特韦、泰中定(阿泰特韦)、奥格特韦钠和民得维(氢溴酸氘瑞米德韦). 近几年, 天然黄酮类产物作为抗冠状病毒候选药物的研究有很大的进展. 例如, 黄芩素[25]、杨梅素[26]、槲皮素[27]、柚皮素等都有望成为SARS-CoV-2 Mpro的潜在抑制剂[28]. Ma等[29]保留杨梅素邻苯三酚药效基团, 在其基础上进行衍生化合成一系列化合物, 并筛选出活性与天然产物黄芩素相当的化合物. 现开发的肽、拟肽和非肽Mpro抑制剂大多数都具有旨在反应并共价结合Cys145的亲核基团, 如醛、酮酰胺、Michael受体等[30]. 亲电性较低的酮脱靶效应和不良毒性可能会更低, 所以已被探索为Mpro抑制剂的“弹头”组[31]. 从植物药分离得到含二酮类结构化合物在抗SARS- CoV-2表现出优异活性[32-33], 因此二酮类结构可能是一个开发的创新点. 在冠状病毒抑制剂候选药物设计中, 含硫、含氮、含氟片段常被作为靶向Mpro各个活性口袋引入. 硫原子主要靶向S2疏水口袋和S1'口袋的Cys145. 不仅可以作为亲核中心与病毒酶半胱氨酸形成二硫键/硫醚键, 不可逆阻断催化功能, 还能与病毒蛋白中Zn2+、Fe2+配位, 破坏蛋白构象与功能[34]. 氮原子以S1口袋为核心靶点, 能提升化合物与靶蛋白之间的亲和力, 增加化合物-靶点结合稳定性[35]. 氟原子以S4口袋为主要作用位点, 高电负性能增强分子-靶点相互作用, 其立体效应固定分子优势构象, 提高靶点结合特异 性[36]. 因此, 本研究在2,4-二酮内酰胺骨架上引入含氟、含氮和含硫化合物, 以期获得抗冠状病毒活性更高的潜力分子.

1 结果

1.1 2,4-二酮内酰胺(a3)及其衍生物的合成

2,4-二酮内酰胺(a3)的合成路线如Scheme 1所示. N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)作为催化剂, β-丙氨酸乙酯盐酸盐和丙二酸单乙酯酰氯反应生成化合物a1, a1用甲苯溶解, 加入28%的甲醇钠, 升温回流反应制备中间体a2, a2用体积分数1%的乙腈-水溶解, 回流, 得产物a3.
图式1 化合物a1~a3合成路线

Scheme 1 Synthetic routes of compounds a1~a3

2,4-二酮内酰胺衍生物(t1~25)的合成路线如Scheme 2所示, 以二氯甲烷(DCM)为溶剂、脯氨酸为催化剂、Hantzsch酯为还原剂, 2,4-二酮内酰胺和醛类化合物经一锅法还原反应得到25个衍生物, 所得化合物见表1. 所有目标化合物的结构均经1H NMR、13C NMR以及HRMS进行表征.
图式2 化合物t1~t25通用合成路线(R为醛基分子砌块)

Scheme 2 General synthetic route of compounds t1~t25 (R=aldehyde building block)

表1 化合物t1～t25的结构

Table 1 Structures of compounds t1～t25

1.2 2,4-二酮内酰胺衍生物抑制Mpro蛋白酶活性

采用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)测定了抑酶活性以及抑制率较高的化合物的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50). 化合物t1~t25抑制Mpro活性结果见图1. 经初步筛选, 以奈玛特韦为阳性对照, 筛选抑制率>40%的化合物开展梯度浓度定量活性测定. 测试的系列化合物对Mpro的抑制活性呈现出明显差异. 其中, 化合物t5、t9和t18表现出优异的抑制活性, IC50值分别为0.445, 0.425, 0.088 μmol/L, 奈玛特韦IC50为0.426 μmol/L(图2). 结果表明这三个化合物能够以较低的浓度有效抑制Mpro的活性, 优异的Mpro靶向抑制潜力. 其余测试化合物的IC50值相对较大, 抑制效果不佳. 因此化合物t5、t9和t18有可能成为抑制Mpro靶标分子.
图1 化合物t1~t25对Mpro抑制率(阳性对照为黄芩素和奈玛特韦)

Figure 1 Inhibitory rates of compounds t1~t25 against Mpro (baicalein and nirmatrelvir as positive controls)

图2 化合物t5, t9, t18, Nirmatrelvir对Mpro抑制曲线(n=6)

Figure 2 Inhibition curves of compounds t5, t9, t18 and nirmatrelvir against Mpro (n=6)

1.3 部分2,4-二酮内酰胺衍生物的分子对接

化合物t5, t9和t18作用于病毒Mpro靶标蛋白, 采用分子对接软件将化合物与靶点Mpro (PDB: 6m2n)进行对接, 观察是否可能形成共价键结合(图3). 结果显示, 三个化合物均与Mpro蛋白的多个氨基酸形成烷基疏水作用、π-烷基作用、π-σ作用、范德华力及氢键等非共价相互作用. 化合物t5, t18及阳性对照奈玛特韦与 Mpro 蛋白作用的相同氨基酸有Gly143、Leu141和Glu166. 值得注意的是化合物t9作用于Mpro活性口袋的Cys145关键氨基酸, 化合物t18作用于Cys145和His41两个关键氨基酸, 化合物t5作用于His41关键氨基酸. 此外, 化合物t5与氨基酸His164、Gly143, 化合物t9与氨基酸Ser144、Gly143形成氢键作用. 化合物t5与氨基酸Met49、Met165, 化合物t18与氨基酸Met49、Leu27形成烷基、Pi-烷基相互作用. 从化合物作用于Mpro关键氨基酸的情况来看, 三个化合物均作用于Mpro的结构域I和结构域II. 而Mpro的活性口袋也是位于上述的两个结构域. 进一步说明, 化合物t5, t9, t18可对Mpro活性位点产生抑制作用.
图3 化合物t5 (A), t9 (B), t18 (C)和Nirmatrelvir (D)与Mpro分子的对接结果

Figure 3 Molecular docking diagrams of compounds t5 (A), t9 (B), t18 (C), and nirmatrelvir (D) with Mpro, respectively

2 结论

本研究基于2,4-二酮内酰胺母核具备Mpro抑制活性的前期基础, 以β-氨基丙酸乙酯盐酸盐和丙二酸单乙酯酰氯为原料, 通过酯化、环合及还原等反应合成了25个2,4-二酮内酰胺衍生物. 在母核上引入氮、硫和氟杂原子片段, 以期提升Mpro抑制活性. 其中化合物t5, t9, t18表现出良好的抑制Mpro活性, 与阳性对照奈玛特韦
相当. 分子对接结果显示, 化合物t5, t9, t18均可与氨基酸Cys145或His41作用来抑制Mpro活性, 继而发挥良好抗冠状病毒活性. 该研究结果显示, t5, t9均含氮杂环结构, 其抑制活性与奈玛特韦持平或更低, t18抑制活性最优. 本研究拓展了2,4-二酮内酰胺类化合物的结构类型, 为新型抗冠状病毒Mpro抑制剂的开发提供优质先导骨架.

3 讨论

通过构效关系分析可以看出, 化合物t2的Mpro抑制活性强于t21, 这可能归因于三氟甲基是强吸电子基团, 处于对位时能降低整个化合物电子云密度, 从而增强化合物与靶点的相互作用. 其次, 由于Mpro的活性位点含有疏水口袋, 三氟甲基处于对位增加了整个分子的刚性和疏水性, 提升配体与活性口袋的结合亲和力. 对比t23、t24可见, 苯环引入N、Cl杂原子可有效提升Mpro抑制活性. 化合物t5, t9对Mpro抑制作用与奈玛特韦相当或更低, 可能是由于化合物本身是酰胺作为基本骨架, 同时引入氮杂环, 氮原子与活性中心的His41形成氢键, 同时孤对电子与Cys145发生亲核作用, 抑制酶的催化活性. 对比含有氮杂环的化合物t5, t9, 分子对接显示, 两个化合物均能稳定结合于Mpro催化口袋, 化合物t5与Gly143、Glu166、Leu141等氨基酸形成氢键及疏水堆积, 而化合物t9则与Ser144、Gly143、Thr26氨基酸形成更广泛的氢键网络, 其结构中其结构中氮杂环作用于Cys145让整个分子更贴近催化活性中心, 甲基能限制化合物构象旋转, 增强结合稳定性, 展现出更强的Mpro抑制活性. 化合物t18抑制Mpro活性在三个化合物中最强, 可能与其结构含酯基、氯原子等有关. 苯环及乙基链增强疏水作用使t18与活性位点的疏水区域氨基酸侧链结合更紧密. 结合分子对接来看, 酯基与催化半胱氨酸Cys145发生相互作用, 氯代苯环部分靠近催化氨基酸His41形成π-π堆积, 因此极大地增加了t18对Mpro的抑制活性. 综上, 引入含杂原子官能团和保持整个分子的刚性, 有利于提高此类化合物对Mpro抑制活性, 此结论为后续结构优化提供新的指导策略.

4 实验部分

4.1 仪器与试剂

1H NMR及13C NMR使用Bruker Avance III 400 MHz核磁共振仪测定; 高分辨质谱由安捷伦技术有限公司四极杆串联飞行时间质谱仪(Agilent 6545 LC/Q-TOF)测定; 200~300目硅胶采购于青岛海洋化工厂有限公司; 实验中反应或柱层析所用试剂均经干燥除水蒸馏处理, 为分析纯或化学纯试剂; 黑色透明底96孔细胞培养板; MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2冠状病毒主蛋白酶荧光底物(P9731-25 mg); Tris (Electrophoresis Grade) (ST760-500 g)均采购自碧云天生物技术有限公司; SARS-CoV-2 (2019-nCoV) 3CLpro/3C-like protease-His & AVI Recombinant Protein (40594-V56E-100 μg)采购自Sino Biological生物技术公司; 荧光强度由安捷伦技术有限公司的多功能微孔板检测仪(Synergy H1)测定.

4.2 实验方法

4.2.1 化合物a1~a3的合成

合成路线见Scheme 1[37-38]. 在100 mL的反应瓶里加入β-丙氨酸乙酯盐酸盐(500 mg), 用8 mL DCM溶解, 加入DIPEA (2 equiv., 1.13 mL), 反应5 min后, 将反应置于冰浴上, 缓慢向其滴加丙二酸单乙酯酰氯(1 equiv., 418 μL), 反应5 min, 将反应置于常温反应2 h得淡黄色油状物a1 (636 mg), 收率87%.
将化合物a1 (155 mg), 用甲苯(2.4 mL)溶解, 加入28%的甲醇钠溶液(3 equiv., 493 μL), 将反应置于油浴锅上, 在100 ℃下反应7 h后撤去油浴, 冷却至室温, 向反应中加入水, 边加水边强力搅拌, 体系析出乳白色混悬液, 分离甲苯层, 水层先用浓盐酸将pH调至酸性, 再用二氯甲烷和甲醇的混合液萃取[V(DCM)∶V(Me- OH)=4∶1], 萃取3次, 合并全部有机相, 有机层用饱和NaCl溶液洗涤, 无水硫酸钠干燥, 有机层浓缩后柱层析[V(DCM)∶V(MeOH)=20∶1]纯化, 得到白色固体a2 (81 mg), 收率27%.
将化合物a2 (47 mg)用1%乙腈水溶解, 置于80 ℃油浴锅上回流反应4 h, 得产物a3 (22 mg), 收率71%.

4.2.2 化合物t1~t25的合成

用DCM溶解化合物a3, 脯氨酸(0.2 equiv.), 搅拌15 min后加入带醛化合物(1 equiv.)和Hantzsch ester (1.1 equiv.), 反应体系在室温搅拌12~18 h, 减压旋除溶剂, 粗品经硅胶柱层析纯化得到目标衍生物t1~t25, 反应收率32%~73%.

4.3 合成化合物的表征

乙基3-((3-乙氧基-3-氧代丙基)氨基)-3-氧代丙酸酯(a1): 636 mg, 收率87%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.85~3.73 (m, 4H), 3.16 (q, J=6.2 Hz, 2H), 2.95 (d, J=22.6 Hz, 2H), 2.17 (t, J=6.3 Hz, 2H), 0.91~0.85 (m, 6H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ: 172.16, 168.93, 165.54, 61.42, 60.66, 41.28, 34.98, 33.80, 14.03. HRMS (ESI) calcd for C10H17O5NNa [M＋Na]＋ 254.0999, found 254.1008.
2,4-二氧代哌啶-3-羧酸甲酯(a2): 81 mg, 收率27%. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 4.83 (s, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.40 (t, J=7.0 Hz, 2H), 2.63 (t, J=7.0 Hz, 2H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ: 201.33, 186.42, 171.67, 61.01, 51.11, 36.28, 30.79. HRMS (ESI) calcd for C7H9O4NNa [M＋Na]＋ 194.0424, found 194.0427.
2,4-哌啶二酮(a3): 白色粉末, 22 mg, 收率71%. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.08 (s, 1H), 3.37 (td, J=6.1, 3.5 Hz, 2H), 3.23 (s, 2H), 2.45 (t, J=6.1 Hz, 2H); 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ: 205.88, 168.74, 49.76, 38.35, 36.52. HRMS (ESI) calcd for C5H7O2NK [M＋K]＋ 152.0710, found 152.0705.
3-(4-氯-3-硝基苄基)哌啶-2,4-二酮(t1): 透明油状物, 49 mg, 收率32%. 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ: 8.50~7.80 (m, 4H), 4.57~4.41 (m, 1H), 4.21~4.17 (m, 1H), 3.95~3.88 (m, 1H), 3.84~3.68 (m, 2H), 3.16~2.88 (m, 2H); 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ: 204.16, 168.87, 142.31, 134.92, 133.91, 130.96, 126.25, 125.26, 58.83, 37.69, 35.33, 27.71. HRMS (ESI) calcd for C12H12O4N2Cl [M＋H]＋ 283.0456, found 283.0453.
3-(4-三氟甲基苄基)哌啶-2,4-二酮(t2): 透明油状物, 39 mg, 收率44%. 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ: 7.64~7.23 (m, 5H), 3.97~3.89 (m, 1H), 3.84~3.70 (m, 1H), 3.52~3.31 (m, 1H), 3.31~3.17 (m, 2H), 2.74~2.45 (m, 2H); 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ: 204.27, 168.95, 145.87, 131.12, 130.04, 129.23, 127.34, 126.07, 123.38, 105.72, 59.09, 37.83, 35.43. HRMS (ESI) calcd for C13H13O2NF3 [M＋H]＋ 272.0891, found 272.0897.
3-(3,4-二氯苄基)哌啶-2,4-二酮(t3): 透明油状物, 32 mg, 收率59%. 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ: 7.61~7.18 (m, 4H), 3.89 (t, J=5.7 Hz, 1H), 3.81~3.57 (m, 1H), 3.49~3.31 (m, 1H), 3.15 (dd, J=5.6, 1.9 Hz, 2H), 2.70~2.41 (m, 2H); 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ: 205.07, 169.81, 142.93, 132.30, 131.40, 130.80, 130.50, 129.70, 59.88, 38.62, 36.27, 28.51. HRMS (ESI) calcd for C12H12- O2NCl2 [M＋H]＋ 272.0227, found 272.0221.
3-(4-氟苄基)哌啶-2,4-二酮(t4): 透明油状物, 47 mg, 收率41%. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.39~6.63 (m, 5H), 3.60 (s, 2H), 3.55~3.32 (m, 2H), 3.19 (dd, J=14.3, 3.9 Hz, 1H), 2.63~2.50 (m, 2H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ: 205.27, 171.34, 164.28, 161.65, 144.71, 129.54, 129.46, 129.09, 129.00, 124.79, 123.93, 115.80, 115.59, 114.71, 114.50, 112.66, 112.45, 111.68, 111.47, 104.93, 37.36, 35.33, 29.33, 27.46. HRMS (ESI) calcd for C12H13O2NF [M＋H]＋ 222.0925, found 222.0919.
3-[(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)甲基]哌啶-2,4-二酮(t5): 透明油状物, 42 mg, 收率39%. 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ: 8.14 (ddd, J=9.4, 4.8, 1.4 Hz, 4H), 7.89~7.79 (m, 1H), 7.09~6.95 (m, 1H), 6.27~6.13 (m, 1H), 3.90~3.78 (m, 1H), 3.53~3.59 (m, 1H), 3.45~3.25 (m, 2H), 2.76~2.51 (m, 2H); 13C NMR (101 MHz, Acetone- d6) δ: 204.09, 161.91, 141.45, 139.17, 127.14, 121.12, 115.46, 98.28, 97.01, 37.52, 35.42, 27.01, 21.44. HRMS (ESI) calcd for C13H14O2N3 [M＋H]＋ 244.1081, found 244.1084.
3-((1-苯基吡唑-3-基)甲基)哌啶-2,4-二酮(t6): 透明油状物, 61 mg, 收率52%. 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ: 8.18~8.14 (m, 1H), 7.84~7.72 (m, 2H), 7.57~7.41 (m, 2H), 7.33~7.18 (m, 1H), 6.37 (d, J=2.5 Hz, 1H), 3.95~3.87 (m, 1H), 3.80~3.51 (m, 2H), 3.38~3.25 (m, 2H), 2.77~2.51 (m, 2H); 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ: 203.90, 154.63, 150.73, 138.99, 127.81, 126.76, 124.39, 117.30, 105.36, 36.45, 34.28, 21.53, 19.80. HRMS (ESI) calcd for C15H16O2N3 [M＋H]＋ 270.1237, found 270.1235.
3-((1H-吲唑-3-基)甲基)哌啶-2,4-二酮(t7): 透明油状物, 68 mg, 收率62%. 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ: 7.61 (dt, J=8.1, 0.9 Hz, 1H), 7.09 (dt, J=6.9, 1.0 Hz, 1H), 6.99 (dd, J=8.1, 6.9 Hz, 1H), 4.06~3.98 (m, 1H), 3.76~3.68 (m, 1H), 3.62~3.49 (m, 2H), 2.72~2.50 (m, 2H), 2.49 (d, J=0.8 Hz, 2H), 2.09 (s, 1H); 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ: 204.45, 169.84, 143.86, 141.56, 125.99, 122.25, 120.14, 119.52, 109.81, 55.64, 38.01, 35.77, 20.76. HRMS (ESI) calcd for C13H14O2N3 [M＋H]＋ 244.1086, found 244.1083.
3-(4-氯-3-氰基苄基)哌啶-2,4-二酮(t8): 淡黄色油状物, 37 mg, 收率31%. 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ: 7.74~7.29 (m, 4H), 3.86 (t, J=5.8 Hz, 1H), 3.67~3.57 (m, 1H), 3.39~3.29 (m, 1H), 3.21 (td, J=7.1, 2.5 Hz, 2H), 2.56~2.30 (m, 2H); 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ: 205.15, 169.88, 143.24, 134.26, 133.45, 129.65, 129.47, 126.84, 123.40, 60.08, 38.68, 36.29, 29.19. HRMS (ESI) calcd for C13H12O2N2Cl [M＋H]＋ 263.0582, found 263.0590.
3-[(7-甲基-2H-吲唑-3-基)甲基]哌啶-2,4-二酮(t9): 透明油状物, 59 mg, 收率71%. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 8.90 (d, J=8.0 Hz, 1H), 8.38 (dt, J=6.9, 1.1 Hz, 1H), 8.28 (dd, J=8.1, 6.9 Hz, 1H), 5.30 (dq, J=5.1, 2.8 Hz, 1H), 5.08~4.96 (m, 1H), 4.92~4.74 (m, 2H), 4.59 (s, 1H), 4.05~3.68 (m, 5H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ: 205.64, 170.98, 127.17, 123.23, 121.18, 118.82, 97.46, 56.80, 39.30, 36.91, 22.17, 17.32. HRMS (ESI) calcd for C14H16O2N3 [M＋H]＋ 258.1049, found 258.1056.
3-(5-氟-2-硝基苄基)哌啶-2,4-二酮(t10): 透明油状物, 71 mg, 收率60%. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 8.02~7.86 (m, 1H), 7.14~6.95 (m, 2H), 3.89 (s, 2H), 3.41~3.35 (m, 2H), 2.93 (d, J=53.0 Hz, 2H), 2.51 (d, J=7.1 Hz, 1H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ: 172.33, 171.42, 165.96, 163.45, 146.04, 141.24, 126.72, 116.22, 112.69, 100.25, 37.69, 35.59, 29.64, 25.12. HRMS (ESI) calcd for C12H12O4N2F [M＋H]＋ 267.0776, found 267.0778.
3-(吡唑并[1,5-a]吡啶-7-基)甲基)哌啶-2,4-二酮(t11): 淡黄色油状物, 31 mg, 收率48%. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 8.54 (s, 1H), 8.00 (d, J=2.5 Hz, 1H), 7.55 (dd, J=8.8, 1.4 Hz, 1H), 7.19 (dd, J=8.8, 6.9 Hz, 1H), 6.86 (dd, J=7.0, 1.4 Hz, 1H), 6.64 (d, J=2.5 Hz, 1H), 4.06 (s, 2H), 3.51 (d, J=114.1 Hz, 1H), 3.34 (d, J=7.2 Hz, 2H), 2.51 (t, J=7.3 Hz, 2H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ: 171.12, 168.82, 167.29, 140.77, 139.82, 124.38, 115.53, 111.44, 101.02, 97.14, 37.42, 28.17, 24.74. HRMS (ESI) calcd for C13H14O2N3 [M＋H]＋ 244.1081, found 244.1082.
3-(4-氟-3-硝基苄基)哌啶-2,4-二酮(t12): 透明油状物, 51 mg, 收率36%. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 8.08 (d, J=2.4 Hz, 1H), 8.05~7.91 (m, 1H), 7.63~7.57 (m, 1H), 7.32~7.20 (m, 1H), 3.64 (d, J=4.4 Hz, 2H), 3.35 (dt, J=7.3, 3.4 Hz, 2H), 3.24 (s, 1H), 2.67~2.39 (m, 2H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ: 171.11, 164.82, 163.22, 154.69, 152.11, 139.49, 136.69, 135.54, 126.33, 125.12, 117.36, 104.36, 37.35, 35.34, 27.61, 26.90. HRMS (ESI) calcd for C12H12O4N2F [M＋H]＋ 267.0776, found 267.0777.
3-[4-三唑-1-基)苄基]哌啶-2,4-二酮(t13): 透明油状物, 53 mg, 收率73%. 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ: 8.77 (d, J=78.6 Hz, 1H), 8.17 (d, J=72.8 Hz, 1H), 7.77~7.27 (m, 4H), 3.98~3.70 (m, 1H), 3.63~3.35 (m, 2H), 3.29 (d, J=31.8 Hz, 1H), 3.07 (d, J=5.9 Hz, 1H), 2.67~2.43 (m, 2H); 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ: 203.95, 168.75, 151.91, 145.00, 136.86, 131.11, 129.55, 129.29, 126.85, 126.56, 59.11, 37.96, 35.42, 23.51. HRMS (ESI) calcd for C14H15O2N4 [M＋H]＋ 271.1190, found 271.1188.
3-[(5-氯-1-甲基-3-苯基-吡唑-4-基)甲基]哌啶-2,4-二酮(t14): 透明油状物, 51 mg, 收率45%. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.62~7.52 (m, 2H), 7.47~7.29 (m, 4H), 3.83 (d, J=15.2 Hz, 3H), 3.56 (s, 1H), 3.37~3.32 (m, 1H), 3.27~3.10 (m, 1H), 2.93 (s, 2H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ: 206.20, 173.28, 151.25, 129.57, 129.29, 129.07, 128.95, 128.75, 115.97, 102.98, 38.40, 36.67, 36.20, 20.29, 18.62. HRMS (ESI) calcd for C16H17O2N3Cl [M＋H]＋ 318.1004, found 318.1004.
3-(5-三氟甲基-3-氰基苄基)哌啶-2,4-二酮(t15): 棕色油状物, 47 mg, 收率41%. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.79~7.32 (m, 4H), 3.61 (s, 2H), 3.37~3.33 (m, 2H), 3.21 (s, 1H), 2.54 (t, J=7.2 Hz, 2H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ: 204.43, 172.58, 166.84, 143.92, 135.94, 135.11, 130.62, 117.15, 113.39, 105.30, 93.42, 38.74, 29.19, 28.38. HRMS (ESI) calcd for C14H12O2N2F3 [M＋H]＋ 297.0845, found 297.0836.
3-[(1-甲基-苯并[d]咪唑-2-基)甲基]哌啶-2,4-二酮(t16): 淡棕色油状物, 38 mg, 收率33%. 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ: 7.26 (d, J=9.0 Hz, 1H), 7.09~6.98 (m, 2H), 6.57 (d, J=6.8 Hz, 1H), 4.24 (s, 2H), 3.41 (t, J=7.1 Hz, 2H), 3.02 (s, 3H), 2.47 (t, J=7.2 Hz, 2H), 1.59 (d, J=242.3 Hz, 1H); 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ: 208.83, 178.42, 148.20, 138.94, 131.54, 125.55, 115.44, 114.12, 53.06, 39.64, 33.32, 22.79, 21.08. HRMS (ESI) calcd for C14H16O2N3 [M＋H]＋ 258.1237, found 258.1236.
3-[(5-氯苯并[b]噻吩-2-基)甲基]哌啶-2,4-二酮(t17): 透明油状物, 28 mg, 收率35%. 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ: 9.15~8.82 (m, 2H), 8.75~8.26 (m, 2H), 5.22~4.97 (m, 2H), 4.78~4.55 (m, 3H), 4.02~3.70 (m, 2H); 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ: 205.17, 169.83, 153.48, 148.14, 142.70, 131.05, 124.91, 124.64, 123.43, 123.14, 60.09, 39.14, 36.73, 25.21. HRMS (ESI) calcd for C14H13O2NSCl [M＋H]＋ 294.0350, found 294.0348.
乙基2-氯-4-[(2,4-二氧代哌啶-3-基)甲基]苯甲酸酯(t18): 棕色油状物, 47 mg, 收率41%. 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ: 7.87~7.33 (m, 3H), 4.38~4.28 (m, 2H), 3.95~3.90 (m, 1H), 3.78~3.70 (m, 1H), 3.53~3.48 (m, 1H), 3.46~3.30 (m, 2H), 2.65~2.44 (m, 2H), 1.35 (t, J=7.1 Hz, 3H); 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ: 204.09, 168.96, 166.06, 140.79, 134.57, 132.47, 131.19, 130.99, 129.52, 61.08, 59.72, 37.62, 35.46, 26.53, 13.58. HRMS (ESI) calcd for C15H17NO4Cl [M＋H]＋ 310.0841, found 310.0836.
乙基5-氯-2-[(2,4-二氧代哌啶-3-基)甲基]苯甲酸酯(t19): 淡黄色油状物, 54 mg, 收率47%. 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ: 8.17 (d, J=2.3 Hz, 1H), 7.98~7.75 (m, 3H), 4.83~4.75 (m, 2H), 4.33 (td, J=5.6, 1.6 Hz, 1H), 4.26~4.13 (m, 1H), 3.93~3.83 (m, 1H), 3.81~3.54 (m, 2H), 3.14~2.87 (m, 2H), 1.80 (t, J=7.1 Hz, 3H); 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ: 204.31, 169.17, 165.45, 140.29, 133.76, 132.90, 131.86, 131.06, 130.25, 61.14, 59.10, 37.80, 35.47, 27.79, 13.67. HRMS (ESI) calcd for C15H17O4NCl [M＋H]＋ 310.0841, found 310.0841.
3-[(2-氟苯基)甲基]哌啶-2,4-二酮(t20): 棕黄色油状物, 17 mg, 收率22%. 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ: 7.44~7.36 (m, 1H), 7.22~7.17 (m, 1H), 7.09~6.96 (m, 2H), 3.89~3.64 (m, 2H), 3.53~3.36 (m, 1H), 3.27~3.12 (m, 2H), 2.69~2.46 (m, 2H); 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ: 204.11, 162.31, 159.89, 131.77, 127.75, 127.67, 123.81, 114.62, 58.10, 37.61, 35.31, 21.60. HRMS (ESI) calcd for C12H13O2NF [M＋H]＋ 222.0925, found 222.0925.
3-[3-(三氟甲基)苄基]哌啶-2,4-二酮(t21): 淡黄色油状物, 22 mg, 收率18%. 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ: 7.69~7.31 (m, 5H), 3.91 (t, J=5.6 Hz, 1H), 3.81~3.69 (m, 1H), 3.49~3.32 (m, 1H), 3.31~3.18 (m, 2H), 2.69~2.41 (m, 2H); 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ: 206.17, 205.15, 169.88, 143.24, 134.26, 133.45, 129.65, 129.47, 126.84, 123.40, 60.08, 38.68, 36.29, 29.19. HRMS (ESI) calcd for C13H13O2NF3 [M＋H]＋ 272.0893, found 272.0899.
甲基3-氯-5-[(2,4-二氧代哌啶-3-基)甲基]苯甲酸酯(t22): 淡棕色油状物, 37 mg, 收率47%. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.88~7.46 (m, 4H), 3.91~3.85 (m, 4H), 3.64 (s, 2H), 3.34 (d, J=7.0 Hz, 2H), 2.49 (t, J=7.2 Hz, 2H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ: 172.38, 166.24, 145.80, 133.52, 132.75, 131.23, 129.49, 127.73, 125.79, 51.40, 37.73, 35.00, 29.46, 27.65. HRMS (ESI) calcd for C14H15O4NCl [M＋H]＋ 296.0611, found 296.0613.
3-(3-甲氧基苄基)哌啶-2,4-二酮(t23): 透明油状物, 31 mg, 收率30%. 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ: 7.94 (s, 1H), 7.57 (q, J=7.4, 6.9 Hz, 1H), 7.40~7.05 (m, 3H), 4.27~4.02 (m, 5H), 3.82~3.76 (m, 1H), 3.72~3.53 (m, 2H), 3.15~2.77 (m, 2H); 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ: 204.63, 169.66, 159.67, 142.25, 129.01, 121.47, 115.00, 111.23, 59.24, 54.47, 37.96, 35.47, 28.95. HRMS (ESI) calcd for C13H16O3N [M＋H]＋ 234.1125, found 234.1121.
3-[(6-甲氧基吡啶-3-基)甲基]哌啶-2,4-二酮(t24): 淡黄色油状物, 27 mg, 收率26%. 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ: 7.52 (dd, J=8.2, 7.3 Hz, 1H), 6.90~6.84 (m, 1H), 6.50 (dt, J=8.1, 0.7 Hz, 1H), 4.10 (t, J=5.3 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.97~3.71 (m, 1H), 3.56~3.49 (m, 1H), 3.38~3.25 (m, 2H), 2.70~2.43 (m, 2H), 2.91 (t, J=7.0 Hz, 1H); 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ: 204.52, 157.49, 138.73, 115.92, 107.09, 55.72, 53.20, 52.49, 37.79, 35.76, 31.02, 30.54. HRMS (ESI) calcd for C12H15O3N2 [M＋H]＋ 235.1077, found 235.1080.
3-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]哌啶-2,4-二酮(t25): 棕色油状物, 32 mg, 收率33%. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.14 (dd, J=58.6, 4.7 Hz, 2H), 7.59 (q, J=7.6, 6.1 Hz, 1H), 7.25 (dt, J=8.7, 4.5 Hz, 1H), 4.02 (t, J=5.0 Hz, 1H), 3.63~3.52 (m, 1H), 3.39 (q, J=7.6, 6.3 Hz, 2H), 3.19 (d, J=7.6 Hz, 1H), 2.66~2.55 (m, 2H); 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ: 206.11, 170.15, 156.39, 147.05, 144.57, 123.23, 122.75, 53.65, 38.25, 35.87, 25.45. HRMS (ESI) calcd for C11H12O2N2F [M＋H]＋ 223.0877, found 223.0875.

4.4 分子对接

Mpro蛋白结构来自PDB数据库(PDB ID: 6m2n). 用AutoDockTools-1.5.7软件处理蛋白, 保留一个配体分子及所在的蛋白链, 删除多余蛋白链以及水分子, 保存为PDBQT格式. 配体Open babel GUI进行能量最小化, 保存为PDBQT格式, 设置合适的对接参数(X: －41.43; Y: －18.62; Z: 57.13)后, 采用Vina软件进行分子对接, 根据Vina结合自由能打分, 分析配体与Mpro关键氨基酸的相互作用模式. 使用Pymol软件显示氢键长度及t5, t9, t18与蛋白连接的氨基酸进行可视化处理, 获得分子对接结果.

4.5 酶活实验

使用FRET法检测化合物t5, t9, t18以及奈玛特韦对Mpro的抑制活性. 蛋白(Mpro)浓度: 4 μmol/L, 化合物t1~25初筛浓度均为1 μmol/L, 梯度筛选浓度为: 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 μmol/L. 实验步骤为: (1)在96孔板上分别设置空白组、对照组以及药物组, 每组设置6个复孔; (2)空白组、对照组、药物组每孔分别加入180, 175, 155 μL Tris缓冲溶液(50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.0, 1 mmol/L EDTA); (3)向对照组和药物组每孔加入5 μL Mpro蛋白酶溶液; (4)药物组按不同浓度分别向孔板内加入20 μL化合物, 放入37 ℃培养箱中孵育10 min; (5)空白组、对照组、药物组每孔加入20 μL浓度为20 μmol/L荧光底物, 通过多功能微孔板酶分析仪在激发波长320 nm, 发射波长405 nm下记录荧光强度. IC50采用GraphPad Prism计算.
辅助材料(Supporting Information) 化合物t5, t9与t18的核磁谱图以及纯度检测结果. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.
(Lu, Y.)

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