在过去的几十年里, 因癌症死亡的人数一直呈上升趋势[1]. 从1990年到2025年, 所有癌症的总发病率增加了128.9%, 总死亡率增加了74.8%[2]. 目前癌症的治疗方法多样, 手术仍是早期癌症的重要治疗手段, 精准治疗法即靶向治疗可精准锁定癌细胞弱点[3]. 尽管, 抗癌药物的开发和研究取得了诸多的进展, 但目前的抗癌药物会引起一些不良的副作用, 且许多患者对其已产生耐药性, 因此仍需要开发更有效和更安全的抗癌药物[4].
天然产物因其结构多样、毒副作用小及作用靶点多的优势, 已成为抗癌药物研发的重要源泉[5], 目前已有紫杉醇[6-9]、喜树碱等多个源于天然产物的药物用于临床. 四氢-β-咔啉[10-12]是天然产物和药物中的重要结构单元, 也被用于药物开发. 研究显示其具有多种生物活性, 包括抗肿瘤[13]、抗真菌[14]、抗寄生虫、抗缺血、抗炎[15]以及其它活性[16]. 骆驼蓬生物碱[17-19]含有各种咔啉类化合物, 包括去氢骆驼蓬碱[20-22]和大麻酚等.
目前, 现有的研究报道中四氢-β-咔啉生物碱可作用于血管内皮生长因子受体2 (VEGFR-2)[23-25]、细胞周期蛋白依赖性激酶4 (CDK4)[26-27]、组蛋白去乙酰化酶6 (HDAC6)[28]、ATP结合盒亚家族G2蛋白(ABCG2)[29]以及纺锤体驱动蛋白(KSP)[30]等靶点, 表现出抗肿瘤作用. 其中, VEGFR-2是一种酪氨酸激酶受体, 它可以促进肿瘤血管的生成, 已成为抗血管生成治疗的主要靶点. 目前靶向VEGFR-2信号通路的多种治疗药物已成功实现临床转化, 例如阿帕替尼(Apatinib)[31-32]、安罗替尼(Anlotinib)[33]、伏罗尼布(Vorolanib)[34]和呋喹替尼(Fruquintinib)[35](图1). 由于VEGFR-2在肿瘤血管生成中的关键调控作用, 该受体已成为抗肿瘤治疗的重要靶标蛋白分子.
二酮哌嗪类衍生物(DKP)是一类在药物化学中非常重要的化合物[36-38], 它们广泛存在于许多药物分子中, 并且具有多样的生物活性和药理作用. 许多含有DKP支架的天然产物具有抗病毒、抗真菌、抗菌和抗肿瘤[39]等多种药理活性. 二酮哌嗪类衍生物由于其特殊的结构, 可以被修改和优化, 这种特殊结构使药物化学家可以设计和合成一系列具有潜在抗癌活性的化合物[40]. 研究表明, 许多二酮哌嗪类衍生物在临床研究中表现出良好的抗癌性, 能够很好地干扰癌细胞的生长和增殖[41]. 例如, 普那布林(Plinabulin)[42]是一种合成型微管蛋白抑制剂的药物, 主要用于肿瘤的治疗和化疗相关中性微粒细胞减少症(CIN)的预防; 雷托西班(Retosiban)是一种催产素受体拮抗剂[43], 用于孕妇推迟早产的宫缩抑制剂; Epelasiban (GSK557296)是一种具有选择性, 可口服的催产素受体拮抗剂[44], 用于治疗子宫腺肌病; Brevianamide F是一种具有良好抗菌活性的药物[45], 对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌及白色念珠菌等其他细菌有抑制作用(图2).
对于已报道的药物他达拉非(Tadalafil), 它是一种选择性磷酸二酯酶-5 (PDE5)抑制剂[46-47], 其在四氢-β-咔啉的1位引入取代基, 同时在2,5-二酮哌嗪3位N上引入取代基, 具有良好的药物活性. 而四氢-β-咔啉的9位取代基的修饰也能提升其活性, 且2,5-二酮哌嗪是优质药物支架. 基于结构-活性、药物拼合关联的已知规律, 我们提出“在该类化合物中引入不同取代基以及将二者拼合来探究其活性”的设计思路(Scheme 1), 旨在通过多位点修饰开发系列新衍生物, 探索活性优化的可能性. 对合成的衍生物进行抗癌活性评估. 利用分子对接, 揭示该衍生物与血管内皮生长因子受体2 (VEGFR- 2, 常用于抗癌药物靶点)活性位点的结合模式, 明确两者间的相互作用特征(如氢键、疏水作用等), 解释活性差异的分子机制. 同时, 利用分子动力学模拟来评估配体与靶蛋白复合物的稳定性及其相互作用的模式.
1 结果与讨论
1.1 化合物5a~5e和6b~6z的合成
目标化合物5a~5e和6b~6z的合成路线如Scheme 2所示. 化合物1和甲醛经过Pictet-Spengler环化反应, 生成化合物2. 干燥后在无水乙醇、氯化亚砜加热回流条件下发生酯化反应, 生成中间体3. 化合物3在四氢呋喃作溶剂的条件下, 加入氯乙酰氯和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA), 得到化合物4. 然后继续以四氢呋喃作溶剂, 加入DIPEA和不同类型的胺, 生成化合物5a~5e. 化合物5a~5e在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)及氢化钠的条件下, 和不同的溴代化合物或碘代化合物发生烷基化反应, 得到目标化合物6b~6z. 所有目标化合物经1H NMR、13C NMR和HRMS确证结构.
图式2 化合物5a~5e和6b~6z的合成路线Scheme 2 Synthetic route of compounds 5a~5e and 6b~6z Reagents and conditions: (i) H2O, NaOH, HCHO, 120 ℃, reflux, yield 89%; (ii) C2H5OH, SOCl2, 85 ℃, reflux, yield 92%; (iii) THF, C2H2Cl2O, DIPEA, stirred at r.t., yield 96%; (iv) THF, RNH2, DIPEA, stirred at r.t.; (v) DMF, NaH, alkyl halogenide, stirred at 0 ℃~r.t. |
1.2 活性研究部分
采用噻唑蓝(MTT)法测试了30个目标化合物对3种癌细胞系的体外抗肿瘤活性, 包括小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)、人肺腺癌细胞(A-549)和人肺支气管癌细胞(NCI-H1666), 以顺铂组为阳性对照组, 测试了N4-取 代-四氢-β-咔啉并二酮哌嗪化合物5a~5e和N9-取代- N4-取代-四氢-β-咔啉并二酮哌嗪化合物6b~6z的抗肿瘤活性. 结果表明, 在N9位引入对氟苄基和对三氟苄基, 以及在N4位引入对氟苄基, 有利于提高对多种癌细胞系的抑制作用.
如表1所示, 对于LLC细胞, R为对氟苄基时, 表现出的活性优于其它取代基, 其抑制活性顺序为5c> 5a>5b>5d>5e; 对于A549细胞, R为对氟苄时, 表现出的活性优于其它取代基, 其抑制活性顺序为5c>5e>5b>5a>5d; 对于NCI-H1666细胞, R为对氟苄时, 表现出的活性优于其它取代基, 其抑制活性顺序为5d>5c>5e>5b>5a. 结果表明, 当在R位引入对氟苄基时, 较有利于提高对多种肿瘤细胞株的抑制作用, 其影响为对氟苄基>己基>苯乙基>对溴苄基>苄基.
表1 化合物5a~5e对3种癌细胞系的体外抗肿瘤活性Table 1 In vitro anti-tumor activity of compounds 5a~5e against three cancer cell lines |
| Compd. | (IC50±SD)a/(μmol•L－1) | ||
|---|---|---|---|
| LLC | A549 | NCI-H1666 | |
| 5a | >50 | >50 | >50 |
| 5b | >50 | >50 | >50 |
| 5c | 21.5±0.9 | 16.8±0.7 | 21.8±0.8 |
| 5d | >50 | >50 | 15.4±2.3 |
| 5e | >50 | 24.7±1.1 | 32.3±1.3 |
| Cisplatin | 5.4±0.7 | 17.8±0.5 | 8.6±0.3 |
a MTT assay was used for determination, with 3 parallel experiments in each group. The experimental data was the mean±SD value (standard error). |
由表1可知, R取代基对活性的影响关系为对氟苄基优于其它取代基. 当R为对氟苄基, R9为不同取代基时, 探究了N9位上引入5种不同取代基对目标化合物的影响(表2). 对于这3种癌细胞系, 当R9为对氟苄基和对三氟苄基时, 所表现出的活性优于其它取代基. 其中, 化合物6p [IC50=(7.9±0.6) μmol/L]对LLC细胞系的抑制活性低于10 μmol/L. 与顺铂阳性对照组相比, 化合物6o [IC50=(8.4±0.3) μmol/L]和化合物6p [IC50=(13.4±1.4) μmol/L]对A549细胞系的抑制作用优于阳性对照组. 而化合物6m、6n、6o和6p [IC50 (11.4±0.4)~(17.2±1.7) μmol/L]对NCI-H1666细胞系的抑制活性均低于20 μmol/L. 化合物6o和6p对A549和NCI-H1666细胞系表现出优异的抑制活性. 结果表明, 当在N9位上引入对氟苄基和对三氟苄基时, 有利于提高对多种癌细胞系的抑制作用, 其影响为对氟苄基>对三氟苄基>间氯苄基>苄基>甲基.
表2 化合物6b~6z对3种癌细胞系的体外抗肿瘤活性Table 2 In vitro anti-tumor activity of compounds 6b~6z against three cancer cell lines |
| Compd. | (IC50±SD)a/(μmol•L－1) | ||
|---|---|---|---|
| LLC | A549 | NCI-H1666 | |
| 6b | >50 | >50 | >50 |
| 6c | 23.6±0.6 | 21.3±0.5 | 17.2±0.2 |
| 6d | 18.7±0.3 | >50 | >50 |
| 6e | 21.2±0.4 | 15.2±0.6 | 19.8±07 |
| 6f | 29.2±0.3 | 12.9±0.5 | 15.6±0.7 |
| 6g | >50 | >50 | >50 |
| 6h | 47.0±0.3 | >50 | >50 |
| 6i | >50 | >50 | 16.4±1.5 |
| 6j | 22.2±0.5 | 36.2±0.3 | 44.4±0.6 |
| 6k | 24.7±0.3 | 17.5±0.5 | 13.8±0.2 |
| 6l | >50 | 34.8±0.4 | 14.0±0.1 |
| 6m | 12.4±0.3 | 23.3±0.2 | 11.4±0.4 |
| 6n | 13.7±0.4 | 28.2±1.3 | 12.9±1.1 |
| 6o | 12.1±0.6 | 8.4±0.3 | 17.2±1.7 |
| 6p | 7.9±0.6 | 13.4±1.4 | 14.2±0.6 |
| 6q | >50 | >50 | >50 |
| 6r | 30.7±0.6 | 27.4±1.3 | 17.1±2.6 |
| 6s | 17.4±0.5 | 9.9±0.1 | 15.8±1.3 |
| 6t | 9.7±0.9 | 18.9±1.4 | 12.3±0.3 |
| 6u | 14.4±0.3 | 13.5±0.6 | 18.6±1.6 |
| 6v | >50 | 39.3±0.9 | 23.0±1.1 |
| 6w | >50 | 34.3±0.3 | 18.3±0.5 |
| 6x | >50 | 25.4±0.7 | 16.0±0.4 |
| 6y | 12.8±0.6 | 5.2±0.1 | 11.6±0.3 |
| 6z | 13.4±0.4 | 13.3±0.7 | 14.7±0.7 |
| Cispyatin | 5.4±0.7 | 17.8±0.5 | 8.6±0.3 |
a MTT assay was used for determination, with 3 parallel experiments in each group. The experimental data was the mean±SD value (standard error). |
当R为其它取代基, R9为不同取代基时, 探究了N9位上引入5种不同取代基对目标化合物的影响. 对于这3种癌细胞系, 当R9为对氟苄基和对三氟苄基时, 所表现出的活性优于其它取代基. 其中, 化合物6t、6u、6y和化合物6z [IC50 (9.7±0.9)~(14.4±0.3) μmol/L]对LLC细胞系的抑制活性低于15 μmol/L. 与顺铂阳性对照组相比, 化合物6e、6f、6k、6u、6y和6z [IC50 (5.2±0.1)~(17.5±0.5) μmol/L]对A549细胞系的抑制作用优于阳性对照组. 而化合物6k、6t、6y和6z [IC50 (11.4±0.4)~(14.7±0.7) μmol/L]对NCI-H1666细胞系的抑制活性低于15 μmol/L. 化合物6y和6z对A549和NCI-H1666细胞系表现优异的抑制活性. 结果表明, R为其它取代基时, 在N9位上引入对氟苄基和对三氟苄基时, 有利于提高对多种癌细胞系的抑制作用, 其表现的影响为对氟苄基>对三氟苄基>间氯苄基>苄基>甲基.
基于以上数据分析, 可得到初步的构效关系: 当R为对氟苄基时, 多数化合物的活性普遍优于其它取代基 表明苯环对位引入氟原子产生吸电子诱导效应, 该吸电子芳环可通过π-π堆积、疏水作用增强化合物与靶点的结合能力. 当R9为甲基时, 由于给电子效应, 所测目标化合物对3种癌细胞系表现出低至中等程度的抗肿瘤活性. 当四氢-β-咔啉环的R9为苄基、间氯苄基、对氟苄基和对三氟苄基时, 所测化合物对这3种癌细胞系表现出良好的抗肿瘤活性. 从电子效应方面, 这些取代基是吸电子基, 吸电子芳基通过π-π堆积/疏水作用增强其结合活性. 因此, 当R为对氟苄基, R9为对氟苄基和对三氟苄基时, 所测化合物对这3种癌细胞系表现出优异的抗肿瘤活性.
总之, 化合物6o、6p、6y和6z对3种肿瘤细胞株表现出较为优异的抑制活性, 具有潜在的抗肿瘤价值.
1.3 分子对接研究
基于课题组前期该类化合物作用于血管内皮生长因子受体2 (VEGFR-2)靶点的相关基础研究, 为进一步探索四氢-β-咔啉并二酮哌嗪类化合物与VEGFR-2的作用机制, 选取临床常用VEGFR-2抑制剂舒尼替尼(Sunitinib)作为阳性对照, 基于其与VEGFR-2的共晶体结构(PDB: 4AGD), 采用OpenEye软件进行分子对接研究. 同时, 选取本工作中体外抗肿瘤活性优异的化合物6o (－42.22 kJ/mol)和6p (－43.81 kJ/mol), 将其与VEGFR-2的活性口袋进行对接, 并系统分析比较经典药物舒尼替尼与化合物6o、6p在结合模式上的异同, 进一步验证目标化合物与VEGFR-2的结合稳定性.
舒尼替尼分子对接研究结果表明, 舒尼替尼通过与VEGFR-2疏水口袋(VAL80、LEU121、VAL131等氨基酸)形成广泛疏水相互作用, 与LYS100A和GLU117A形成两条强氢键(H-A距离分别为0.319、0.220 nm), 并以LYS100A的π-阳离子作用, 稳定结合于ATP活性口袋, 其结合模式与共晶结构高度一致(图3).
化合物6o分子对接研究结果表明, 化合物6o能够稳定地结合于VEGFR-2的ATP活性口袋. 其四氢-β-咔啉母核以及双(4-氟苄基)侧链可有效占据疏水口袋, 与LEU121、LEU201及LEU231等氨基酸的关键疏水残基形成广泛且距离适宜(0.320~0.381 nm)的疏水相互作用. 同时, 配体与ARG209A之间形成一条氢键相互作用(H-A的距离为0.284 nm, 供体角为160.94°), 该氢键作用有效稳定了配体的结合构象. 结果表明, 化合物6o与VEGFR-2具有良好的结合亲和力和特异性, 可增强四氢-β-咔啉并二酮哌嗪类化合物的抗肿瘤活性(图4).
化合物6p分子对接研究结果表明, 化合物6p能够稳定结合于VEGFR-2的ATP活性口袋. 其四氢-β-咔啉母核及双苄基侧链可有效占据疏水口袋, 与ALA113、LEU121及LEU231等氨基酸关键疏水残基形成广泛且距离适宜(0.333~0.391 nm)的疏水相互作用; 同时, 配体芳香母核与HIS208A形成π-阳离子相互作用, 4-氟苄基的氟原子与GLU110A形成一条极性卤键(H-A的距离为0.342 nm, 供体角163.29°), 进一步强化了其结合稳定性. 结果表明, 化合物6p与VEGFR-2具有良好的结合亲和力和特异性, 可增强四氢-β-咔啉并二酮哌嗪类化合物的抗肿瘤活性(图5).
基于以上三者的分子对接结果, 舒尼替尼、化合物6o与化合物6p与VEGFR-2的结合模式异同分析表明, 三者在结合模式上具有高度一致性, 均通过疏水包裹与极性相互作用的经典方式结合于ATP活性口袋, 进一步证实了三者对VEGFR-2具有潜在的靶向抑制活性. 同时, 三者也存在明显的差异化特征: 舒尼替尼作为临床经典药物, 以氢键与π-阳离子相互作用构成的多极性作用为核心; 化合物6o以刚性稠环骨架形成了更充分的疏水包裹与稳定的氢键作用; 化合物6p则通过三氟甲基修饰引入了独特的极性卤素相互作用, 在保留疏水优势的同时新增了强特异性作用力. 结果表明, 化合物6o与6p的结合模式既符合VEGFR-2抑制剂的经典作用机制, 又具备骨架新颖、相互作用优化的差异化优势, 为后续四氢-β-咔啉类VEGFR-2抑制剂的结构修饰与进一步优化提供了重要的理论依据(表3).
表3 舒尼替尼、化合物6o和6p与4AGD分子对接模式异同表Table 3 Comparison of molecular docking modes of sunitinib, compounds 6o and 6p with 4AGD |
| Compd. | Protein | Hydrophobic interaction | Hydrogen bond | π-Cation interaction |
|---|---|---|---|---|
| Sunitinib | 4AGD | ASP-46、VAL-80、ALA-98、GLU-117、ILE-121、 VAL-131、VAL-148、ASP-228 | LYS-100、 GLU-117 | LYS-100 |
| 6o | 4AGD | GLU-117、LEU-121、ILE-121、VAL-130、LEU-201、 ASP-210、ILE-226、LEU-231 | ARG-209 | |
| 6p | 4AGD | ALA-113、LEU-121、ILE-124、LEU-201、ASP-210、LEU-231 | GLU-110 | HIS-208 |
1.4 分子动力学模拟
为了进一步证实四氢-β-咔啉并二酮哌嗪类化合物与靶蛋白4AGD结合体系的稳定性, 我们对该体系进行了分子动力学模拟分析. 选取体外抗肿瘤活性优异的化合物6p来评估配体与靶蛋白的稳定性及相互作用模式(图6).
首先, 氢键图(图6a)中氢键的数量在1.0~2.0个之间波动, 呈现出高度动态变化, 图中3个尖峰在约35, 50和95 ns对应特定的稳定状态; 且从图中可以看出化合物6p呈现平均1.5个氢键, 属于中等强度结合, 表明化合物6p与靶蛋白有一定的选择性结合, 且相互作用相对稳定. 残基均方根波动(RMSF)图(图6b)中大部分的蛋白残基<0.2 nm, 位于刚性区域, 表明骨架结构整体稳定; 图中4AGD蛋白残基在0~50间, RMSF约0.45 nm; 图中4AGD蛋白残基在125~150间, RMSF约0.43 nm; 图中4AGD蛋白残基在325~350, RMSF约0.42 nm. 结果表明蛋白残基在Loop区存在较大柔性, 有利于维持与配体结合. 其次, 均方根偏差(RMSD)图(图6c)中在0~10 ns时, RMSD从0快速上升至0.2 nm, 该阶段是系统的平衡过程, 在前10 ns完成结构弛豫, 后进入平衡状态; 在10~100 ns时, RMSD稳定在0.18~0.25 nm, 且波动范围约0.05 nm(小于0.25 nm), 表明体系已达到良好的结构平衡, 且波动幅度小, 整体构象稳定, 有利于维持天然活性构象. 最后, 回转半径(Rg)反映蛋白的紧凑程度, Rg图(图6d)中表现出整体在1.94~1.97 nm范围内紧密波动, 平均稳定值为1.95 nm, 属于中等大小的球状蛋白, 且图中没有明显的漂移或突变, 表明蛋白整体折叠状态高度稳定.
为多维度探究靶蛋白-复合物体系的动态构象稳定性及内在作用机制, 继续通过构建二维(2D)和三维(3D)自由能地貌图(FEL), 系统分析体系在构象空间中的能量分布特征(图7).
结合2D图和3D图分析结果发现, 图中以回旋半径(Rg/PC2)和均方根偏差(RMSD/PC1)为反应坐标, 定量表征构象演变的自由能变化. 图中能量井底部RMSD≈0.15~0.25 nm, Rg≈2.00~2.02 nm,属于天然稳定状态. RMSD图中的RMSD值稳定在0.20~0.25 nm, 2D图中的最优RMSD在0.15~0.25 nm, 二者高度吻合; Rg图中Rg值稳定在1.95 nm, 2D图中的最优Rg在2.00~2.02 nm, 二者范围基本一致. 体系在特定Rg与RMSD范围内存在全局自由能最小值区域(图中深蓝色洼池), 表明该构象状态下体系达到热力学最优稳定性. 负静电势区域(红色)对应于电负性原子的孤对电子, 是亲电攻击的潜在位点; 而正静电势区域(蓝色)通常位于氢原子或缺电子区域, 是亲核攻击的潜在位点, 这种显著的静电势极化现象证实了化合物分子具有较强的极性特征. 结果表明, 化合物分子与靶蛋白之间在模拟时间内达到热力学稳定, 结合状态牢固, 达到结合稳定性; 且能量井分布集中、范围窄, 达到构象一致性.
2 结论
为了探寻具有高效低毒且良好活性的抗肿瘤药物, 对2,3-位四氢-β-咔啉并二酮哌嗪环的结构进行修饰, 并对N9位进一步修饰共得到30个具有新结构的四氢-β-咔啉并二酮哌嗪类衍生物, 采用MTT法测试了目标化合物对三种肿瘤细胞株(LLC、A-549、NCI-H1666)增殖的抑制活性. 活性数据分析表明该系列化合物对测试的三种肿瘤细胞株具有中等至良好的抑制活性, 大部分化合物的IC50值小于20 μmol/L, 部分化合物优于阳性对照顺铂, 其中化合物6o、6p、6y和6z对A549细胞系表现出较优异的抑制活性. 结果表明, 在二酮哌嗪的N4位引入对氟苄基可以提高对多种肿瘤细胞的抑制作用, 在四氢-β-咔啉的N9位引入对氟苄基和对三氟苄基可以提高对肿瘤细胞的抑制作用. 分子对接结果显示, 化合物6o和6p与靶蛋白4AGD具有较高的结合能力. 为了进一步验证化合物6p与靶蛋白4AGD的结合能力, 又对化合物6p与靶蛋白4AGD的对接体系进行了分子动力学模拟, 模拟结果显示该对接体系能保持结合稳定性和构象一致性. 根据以上结果可初步推测, 化合物6p具有潜在的抗肿瘤价值, 后续可在四氢-β-咔啉并二酮哌嗪类化合物的N9位引入其它适当的取代基进一步来提高其抗肿瘤活性.
3 实验部分
3.1 仪器与试剂
Q Exactive型高分辨质谱仪(美国Thermo Scientific公司); Bruker Avance III HD 400型核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司); WS70-1型红外快速干燥箱(巩义市予华仪器有限公司); X-5型显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司); RV-8型旋转蒸发仪[艾卡(广州)仪器设备有限公司]; iMark型酶标仪(美国BIO-RAD公司).
3.2 实验方法
3.2.1 中间体3和4的合成
将原料L-色氨酸(1 mmol), NaOH (1 mmol)以及H2O (500 mL)置于1000 mL的三颈烧瓶中, 在常温下搅拌至溶解, 后缓慢加入甲醛溶液(1.03 mmol), 在室温下搅拌3~4 h, 再加热回流3~4 h, 薄层色谱法(TLC)监测反应进程. 反应结束后, 待反应液冷却至室温, 将其倒入冰水中, 用浓盐酸调pH至6左右, 将反应液置于冰箱冷藏8 h析出固体, 抽滤得化合物2[48].
将化合物2 (1.0 mmol)和150 mL乙醇置于500 mL的三颈烧瓶中, 搅拌均匀后, 将三颈烧瓶置于0 ℃的低温反应槽中, 缓慢滴加氯化亚砜(0.9 mmol); 加入完毕后, 开始回流加热温度至85 ℃反应8~9 h, 薄层色谱法(TLC)监测反应进程; 反应结束后, 将反应液减压真空浓缩至白色固体, 后加入H2O, 固体完全溶解, 然后先用NaOH调pH 7~8左右, 后用饱和碳酸氢钠溶液调pH至9, 经乙酸乙酯萃取(80 mL×3)、饱和食盐水洗涤(100 mL×3), 收集有机相, 用无水Na2SO4进行干燥, 减压浓缩, 得中间体化合物3[49].
将化合物3 (1.0 mmol)和20 mL四氢呋喃置于50 mL圆底烧瓶中, 搅拌溶解, 后加入N,N-二异丙基乙胺(1.2 mmol)和氯乙酰氯(1.2 mmol), 室温条件下反应10 h, 薄层色谱法(TLC)监测反应进程; 反应结束后, 将反应倒入冷水中, 经乙酸乙酯萃取(80 mL×3)、饱和食盐水洗涤(100 mL×3), 收集有机相, 无水Na2SO4干燥, 减压浓缩, 得中间体化合物4[50].
3.2.2 目标化合物5a~5e的合成
取中间体4 (1 mmol)、苄胺(1.2 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.2 mmol), 将其置于100 mL圆底烧瓶中, 室温下反应12 h, TLC监测反应进程. 反应完毕后, 将反应倒入冷水中, 用乙酸乙酯萃取(80 mL×3)、饱和食盐水洗涤(100 mL×3), 合并有机相, 无水Na2SO4干燥, 减压浓缩, 经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇, V∶V 150∶1~50∶1), 得目标产物5a. 化合物5b~5e的合成方法与化合物5a类似.
(S)-1-苄基-3,4,6,7,9,10-六氢吡嗪并[2,1-a]四氢-β-咔啉-2,5-二酮(5a): 白色固体, 收率93.0%. m.p. 253.9~255.4 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－135 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 11.02 (s, 1H), 7.49~7.44 (m, 1H), 7.39~7.30 (m, 6H), 7.09~7.05 (m, 1H), 7.01~6.97 (m, 1H), 5.37 (dd, J=16.6, 1.6 Hz, 1H), 4.67 (d, J=14.8 Hz, 1H), 4.55 (d, J=14.8 Hz, 1H), 4.45 (dd, J=12.0, 4.4 Hz, 1H), 4.24~4.19 (m, 1H), 4.11 (dd, J=17.6, 1.2 Hz, 1H), 3.91 (d, J=17.6 Hz, 1H), 3.29~3.24 (m, 1H), 2.96~2.90 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 165.74, 163.18, 136.50, 136.43, 130.30, 129.16, 128.36, 128.01, 126.82, 121.57, 119.24, 118.15, 111.63, 106.05, 56.56, 49.12, 48.61, 42.82, 26.99; HRMS (ESI) calcd for C21H20- N3O2 (M＋H)＋ 346.1550, found 346.1552.
(S)-1-苯乙基-3,4,6,7,9,10-六氢吡嗪并[2,1-a]四氢-β-咔啉-2,5-二酮(5b): 白色固体, 收率95.0%. m.p. 201.3~202.5 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$ －171 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.55~8.37 (m, 1H), 7.48~7.42 (m, 1H), 7.34~7.26 (m, 3H), 7.25~7.21 (m, 3H), 7.18~7.19 (m, 2H), 5.50 (dd, J=16.4, 1.6 Hz, 1H), 4.22 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.10~4.15 (m, 1H), 3.93~3.80 (m, 3H), 3.54~3.37 (m, 2H), 3.10~2.96 (m, 2H), 2.78~2.71 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 165.08, 162.66, 137.91, 136.20, 128.79, 128.75, 128.31, 126.88, 126.48, 122.23, 119.90, 118.05, 111.06, 107.00, 56.73, 50.15, 47.91, 32.98, 27.13; HRMS (ESI) calcd for C22H22N3O2 (M＋H)＋ 360.1706, found 360.1703.
(S)-1-(4-氟苄基)-3,4,6,7,9,10-六氢吡嗪并[2,1-a]四氢-β-咔啉-2,5-二酮(5c): 白色固体, 收率90.0%. m.p. 225.1~226.1 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－150 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.36 (s, 1H), 7.42~7.33 (m, 1H), 7.25~7.15 (m, 3H), 7.12~6.91 (m, 4H), 5.41 (dd, J=16.4, 1.6 Hz, 1H), 4.56~4.45 (m, 2H), 4.22 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 3.99 (d, J=16.4 Hz, 1H), 3.91~3.76 (m, 2H), 3.44~3.38 (m, 1H), 2.80~2.73 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 164.21, 161.58 (d, J=245.0 Hz), 135.19, 129.80 (d, J=3.3 Hz), 129.31, 129.27 (d, J=8.0 Hz), 127.23, 125.45, 121.23, 118.91, 117.05, 115.05, 114.95 (d, J=24.0 Hz), 110.04, 105.87, 55.66, 47.63, 38.96, 26.31; 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ: －113.4; HRMS (ESI) calcd for C21H19FN3O2 (M＋H)＋ 364.1455, found 364.1452.
(S)-1-(4-溴苄基)-3,4,6,7,9,10-六氢吡嗪并[2,1-a]四氢-β-咔啉-2,5-二酮(5d): 白色固体, 收率95.0%. m.p. 157.9~158.7 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－105 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.99 (s, 1H), 7.61~7.53 (m, 2H), 7.45 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.37~7.27 (m, 3H), 7.10~7.04 (m, 1H), 7.03~6.95 (m, 1H), 5.36 (dd, J=16.4, 1.6 Hz, 1H), 4.65~4.50 (m, 2H), 4.44 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.17 (dd, J=34.0, 17.2 Hz, 2H), 3.93 (d, J=17.6 Hz, 1H), 3.29~3.22 (m, 1H), 2.99~2.87 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 165.85, 163.14, 136.41, 136.06, 132.01, 131.89, 131.63, 131.60, 131.58, 130.64, 130.28, 126.80, 121.56, 121.14, 119.23, 118.13, 111.62, 106.01, 56.52, 49.26, 48.11, 42.16, 26.94; HRMS (ESI) calcd for C21H19BrN3O2 (M＋H)＋ 424.0655, found 424.0652.
(S)-1-正己基-3,4,6,7,9,10-六氢吡嗪并[2,1-a]四氢-β-咔啉-2,5-二酮(5e): 白色固体, 收率90.0%. m.p. 133.6~134.9 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－194 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.95 (s, 1H), 7.43 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.33 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.08~7.04 (m, 1H), 7.00~6.96 (m, 1H), 5.37 (dd, J=16.4, 1.2 Hz, 1H), 4.32 (dd, J=11.6, 3.6 Hz, 1H), 4.22 (s, 1H), 4.17 (s, 1H), 3.99 (d, J=17.6 Hz, 1H), 3.43~3.26 (m, 2H), 3.21~3.16 (m, 1H), 2.88~2.81 (m, 1H), 1.56~1.47 (m, 2H), 1.32~1.25 (m, 5H), 0.87 (t, J=6.8 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 165.30, 163.55, 136.39, 130.36, 126.82, 121.55, 119.22, 118.10, 111.60, 106.09, 56.56, 49.27, 45.44, 31.43, 26.90, 26.30, 22.50, 14.40; HRMS (ESI) calcd for C20H26N3O2 (M＋H)＋ 340.2019, found 340.2016.
3.2.3 目标化合物6b~6z的合成
取中间体5a (1 mmol)、NaH (3.0 mmol)、碘甲烷(1.6 mmol)和DMF (10 mL), 将其置于100 mL圆底烧瓶中, 0 ℃下反应10 min, TLC监测反应进程. 反应完毕后, 将反应倒入冷水中淬灭, 用乙酸乙酯萃取(80 mL×3)、H2O洗涤(100 mL×3)、饱和食盐水洗涤(100 mL×3), 合并有机相, 无水Na2SO4干燥, 减压浓缩, 经柱层析纯化(正己烷/乙酸乙酯, V∶V 10∶1~3∶1), 得目标产物6b. 化合物6c~6z的合成方法与化合物6b类似.
(S)-2-苄基-7-甲基-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6b): 白色固体, 收率96.0%. m.p. 210.8~212.1 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－127 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.50~7.47 (m, 1H), 7.41~7.27 (m, 6H), 7.24~7.20 (m, 1H), 7.15~7.10 (m, 1H), 5.63 (dd, J=16.4, 1.6 Hz, 1H), 4.74~4.60 (m, 2H), 4.40~4.31 (m, 1H), 4.15~4.09 (m, 1H), 3.97 (s, 2H), 3.65 (s, 3H), 3.60~3.54 (m, 1H), 2.97~2.89 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 165.22, 162.66, 137.18, 134.98, 129.75, 129.03, 128.54, 128.28, 126.11, 121.85, 119.61, 118.16, 108.94, 105.93, 56.84, 49.36, 48.71, 39.29, 29.73, 29.70, 29.66, 27.52; HRMS (ESI) calcd for C22H22N3O2 (M＋H)＋ 360.1706, found 360.1704.
(S)-2,7-二苄基-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6c): 白色固体, 收率92.0%. m.p. 165.9~167.0 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－101 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.55~7.51 (m, 1H), 7.45~7.42 (m, 1H), 7.40~7.20 (m, 8H), 7.14~7.02 (m, 4H), 5.51~5.31 (m, 3H), 4.71~4.40 (m, 3H), 4.21~4.06 (m, 2H), 3.89 (d, J=17.6 Hz, 1H), 3.34~3.29 (m, 1H), 3.01~2.94 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 165.59, 163.22, 138.44, 136.97, 136.46, 131.27, 129.15, 129.13, 128.33, 127.98, 127.73, 126.87, 126.57, 121.90, 119.71, 118.52, 110.32, 106.63, 56.40, 49.14, 48.60, 46.53, 26.99; HRMS (ESI) calcd for C28H26N3O2 (M＋H)＋ 436.2019, found 436.2016.
(S)-2-苄基-7-(3-氯苄基)-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6d): 白色固体, 收率90.0%. m.p. 194.0~195.9 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－113 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.54 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.39~7.28 (m, 5H), 7.24~7.13 (m, 5H), 7.01 (d, J=2.4 Hz, 1H), 6.83 (d, J=6.8 Hz, 1H), 5.59~5.45 (m, 1H), 5.32~5.11 (m, 2H), 4.75~4.57 (m, 2H), 4.36 (dd, J=10.8, 4.0 Hz, 1H), 4.06~3.89 (m, 3H), 3.62 (dd, J=15.6, 4.0 Hz, 1H), 3.01~2.93 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 165.11, 162.63, 139.05, 136.98, 134.98, 130.40, 130.31, 129.51, 129.06, 128.54, 128.31, 128.04, 126.41, 124.28, 122.42, 109.32, 107.20, 56.71, 49.37, 48.72, 46.45, 39.28, 27.56; HRMS (ESI) calcd for C28H25ClN3O2 (M＋H)＋ 470.1629, found 470.1626.
(S)-2-苄基-7-(4-氟苄基)-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6e): 白色固体, 收率96.0%. m.p. 231.1~231.7 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－167 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.54 (dd, J=7.2, 1.2 Hz, 1H), 7.40~7.28 (m, 5H), 7.26~7.23 (m, 1H), 7.21~7.13 (m, 2H), 5.53 (dd, J=16.4, 1.6 Hz, 1H), 5.28 (d, J=17.2 Hz, 1H), 5.17 (d, J=16.8 Hz, 1H), 4.77~4.57 (m, 2H), 4.35 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.00~3.95 (m, 3H), 3.64~3.59 (m, 1H), 3.01~2.93 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 165.09, 163.48, 163.38, 162.15 (d, J=245.0 Hz), 136.94, 134.96, 132.63 (d, J=3.2 Hz), 129.53, 129.03, 128.51, 128.28, 127.83 (d, J=6.0 Hz), 126.36, 122.29, 120.00, 118.38, 115.89 (d, J=21.0 Hz), 109.34, 107.02, 56.71, 49.34, 48.70, 46.32, 39.31, 27.55; 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ: －114.51; HRMS (ESI) calcd for C28H25FN3O2 (M＋H)＋ 454.1925, found 454.1922.
(S)-2-苄基-7-(4-三氟甲基苄基)-1,2,3,6,7,12-六氢- 4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6f): 白色固体, 收率90.0%. m.p. 254.2~255.0 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－136 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.67 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.58~7.52 (m, 1H), 7.45~7.29 (m, 6H), 7.21 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.14~7.10 (m, 1H), 7.14~7.04 (m, 1H), 5.55 (d, J=4.0 Hz, 2H), 5.38 (d, J=16.4 Hz, 1H), 3.32 (s, 1H), 3.05~2.94 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 165.57, 163.23, 143.39, 136.93, 136.45, 131.25, 129.14, 128.35 (q, J=31.0 Hz), 127.99, 127.49, 126.64, 126.08 (q, J=4.0 Hz), 121.00 (q, J=217.0 Hz), 118.63, 110.23, 106.99, 56.37, 49.13, 48.59, 46.06, 39.14, 26.95; 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ: －60.90; HRMS (ESI) calcd for C29H25F3N3O2 (M＋H)＋ 504.1893, found 504.1890.
(S)-7-甲基-2-苯乙基-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6g): 白色固体, 收率96.0%. m.p. 120.9~121.4 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－237 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.47 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.34~7.19 (m, 7H), 7.14~7.10 (m, 1H), 5.60 (dd, J=16.4, 1.6 Hz, 1H), 4.23 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.14~4.06 (m, 1H), 3.97~3.83 (m, 3H), 3.63 (s, 3H), 3.55~3.41 (m, 2H), 3.05~2.88 (m, 2H), 2.81~2.73(m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 165.08, 162.62, 137.94, 137.13, 129.78, 128.79, 128.76, 126.87, 126.08, 121.83, 119.58, 118.11, 108.93, 105.96, 56.80, 50.20, 47.92, 39.26, 33.00, 29.63, 27.24; HRMS (ESI) calcd for C23H24N3O2 (M＋H)＋ 374.1863, found 374.1860.
(S)-7-苄基-2-苯乙基-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6h): 白色固体, 收率95.0%. m.p. 133.4~134.7 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－256 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.54~7.48 (m, 1H), 7.34~7.26 (m, 4H), 7.24~7.10 (m, 4H), 7.03~6.95 (m, 2H), 5.52 (dd, J=16.4, 1.6 Hz, 1H), 5.31 (d, J=16.8 Hz, 1H), 5.17 (d, J=16.8 Hz, 1H), 4.23 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 3.99~3.81 (m, 4H), 3.55~3.44 (m, 2H), 3.04~2.88 (m, 2H), 2.85~2.77 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 165.02, 162.52, 137.93, 137.04, 136.91, 129.73, 128.93, 128.79, 128.75, 127.69, 126.87, 126.18, 122.16, 109.43, 106.83, 56.71, 50.19, 47.91, 46.94, 39.33, 33.00, 27.29; HRMS (ESI) calcd for C29H28N3O2 (M＋H)＋ 450.2176, found 450.2173.
(S)-7-(3-氯苄基)-2-苯乙基-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6i): 白色固体, 收率97.0%. m.p. 117.0~118.5 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－226 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.53 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.32~7.30 (m, 2H), 7.25~7.12 (m, 6H), 7.03 (s, 1H), 6.84 (d, J=7.2 Hz, 1H), 5.51 (d, J=16.6 Hz, 1H), 5.28 (d, J=17.2 Hz, 1H), 5.16 (d, J=17.2 Hz, 1H), 4.26 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 3.93 (d, J=45.6 Hz, 4H), 3.58~3.46 (m, 2H), 3.03~2.89 (m, 2H), 2.85~2.79 (m, 1H); 13C NMR(100 MHz, CDCl3) δ: 164.97, 162.59, 139.02, 137.92, 136.94, 134.96, 130.30, 129.51, 128.79, 128.03, 126.90, 126.33, 124.27, 122.39, 120.09, 118.39, 109.29, 107.23, 56.69, 50.20, 47.94, 46.44, 39.24, 33.02, 27.26; HRMS (ESI) calcd for C29H27ClN3O2 (M＋H)＋ 484.1786, found 484.1789.
(S)-7-(4-氟苄基)-2-苯乙基-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6j): 白色固体, 收率90.0%. m.p. 151.2~151.8 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－201 (c 0.08, CH3OH); 1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.52 (dd, J=7.2, 1.6 Hz, 1H), 7.36~7.28 (m, 2H), 7.25~7.22 (m, 3H), 7.22~7.17 (m, 1H), 7.18~7.13 (m, 1H), 7.03~6.91 (m, 4H), 5.51 (dd, J=16.4, 1.6 Hz, 1H), 5.27 (d, J=16.8 Hz, 1H), 5.16 (d, J=16.8 Hz, 1H), 4.24 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.00~3.83 (m, 4H), 3.57~3.44 (m, 2H), 3.05~2.87 (m, 2H), 2.85~2.77 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 164.99, 162.59, 162.21 (d, J=245.0 Hz), 137.92, 136.91, 132.64 (d, J=3.2 Hz), 129.56, 128.78 (d, J=5.1 Hz), 127.90, 127.82, 126.89, 126.33, 122.29, 119.99, 118.34, 116.01, 115.92 (d, J=26.0 Hz), 109.33, 107.05, 56.70, 50.19, 47.93, 46.32, 39.28, 33.01, 27.26; 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ: －114.47; HRMS (ESI) calcd for C29H27FN3O2 (M＋H)＋ 468.2081, found 468.2080.
(S)-7-(4-三氟甲基苄基)-2-苯乙基-1,2,3,6,7,12-六氢- 4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6k): 白色固体, 收率95.0%. m.p. 173.5~174.3 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－247 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.53 (dd, J=7.6, 2.0 Hz, 3H), 7.35~7.29 (m, 2H), 7.27~7.15 (m, 6H), 7.09 (d, J=8.0 Hz, 2H), 5.57~5.45 (m, 1H), 5.41~5.21 (m, 2H), 4.25 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.03~3.83 (m, 4H), 3.58~3.45 (m, 2H), 3.03~2.89 (m, 2H), 2.86~2.78 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 164.91, 162.63, 140.97, 137.91, 136.90, 130.11 (q, J=32.0 Hz), 129.48, 128.79, 126.91, 126.03 (q, J=4.0 Hz), 125.99, 122.51 (q, J=6.6 Hz), 121.34 (q, J=240.0 Hz), 120.21, 118.47, 109.24, 107.37, 56.69, 50.19, 47.94, 46.51, 39.19, 33.01, 27.25; 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ: －62.60; HRMS (ESI) calcd for C30H27F3N3O2 (M＋H)＋ 518.2049, found 518.2046.
(S)-2-(4-氟苄基)-7-甲基-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6l): 白色固体, 收率93.0%. m.p. 211.3~212.3 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－154 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.48 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.33~7.24 (m, 4H), 7.24~7.19 (m, 1H), 7.13~7.09 (m, 1H), 7.05 (dd, J=9.6, 7.6 Hz, 2H), 5.60 (dd, J=16.4, 1.6 Hz, 1H), 4.61 (d, J=1.6 Hz, 2H), 4.32 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.12~4.07 (m, 1H), 3.95 (s, 2H), 3.62 (s, 3H), 3.56~3.50 (m, 1H), 2.93~2.86 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 165.23, 163.83, 162.60 (d, J=245.0 Hz), 161.38, 137.15, 130.88 (d, J=3.3 Hz), 130.33, 129.73, 126.03 (d, J=7.0 Hz), 121.83, 119.60, 118.11, 116.04, 115.93 (d, J=21.0 Hz), 108.94, 105.80, 56.74, 48.64, 39.25, 29.62, 27.45; 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ: －113.53; HRMS (ESI) calcd for C22H21FN3O2 (M＋H)＋ 378.1612, found 378.1609.
(S)-7-苄基-2-(4-氟苄基)-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6m): 白色固体, 收率93.0%. m.p. 190.0~190.3 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－140 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.53 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.34~7.18 (m, 4H), 7.18~7.10 (m, 1H), 7.10~6.96 (m, 4H), 5.54 (dd, J=16.6, 1.6 Hz, 1H), 5.32 (d, J=16.8 Hz, 1H), 5.18 (d, J=16.8 Hz, 1H), 4.69~4.55 (m, 2H), 4.34 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.02~3.92 (m, 3H), 3.65~3.55 (m, 1H), 2.99~2.91 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 165.18, 163.85, 162.60 (d, J=250.0 Hz), 161.39, 137.08, 136.90, 130.88, 130.86 (d, J=8.0 Hz), 130.35, 130.27, 129.67, 128.94, 127.66 (d, J=9.0 Hz), 126.27, 126.16, 122.20, 119.89, 118.26, 116.06, 115.95 (d, J=21.0 Hz), 109.46, 106.72, 56.69, 48.66, 46.95, 39.38, 27.54; 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ: －113.52; HRMS (ESI) calcd for C28H25FN3O2 (M＋H)＋ 454.1925, found 454.1928.
(S)-7-(3-氯苄基)-2-(4-氟苄基)-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6n): 白色固体, 收率95.0%. m.p. 191.5~191.8 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－150 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.56~7.52 (m, 1H), 7.50~7.42 (m, 1H), 7.42~7.34 (m, 2H), 7.34~7.27 (m, 2H), 7.26~7.16 (m, 2H), 7.16~7.09 (m, 2H), 7.08~7.04 (m, 1H), 7.00~6.90 (m, 1H), 5.52~5.35 (m, 3H), 4.66~4.52 (m, 2H), 4.44 (dd, J=11.8, 4.0 Hz, 1H), 4.23~4.16 (m, 1H), 4.11 (d, J=17.2 Hz, 1H), 3.92 (d, J=17.6 Hz, 1H), 3.34~3.26 (m, 1H), 3.02~2.95 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 165.62, 164.43 (d, J=237.0 Hz), 163.25, 141.09, 136.89, 133.77, 132.72 (d, J=3.0 Hz), 131.22, 131.09, 130.56, 130.48, 139.31 (d, J=8.0 Hz), 127.76, 125.49, 122.06, 119.88, 118.59, 116.01 (d, J=21.0 Hz), 115.78, 110.26, 106.88, 56.35, 49.13, 47.93, 45.91, 26.90; 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ: －115.06; HRMS (ESI) calcd for C28H24ClFN3O2 (M＋H)＋ 488.1535, found 488.1532.
(S)-2,7-双(4-氟苄基)-1,2,3,6,7,12-六氢吡嗪-4H-并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6o): 白色固体, 收率90.0%. m.p. 207.2~208.1 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－154 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.56~7.49 (m, 1H), 7.33~7.27 (m, 2H), 7.25~7.12 (m, 3H), 7.10~7.00 (m, 2H), 6.98~6.92 (m, 4H), 5.53 (dd, J=16.4, 1.6 Hz, 1H), 5.27 (d, J=16.8 Hz, 2H), 4.69~4.55 (m, 2H), 4.34 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.02~3.87 (m, 3H), 3.62~3.56 (m, 1H), 2.99~2.91 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 165.12, 163.86, 163.43, 162.63 (d, J=246.0 Hz), 162.22 (d, J=241.0 Hz) 161.40, 160.98, 136.94, 132.62 (d, J=3.1 Hz), 130.85 (d, J=3.3 Hz), 130.36, 130.32 (d, J=8.0 Hz), 129.50, 127.88, 127.76 (d, J=5.0 Hz), 126.33, 122.31, 120.02, 118.36, 116.07, 116.00, 115.96 (d, J=21.0 Hz), 115.89 (d, J=22.0 Hz), 109.35, 106.94, 56.67, 48.66, 46.31, 39.31, 27.51; 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ: －113.48, －114.46; HRMS (ESI) calcd for C28H24F2N3O2 (M＋H)＋ 472.1831, found 472.1834.
(S)-2-(4-氟苄基)-7-(4-三氟甲基苄基)-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6p): 白色固体, 收率90.0%. m.p. 237.2~237.9 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－145 (c 0.08, CH3OH); 1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.54 (dd, J=10.4, 7.6 Hz, 3H), 7.33~7.26 (m, 2H), 7.24~7.14 (m, 3H), 7.11~7.01 (m, 4H), 5.52 (dd, J=16.4, 1.6 Hz, 1H), 5.42~5.20 (m, 2H), 4.73~4.56 (m, 2H), 4.35 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.05~3.89 (m, 3H), 3.64~3.58 (m, 1H), 3.00~2.92 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 165.07, 163.88, 162.65 (d, J=246.0 Hz), 161.42, 140.97, 136.94, 130.84 (d, J=3.3 Hz), 130.38, 130.28, 129.94, 129.48 (q, J=27.0 Hz), 126.45 (d, J=7.0 Hz), 126.02 (q, J=3.0 Hz), 125.99 (d, J=3.8 Hz), 125.24, 122.52 (q, J=200.0Hz), 120.24, 118.49, 116.09, 115.98 (d, J=22.0 Hz), 109.27, 107.25, 56.66, 48.67, 46.51, 39.23, 27.50; 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ: －62.59, －113.46; HRMS (ESI) calcd for C29H24F4N3O2 (M＋H)＋ 522.1799, found 522.1796.
(S)-2-(4-溴苄基)-7-甲基-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6q): 白色固体, 收率94.0%. m.p. 180.2~182.1 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－105 (c 0.08, CH3OH); 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.63~7.54 (m, 2H), 7.45 (dd, J=23.6, 8.0 Hz, 2H), 7.31 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.15~7.11 (m, 1H), 7.04~7.01 (m, 1H), 5.53~5.39 (m, 1H), 4.65~4.49 (m, 2H), 4.39 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.18 (dd, J=38.0, 17.2 Hz, 2H), 3.95 (d, J=17.6 Hz, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.26 (dd, J=15.2, 4.0 Hz, 1H), 2.93 (dd, J=15.2, 11.6 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, DMSO- d6) δ: 165.74, 163.20, 137.20, 136.04, 132.02, 131.48, 130.69, 126.30, 121.55, 121.15, 119.41, 118.29, 109.82, 105.72, 56.46, 49.26, 48.14, 29.90, 26.94; HRMS (ESI) calcd for C22H21BrN3O2 (M＋H)＋ 438.0811, found 438.0809.
(S)-7-苄基-2-(4-溴苄基)-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6r): 白色固体, 收率94.0%. m.p. 179.7~180.5 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－115 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.54 (dd, J=14.8, 7.6 Hz, 3H), 7.44 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.35~7.20 (m, 5H), 7.08 (dd, J=19.6, 7.6 Hz, 4H), 5.45~5.36 (m, 3H), 4.61~4.52 (m, 2H), 4.42 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.17~4.09 (m, 2H), 3.92 (d, J=17.6 Hz, 1H), 3.35~3.27 (m, 1H), 23.01~2.94 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 165.70, 163.17, 138.44, 136.97, 136.02, 131.99, 130.62, 129.13, 127.73, 126.86, 126.56, 121.90, 121.11, 119.71, 118.50, 110.32, 106.61, 56.37, 49.28, 48.11, 46.53, 26.96; HRMS (ESI) calcd for C28H25BrN3O2 (M＋H)＋ 514.1124, found 514.1121.
(S)-2-(4-溴苄基)-7-(3-氯苄基)-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6s): 白色固体, 收率92.0%. m.p. 179.7~181.4 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－107 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.55 (dd, J=10.8, 8.0 Hz, 3H), 7.44 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.36~7.26 (m, 4H), 7.17~7.03 (m, 3H), 6.97~6.93 (m, 1H), 5.52~5.36 (m, 3H), 4.67~4.49 (m, 2H), 4.44 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.14 (dd, J=17.2, 10.8 Hz, 2H), 3.92 (d, J=17.6 Hz, 1H), 3.30 (d, J=21.2 Hz, 2H), 3.02~2.95 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 165.70, 163.23, 141.09, 136.89, 136.02, 133.77, 131.99, 131.21, 131.09, 130.62, 127.77, 126.76, 126.60, 125.49, 122.07, 121.11, 119.89, 118.60, 110.26, 106.88, 56.33, 49.28, 48.12, 45.91, 26.91; HRMS (ESI) calcd for C28H24BrClN3O2 (M＋H)＋ 548.0734, found 548.0731.
(S)-2-(4-溴苄基)-7-(4-氟苄基)-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6t): 白色固体, 收率91.0%. m.p. 202.0~203.3 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－100 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.58~7.51 (m, 3H), 7.45 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.32~7.28 (m, 2H), 7.22~6.96 (m, 6H), 5.45~5.35 (m, 3H), 4.66~4.50 (m, 2H), 4.43 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.19~4.10 (m, 2H), 3.92 (d, J=17.6 Hz, 1H), 3.35~3.27 (m, 1H), 3.01~2.94 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 165.69, 163.19, 163.02, 161.81 (d, J=242.0 Hz), 136.88, 136.02, 134.66, 134.64 (d, J=3.0 Hz), 131.99, 131.17, 130.62, 128.91 (d, J=8.0 Hz), 126.59, 121.97, 121.12, 119.78, 118.54, 115.93 (d, J=21.0 Hz), 110.29, 106.76, 56.35, 49.28, 48.12, 45.82, 26.94; 19F NMR (376 MHz, DMSO- d6) δ: －115.43; HRMS (ESI) calcd for C28H24BrFN3O2 (M＋H)＋ 532.1030, found 532.1033.
(S)-2-(4-溴苄基)-7-(4-三氟甲基苄基)-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6u): 白色固体, 收率93.0%. m.p. 249.4~250.6 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－113 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.58~7.47 (m, 5H), 7.24~7.14 (m, 5H), 7.08 (d, J=8.0 Hz, 2H), 5.53 (dd, J=16.4, 1.6 Hz, 1H), 5.36 (d, J=17.2 Hz, 1H), 5.26 (d, J=17.2 Hz, 1H), 4.69~4.53 (m, 2H), 4.36 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.04~3.87 (m, 3H), 3.64~3.58 (m, 1H), 3.00~2.93 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 165.14, 162.40, 140.94, 136.93, 134.02, 132.20, 130.12 (q, J=33.0 Hz), 129.40, 126.39, 126.00 (q, J=3.8 Hz), 122.52, 122.39, 121.35 (q, J=233.0 Hz), 120.25, 118.49, 109.27, 107.23, 56.65, 48.80, 46.52, 39.24, 27.51; 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ: －62.63; HRMS (ESI) calcd for C29H24BrF3N3O2 (M＋H)＋ 582.0998, found 582.0995.
(S)-2-己基-7-甲基-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2- a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6v): 白色固体, 收率94.0%. m.p. 205.4~207.7 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－182 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.54 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.40 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.15~7.10 (m, 1H), 7.06~7.00 (m, 1H), 5.48 (dd, J=16.4, 1.6 Hz, 1H), 4.92 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.20 (s, 1H), 4.16 (s, 1H), 3.97 (d, J=17.6 Hz, 1H), 3.64 (s, 3H), 3.47~3.30 (m, 2H), 3.29~3.17 (m, 2H), 2.86~2.78 (m, 1H), 1.56~1.49 (m, 2H), 1.32~1.21 (m, 6H), 0.83 (t, J=7.2 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 165.16, 163.54, 137.19, 131.52, 126.33, 121.50, 119.36, 118.20, 109.76, 105.76, 56.48, 49.26, 45.45, 38.99, 31.75, 29.84, 29.16, 26.93, 26.66, 26.33, 22.60, 14.44; HRMS (ESI) calcd for C21H28N3O2 (M＋H)＋ 354.2176, found 354.2173.
(S)-7-苄基-2-己基-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2- a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6w): 白色固体, 收率94.0%. m.p. 103.1~104.2 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－200 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.52 (d, J=7.2 Hz, 1H), 7.30~7.26 (m, 2H), 7.25~7.10 (m, 3H), 7.04~6.96 (m, 2H), 5.56 (dd, J=16.4, 1.6 Hz, 1H), 5.33 (d, J=16.8 Hz, 1H), 5.20 (d, J=16.8 Hz, 1H), 4.27 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.10~3.95 (m, 3H), 3.60~3.45 (m, 2H), 3.42~3.35 (m, 1H), 2.96~2.88 (m, 1H), 1.63~1.56 (m, 2H), 1.40~1.26 (m, 6H), 0.90 (t, J=7.2 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 164.93, 162.75, 137.07, 136.94, 129.76, 128.95, 127.70, 126.32, 126.18, 122.15, 119.85, 118.27, 109.44, 106.90, 56.76, 49.35, 46.97, 46.07, 39.37, 31.44, 27.42, 26.36, 22.52, 14.01; HRMS (ESI) calcd for C27H32N3O2 (M＋H)＋ 430.2489, found 430.2487.
(S)-7-(3-氯苄基)-2-己基-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6x): 白色固体, 收率96.0%. m.p. 122.9~123.9 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－190 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.53 (d, J=7.2 Hz, 1H), 7.24~7.18 (m, 3H), 7.19~7.17 (m, 1H), 7.16~7.13 (m, 1H), 7.03 (s, 1H), 6.86~6.83 (m, 1H), 5.55 (dd, J=16.4, 1.6 Hz, 1H), 5.30 (d, J=17.2 Hz, 1H), 5.18 (d, J=17.2 Hz, 1H), 4.29 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.16~3.96 (m, 3H), 3.64~3.47 (m, 2H), 3.40~3.36 (m, 1H), 2.97~2.89 (m, 1H), 1.64~1.57 (m, 2H), 1.40~1.27 (m, 6H), 0.88 (t, J=7.2 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 164.87, 162.82, 139.06, 136.97, 134.99, 130.31, 129.55, 128.04, 126.42, 126.31, 124.28, 122.39, 120.10, 118.44, 109.30, 107.30, 56.73, 49.37, 46.46, 46.11, 39.27, 39.11, 31.46, 27.37, 27.18, 26.40, 22.54, 14.02; HRMS (ESI) calcd for C27H31ClN3O2 (M＋H)＋ 464.2099, found 464.2097.
(S)-7-(4-氟苄基)-2-己基-1,2,3,6,7,12-六氢-4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6y): 白色固体, 收率94.0%. m.p. 140.0~140.8 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－180 (c 0.08, CH3OH); 1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.52 (dd, J=7.2, 1.2 Hz, 1H), 7.25~7.11 (m, 3H), 7.03~6.92 (m, 4H), 5.56 (dd, J=16.4, 1.6 Hz, 1H), 5.29 (d, J=16.8 Hz, 1H), 5.17 (s, 1H), 4.28 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.02 (d, J=2.0 Hz, 2H), 3.60~3.46 (m, 2H), 3.43~3.36 (m, 1H), 2.96~2.88 (m, 1H), 1.64~1.57 (m, 2H), 1.35~1.32 (m, 6H), 0.88 (t, J=7.2 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 164.87, 162.22 (d, J=245.0 Hz), 136.94, 132.66 (d, J=3.3 Hz), 129.59, 127.85 (d, J=8.0 Hz), 126.38, 122.28, 119.99, 118.38, 115.91 (d, J=21.0 Hz), 109.33, 107.13, 56.74, 49.36, 46.34, 46.10, 39.32, 31.45, 27.40, 26.42, 26.36, 22.53, 14.01; 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ: －114.52; HRMS (ESI) calcd for C27H31FN3O2 (M＋H)＋ 448.2394, found 448.2391.
(S)-2-己基-7-(4-三氟甲基苄基)-1,2,3,6,7,12-六氢- 4H-吡嗪并[1,2-a]四氢-β-咔啉-1,4-二酮(6z): 白色固体, 收率93.0%. m.p. 187.2~188.9 ℃; ${[\alpha ]}_{\text{D}}^{\text{25}}$－174 (c 0.08, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.59~7.49 (m, 3H), 7.23~7.14 (m, 3H), 7.10 (d, J=8.0 Hz, 2H), 5.55 (dd, J=16.4, 1.6 Hz, 1H), 5.41~5.23 (m, 2H), 4.29 (dd, J=11.6, 4.0 Hz, 1H), 4.15~3.94 (m, 3H), 3.61~3.46 (m, 2H), 3.44~3.37(m, 1H), 2.98~2.90 (m, 1H), 1.64~1.57 (m, 2H), 1.40~1.27 (m, 6H), 0.89 (t, J=7.2 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 164.80, 162.84, 141.00, 136.93, 130.20 (q, J=32.0 Hz), 129.96, 126.46, 126.40, 126.00 (q, J=4.0 Hz), 122.50, 121.311 (q, J=230.0 Hz), 18.50, 109.24, 107.44, 56.72, 49.35, 46.53, 46.11, 39.22, 31.45, 27.38, 26.39, 22.53, 14.01; 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ: －62.62; HRMS (ESI) calcd for C28H31F3N3O2 (M＋H)＋ 498.2362, found 498.2365.
3.2.4 体外抗肿瘤活性实验
称量干燥纯品待测化合物, 用无菌二甲基亚砜(DMSO)充分溶解, 配制成浓度为100 mmol/L的储备母液; 涡旋振荡至固体完全溶解, 经0.22 μm有机滤头过滤除菌后, 避光分装, 于－20 ℃保存; 吸取100 mmol/ L的DMSO储备母液, 采用完全RPMI 1640培养液稀释浓度为100 μmol/L的中间稀释液; 取无菌EP管, 预先加入定量RPMI 1640培养液, 再加入定量的100 μmol/L中间稀释液, 涡旋充分混匀, 配制成梯度浓度为0.125、0.25、0.5、1、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L的待测液(所有梯度管中加入的DMSO总量完全一致, 严格控制给药后体系中DMSO的最终体积浓度≤0.1%, 避免溶剂本身产生细胞毒性干扰实验结果). 将细胞以1×104个/mL密度接种于96孔板, 置于37 ℃、CO2培养箱中培养24 h, 待细胞生长至对数生长期; 更换新鲜完全培养液, 后每孔加入100 μL不同浓度的灭菌待测样品, 继续培养48 h, 每组设置3个平行孔; 实验同时设置以溶剂作空白对照, 已知抗癌药顺铂作对照. 培养结束后, 每孔加入20 μL含MTT (5 mg/mL)的RPMI 1640培养液, 避光继续培养4 h; 去除上清液, 每孔加入100 μL DMSO充分溶解甲瓒结晶物; 在波长为490 nm下用酶标仪测定吸光度(OD值), 实验独立重复3 次, 取各组平均值计算细胞存活率, 并以细胞存活率对药物浓度的对数值作图, 得到每个样品的IC50值. 细胞存活率的计算公式如下:
细胞存活率(%)=(样品组平均OD值/对照组平均OD值)×100%
辅助材料(Supporting Information) 化合物5a~5e和6b~6z的1H NMR、13C NMR和19F NMR谱图. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.
(Zhao, C.)