药用植物内生菌广泛定植于植物根系表层, 能促进植物生长和次生代谢产物积累[1]. 其生长环境独特, 使得它们具有独特代谢途径, 往往能产生结构新颖的次生代谢产物, 并展现出良好生物活性[2-5]. 天山假狼毒(Stelleropsis tianschannica)为瑞香科假狼毒属多年生草本植物, 是传统维药, 具有逐水祛痰、破积杀虫之功效[6-7]. 化学研究表明该植物主要含有萜类、香豆素类、黄酮类、木酯素类、酚酸类以及挥发油类等成分[8-10], 药理学研究表明该植物具有抗肿瘤、抗氧化和抗菌等活性[11-14]. 目前, 天山假狼毒的研究集中在植株地上部分和根部, 尚未见关于该植物来源真菌的次生代谢产物及生物活性的研究报道. 本课题组前期对该药用植物的化学成分及抗菌活性进行了初步分析[14]. 作为天山假狼毒抗菌活性系统性研究的一部分, 本文从该植物的根部分离得到1株曲霉属真菌Aspergillus sp. L06, 并对其大米发酵产物进行分离纯化与结构鉴定, 共得到4个化合物(图1). 同时对所得化合物进行了体外抗菌活性筛选, 以期为抗菌药物开发提供参考.
1 结果与讨论
1.1 化合物的结构鉴定
新化合物1为淡黄色油状物. UV (MeOH) λmax [log ε/(L•mol–1•cm–1)]: 208 (3.78), 233 (3.80), 288 (3.46) nm; HR-ESI-MS calcd for C20H26O6Na [M+Na]+ 385.1627, found 385.1627, 推测其分子式为C20H26O6. 1H NMR谱图可以观察到3个甲基质子信号(δH 3.92、3.90、1.24), 其中2个是连氧甲基质子(δH 3.92, 3.90); 7个亚甲基质子信号(δH 4.11、2.63、2.32、1.75、1.64、1.43、1.43); 3个次甲基质子信号(δH 6.05、6.51、6.64). 对其13C NMR、DEPT和HSQC谱图进行分析, 可以确定化合物1中有20个碳, 其中包含1个甲基(δC 14.5), 2个甲氧基(δC 56.5, 56.5), 7个亚甲基(δC 25.8、27.6、29.6、29.7、34.3、35.0、61.4), 3个sp2次甲基(δC 94.0、97.2、111.3), 7个sp2季碳(δC 109.2、161.8、162.1、166.4、169.7、175.5、180.1). 将化合物1的1D NMR数据与文献报道化合物penitho- chromone F[15]相比较, 发现二者数据基本一致, 推测二者具有相同母核; 不同之处在于化合物1多了一个连氧亚甲基信号(δH 4.11, δC 61.4)和一个三重峰甲基信号(δH 1.24, δC 14.5), 同时少了一个甲氧基信号.
为了确定化合物1的平面结构, 对其2D NMR数据(图2)的进行分析. 1H-1H COSY谱图中存在两个自旋系统: H2-9/H2-10/H2-11/H2-12/H2-13/H2-14和H2-17/H3-18. HMBC谱图中H-13 (δH 1.64)、H-14 (δH 2.32)和H-17 (δH 4.11)均与C-15 (δC 175.5)相关, 可以推测出C-14 (δC 35.0)与C-17 (δC 61.4)通过酯键相连; H-8 (δH 6.51)与C-8a (δC 161.8), C-6 (δC 94.0), C-4a (δC 109.2)相关, H-6 (δH 6.64)与C-8 (δC 97.2)和C-4a (δC 109.2)相关, H-3 (δH 6.05)与C-4a (δC 109.2), C-4 (δC 180.1), C-2 (δC 169.7)相关, 由此可以推断化合物1为苯并γ-吡喃酮骨架. H2-9 (δH 2.63)与C-2 (δC 169.7)和C-3 (δC 111.3)的相关可以确定侧链与母核通过C-2相连. 此外, 甲氧基δH 3.90与δC 162.1相关可以推测其与苯环C-5相连, 甲氧基δH 3.92与δC 166.4相关可以推测其与苯环C-7相连. 综合以上数据, 可以确定化合物1与已知化合物peni- thochromone F的不同之处是, 15-酯羰基由甲氧基取代变成乙氧基取代. 再经Scifinder数据库检索, 确认化合物1为新化合物, 命名为aspeverchromone A.
表1 化合物1的 1H NMR (400 MHz)和13C NMR (100 MHz)数据(CD3OD)Table 1 1H NMR (400 MHz) and 13C NMR (100 MHz) data of compound 1 (CD3OD) |
| Position | δH (J in Hz) | δC |
|---|---|---|
| 1 | ||
| 2 | 169.7 | |
| 3 | 6.05 s | 111.3 |
| 4 | 180.1 | |
| 4a | 109.2 | |
| 5 | 162.1 | |
| 6 | 6.64 d (2.3) | 94.0 |
| 7 | 166.4 | |
| 8 | 6.51 d (2.3) | 97.2 |
| 8a | 161.8 | |
| 9 | 2.63 t (7.6) | 34.3 |
| 10 | 1.75 p (7.5) | 27.6 |
| 11 | 1.38~1.42 m | 29.6 |
| 12 | 1.43~1.45 m | 29.7 |
| 13 | 1.64 p (7.4) | 25.8 |
| 14 | 2.32 t (7.4) | 35.0 |
| 15 | 175.5 | |
| 16 | ||
| 17 | 4.11 q (7.1) | 61.4 |
| 18 | 1.24 t (7.1) | 14.5 |
| 5-OCH3 | 3.90 s | 56.5 |
| 7-OCH3 | 3.92 s | 56.5 |
1.2 化合物体外抗菌活性测试结果
致病菌耐药是一个全球性难题, 耐药菌相关疾病的发病率和死亡率在全球范围内呈持续上升趋势[16]. 在众多耐药菌中, 铜绿假单胞菌因突变快、耐药性强、致病/致死率高而被列入了世界卫生组织(WHO) 2018年发布的关键优先耐药病原体清单, 并且在2024年更新的文件中仍被视为高优先事项[17]. 目前, 抗菌药物的研发速度远跟不上致病菌的突变速度, 新型抗生素开发十分迫切. 本研究从1株曲霉属真菌Aspergillus sp. L06大米发酵产物中分离、鉴定得到4个化合物. 同时对所得化合物进行了体外抗4种临床常见耐药菌筛选, 抗菌活性结果表明, 化合物1具有较强抗多重耐药铜绿假单胞菌活性, 最低抑菌浓度(MIC)为4.0 μg/mL; 对多重耐药致病大肠杆菌有中等抑制作用, MIC为16.0 μg/mL, 对多重耐药金黄色葡萄球菌和鲍曼杆菌抑制活性较弱, MIC为32.0 μg/mL. 化合物2~4对4种临床致病菌的MIC>64.0 μg/mL, 无临床价值(表2).
表2 化合物1~4体外抗4种耐药菌活性(MIC, μg/mL)aTable 2 In vitro inhibitory activities of compounds 1~4 against four types of multi-drug resistant bacteria |
| Compound | MRSE | MDR-AB | MDR-EC | MDR-PA |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 32.0 | 32.0 | 16.0 | 4.0 |
| 2 | >64.0 | >64.0 | >64.0 | >64.0 |
| 3 | >64.0 | >64.0 | >64.0 | >64.0 |
| 4 | >64.0 | >64.0 | >64.0 | >64.0 |
| 庆大霉素 | 2.0 | 8.0 | 4.0 | 8.0 |
a MRSE (multidrug-resistant Staphylococcus aureus epidermidis), MDR-AB (multidrug-resistant Acinetobacter baumannii), MDR-EC (multidrug-resistant Escherichia coli), MDR-PA (multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa). |
2 结论
本研究从天山假狼毒根部分离得到一株曲霉属真菌Aspergillus sp. L06, 并对其大米发酵产物进行了化学成分研究. 从该真菌大米发酵物的乙酸乙酯提取物中分离得到4个化合物, 其中化合物1为一个新的苯并-γ-吡喃酮类衍生物. 抗菌活性结果表明, 化合物1具有较强抗多重耐药铜绿假单胞菌活性( MIC为4.0 μg/mL), 优于阳性对照药庆大霉素(MIC为8.0 μg/mL). 本研究结果丰富了天山假狼毒来源真菌化学成分多样性, 同时为抗多重耐药铜绿假单胞菌的药物研发提供了参考依据.
3 实验部分
3.1 仪器与试剂
Bruker Avance II 400 MHz NMR超导核磁共振仪(德国Bruker公司); 液相色谱-离子阱质谱联用仪(LC: Agilent 1200 Series, 美国Agilent公司; MS: Bruker mic- OTOF II and SolariX 7.0 spectrometer, 德国Bruker公司); 紫外分光光度计(UV-5200PC, 上海元析仪器有限公司); Ultimate 3000全波长阵列高效液相色谱仪(美国Dionex公司); ODS半制备色谱柱(5 μm, 10 mm×250 mm, 月旭科技上海股份有限公司); 超纯水仪(Heal Force Easy15, 力康生物医疗科技控股有限公司); 培养箱(上海一恒科学仪器有限公司); 恒温摇床(ZWY-240, 上海智城分析仪器制造有限公司). Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(美国GE Healthcare Bio-Sciences公司); 反相硅胶填料(日本YMC公司); 正相硅胶100~200目(青岛海洋化工有限公司); 马铃薯琼脂培养基(青岛海博生物技术有限公司); 胰酪大豆胨琼脂培养基(北京三药科技开发公司), LB肉汤培养基(青岛海博生物技术有限公司); 大米培养基来自市售普通大米; 庆大霉素(华中药业股份有限公司).
3.2 菌株材料
本研究所用真菌从天山假狼毒根部分离得到, 其16S rRNA序列由北京擎科生物科技股份有限公司进行测定. 测序结果与GenBank中注册号OQ832630.1的菌株Aspergillus sp. strain EF3相似度为99%, 鉴定为曲霉属真菌, 命名为Aspergillus sp. L06, 菌株样品保存于武汉市第四医院中心实验室. 临床常见4种致病菌分别为: 多重耐药表皮金黄色葡萄球菌(Multidrug-resistant Sta- phylococcus aureus epidermidis, MRSE)、多重耐药鲍曼不动杆菌(Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii, MDR-AB)、多重耐药大肠埃希菌(Multidrug-resistant Es- cherichia coli, MDR-EC)、多重耐药铜绿假单胞菌(Multi- drug-resistant Pseudomonas aeruginosa, MDR-PA), 来源于武汉市第四医院临床标本, 经武汉市第四医院检验科鉴定和药敏实验确定为多重耐药菌株, 实验期间暂存于武汉市第四医院中心实验室, 实验结束后高压灭菌处理.
3.3 真菌发酵、提取和分离
在超净工作台中, 将该曲霉接种到灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上, 培养7 d后, 将长满菌落的PDA培养基切割成小块, 并接种到高压灭菌的大米培养基中(每1 L锥形瓶中含250 g大米和200 mL纯化水, 共100瓶). 这些接种后的大米培养基将在室温下培养35 d. 发酵完成后, 用95%乙醇浸泡2次, 每次3 d, 合并提取液, 减压蒸馏除去乙醇, 再用乙酸乙酯萃取3次, 合并萃取层, 减压浓缩, 最终得到约100 g的总膏. 首先使用正相色谱柱对总膏进行梯度洗脱, 以V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=5∶1~0∶100, 得到5段馏分(Fr.1~Fr.5). Fr.2进一步经过凝胶色谱柱层析, 洗脱剂为甲醇, 分离得到3个组分(Fr.2.1~Fr.2.3). 从Fr.2.2中析出大量晶体, 对其进行重结晶, 得到化合物2 (25.0 mg). Fr.5通过凝胶色谱柱层析[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶1], 得到8个组分(Fr.5.1~Fr.5.8). 其中Fr.5.4经半制备色谱纯化[V(甲醇)∶V(水)=75∶25, 流速2.0 mL/min, 检测波长为210, 254, 280, 365 nm], 得到化合物1 (1.9 mg, tR=26.0 min). Fr.5.7经半制备色谱纯化[V(乙腈)∶V(水)=66∶34, 流速2.0 mL/min, 检测波长210, 254, 280, 365 nm], 得到化合物3 (10.1 mg, tR=31.0 min)和化合物4 (9.9 mg, tR=34.0min).
3.4 理化性质及波谱数据
Aspeverchromone A (1): 淡黄色油状物, UV (MeOH) λmax [log ε/(L•mol–1•cm–1)]: 208 (3.78), 233 (3.80), 288 (3.46) nm; 1H NMR (CD3OD)和13C NMR (CD3OD)见表1. HR-ESI-MS calcd for C20H26O6Na [M+Na]+ 385.1627, found 385.1627.
杂色曲霉素Sterigmatocystin (2): 无色块状晶体(CH3OH), m.p. 244.0 ℃, [α]25 D –187.5 (c 0.1, MeOH). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 13.22 (s, 1H, 8-OH), 7.49 (t, J=8.3 Hz, 1H, H-6), 6.82 (d, J=7.1 Hz, 1H, H-4'), 6.80 (dd, J=8.3, 1.0 Hz, 1H, H-5), 6.74 (dd, J=8.3, 1.0 Hz, 1H, H-7), 6.50 (t, J=2.4 Hz, 1H, H-3'), 6.42 (s, 1H, H-2), 5.44 (t, J=2.6 Hz, 1H, H-2'), 4.79 (dt, J=7.1, 2.2 Hz, 1H, H-1'), 3.98 (s, 3H, 1-OCH3); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 163.4 (C-1), 91.6 (C-2), 164.7 (C-3), 106.7 (C-4), 154.2 (C-4a), 106.0 (C-5), 135.8 (C-6), 111.4 (C-7), 162.4 (C-8), 109.1 (C-8a), 181.5 (C-9), 106.1 (C-9a), 155.1 (C-10a), 48.2 (C-1'), 102.6 (C-2'), 145.5 (C-3'), 113.4 (C-4'). HR-ESI-MS calcd for C18H12O6Na [M+Na]+ 347.0532, found 347.0535. 以上数据与文献[18]报道基本一致.
Nidurufin (3): 无定形粉末, m.p. 204.0~206.0 ℃, [α]25 D+130.9 (c 0.1, MeOH). 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ: 12.47 (brs, 1H, OH-1), 12.04 (brs, 1H, OH-8), 7.03 (s, 1H, H-5), 6.94 (s, 1H, H-4), 6.51 (s, 1H, H-7), 5.38 (s, 1H, OH-2'), 5.02 (brs, 1H, overlap, H-1'), 3.76 (brs, 1H, H-2'), 2.15~2.17 (m, 1H, H-3'a), 1.79~1.82 (m, 1H, H-3'b), 1.58~1.56 (m, 2H, H-4'), 1.54 (s, 3H, 6'-CH3); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 158.4 (C-1), 115.0 (C-2), 159.8 (C-3), 107.4 (C-4), 134.8 (C-4a), 109.0 (C-5), 165.5 (C-6), 108.1 (C-7), 164.3 (C-8), 108.5 (C-8a), 188.7 (C-9), 108.3 (C-9a), 180.8 (C-10), 133.3 (C-10a), 70.7 (C-1'), 65.3 (C-2'), 22.7 (C-3'), 30.2 (C-4'), 101.5 (C-5'), 27.2 (C-6'). HR-ESI-MS calcd for C20H14O8 [M–H]– 383.0767, found 383.0761. 以上数据与文献[19]报道基本一致.
Versicolorin B (4): 浅黄色油状物, [α]25 D–209.5 (c 0.1, MeOH). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.35 (brs, 1H, OH-1), 12.04 (brs, 1H, OH-8), 7.04 (d, J=2.4 Hz, 1H, H-5), 6.99 (s, 1H, H-4), 6.53 (d, J=2.4 Hz, 1H, H-7), 6.52 (d, J=5.9 Hz, 1H, H-4'), 4.12~4.13 (m, 1H, H-1'), 4.09~4.10 (m, 1H, H-3a'), 3.49~3.51 (m, 1H, overlap, H-3b'), 2.16~2.18 (m, 2H, H-2'); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 159.1 (C-1), 120.2 (C-2), 165.5 (C-3), 104.4 (C-4), 135.4 (C-4a), 109.1 (C-5), 165.5 (C-6), 108.1 (C-7), 164.3 (C-8), 108.4 (C-8a), 189.1 (C-9), 110.9 (C-9a), 181.0 (C-10), 134.8 (C-10a), 43.6 (C-1'), 30.3 (C-2'), 67.3 (C-3'), 113.4 (C-4'). HR-ESI-MS calcd for C18H11O7 [M–H]– 339.0505, found 339.0514. 以上数据与文献[20]报道基本一致.
3.5 体外抗菌活性测试
化合物体外抑菌活性按参考文献[21]中方法进行, 先将菌种复苏, 然后在TSA平板上纯化, 再挑取单菌落于LB培养基中培养至对数期, 置于4 ℃冰箱备用. 待测化合物和阳性对照庆大霉素均用生理盐水(含0.2% DMSO)溶解, 且初始浓度均设定为6.4 mg/mL. 采用二倍稀释法将化合物加入到96孔平板中, 浓度梯度分别为64.0, 32.0, 16.0, 8.0, 4.0, 2.0 μg/mL, 每组平行设置3次重复. 37 ℃培养12 h, 每隔2 h观察生长情况, 待阴性对照组孔中各菌株长满时, 抑菌实验结束, 最后一排澄清的组对应的测试样品浓度为该化合物的最小抑菌浓度.
辅助材料(Supporting Information) 新化合物1的1H NMR、13C NMR、HSQC、HMBC、1H-1H COSY、紫外和HR-ESI-MS谱图. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.
(Lu, Y.)